一种角叉菜多糖提取物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种角叉菜多糖提取物及其制备方法与应用 (Carrageenan extract and preparation method and application thereof ) 是由 孙云起 裴运林 刘涵 郭朝万 胡露 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种角叉菜多糖提取物及其制备方法与应用。所述角叉菜多糖提取物的制备方法包括冷冻干燥、回流脱脂、浓缩、离心、加溶剂去褐藻胶、乙醇沉淀等步骤,制备方法操作简单,且制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果显著,可应用于食品添加剂或药品添加剂领域。(The invention relates to a carrageenan extract and a preparation method and application thereof. The preparation method of the carrageenan extract comprises the steps of freeze drying, reflux degreasing, concentration, centrifugation, addition of a solvent to remove algin, ethanol precipitation and the like, the preparation method is simple to operate, and the prepared carrageenan extract has a remarkable antioxidant effect and can be applied to the field of food additives or medicine additives.)
技术领域
本发明属于多糖技术领域，涉及一种藻类多糖提取物及其制备方法与应用，尤其涉及一种角叉菜多糖提取物及其制备方法与应用。
背景技术
随着医疗技术的发展，研究人员发现肿瘤、炎症、衰老等的起因和发展与自由基和脂质过氧化作用密切相关，因此，寻找能够抑制自由基和脂质过氧化的物质越来越受到关注。特别地，寻找天然无毒的抗氧化剂已成为药品和食品添加剂的一个重要研究方向。随着人们对海洋藻类生物活性的关注，藻类提取物的研究已经得到很大进展，研究表明，海藻提取物具有显著的抗氧化活性，例如红藻类提取物不仅对AAPH诱导的脂质过氧化有一定的抑制作用，而且对DPPH具有很显著的抑制作用。
角叉菜是一种低脂肪、高蛋白的大型藻类，属红藻门杉藻科角叉菜属，是卡拉胶生产的重要藻类之一。角叉菜藻体内富含大量的活性物质，主要种类为海藻色素、脂肪酸、氨基酸、甾醇、多糖、维生素等，具有较好的生物活性。
多糖类物质是生物有机体中普遍存在的一类生物大分子物质，是细胞骨架以及多种内源性生物活性分子的重要组成部分。多糖可以游离形式或与蛋白质、脂质等组成缀合物的形式参与调节生物体的生理机能。多糖类物质广泛存在于植物中，研究表明，目前已经从植物中分离出近百种多糖，这些多糖没有细胞毒性，可应用于生物体中。
其中角叉菜多糖提取物具有抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒、抗病菌、降血糖、降血脂等作用，兼具抗氧化的潜质，可应用于食品、药品领域。现有技术中常用的角叉菜多糖的提取方法包括稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、热水浸渍法等。但由于试剂、温度等条件的不同，不同提取方法得到的角叉菜多糖提取物的化学成分有一定的差别，从而导致角叉菜多糖提取物的功效也有一定的区别。例如CN111743924A公开了一种治疗糖尿病的海洋植物提取物，其制备得到的角叉菜总多酚与/或角叉菜总多糖具有抑制糖尿病靶点α-葡萄糖苷酶的活性的功效。CN100513427C公开了一种角叉菜聚糖的制造和角叉菜聚糖产品，其制备得到的角叉菜聚糖溶液可以使微粒、胶体分散系和水/油乳剂増稠、悬浮、稳定，同时也协助给予食物产品适当口感。
目前现有技术中尚未公开一种操作简单，且制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化功效显著的角叉菜多糖提取物的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种角叉菜多糖提取物及其制备方法与应用，其制备方法操作简单，且制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化功效显著。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，所述角叉菜多糖提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)角叉菜经干燥、粉碎、过筛，得角叉菜藻粉；
(2)步骤(1)所得角叉菜藻粉经回流脱脂、烘干，得脱脂藻粉；
(3)步骤(2)所得脱脂藻粉经水浴处理，得第一混合液；
(4)步骤(3)所得第一混合液经离心、浓缩上清液、加溶剂去褐藻胶，得第二混合液；
(5)步骤(4)所得第二混合液经离心、浓缩上清液、加溶剂进行沉淀，得第三混合液；
(6)步骤(5)所得第三混合液经离心、收集沉淀，得角叉菜多糖提取物。
本发明提供的角叉菜多糖提取物的制备方法操作简单，且制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果显著，可应用于食品添加剂或药品添加剂领域。
优选地，步骤(1)所述干燥采用冷冻干燥方式，所述干燥的时间为20-30h，例如20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述过筛中筛的目数为40-80目，例如40目、45目、50目、55目、60目、65目、70目、75目、80目等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述回流中使用的溶剂包括乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、甲醇或石油醚中任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如乙醇和丙酮的组合、丙酮和乙酸乙酯的组合、乙酸乙酯和乙醚的组合、甲醇和石油醚的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述，优选乙醇、乙醚和乙酸乙酯的组合。
与其他溶剂相比，选择乙醇、乙醚和乙酸乙酯的组合作为溶剂对角叉菜藻粉进行回流脱脂，意外地具有进一步提高制备得到的角叉菜提取物的抗氧化能力的效果。
优选地，步骤(2)所述回流的次数为1-4次，例如1次、2次、3次、4次，每次回流的时间为3-12h，例如3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h、12h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述烘干在30℃-60℃下进行，例如30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、47℃、50℃、52℃、55℃、57℃、60℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述水浴处理在超声波辅助下进行，超声时间为40-80min，例如40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min等，该数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述水浴处理中液料比为30-70mL/g，例如30mL/g、35mL/g、40mL/g、45mL/g、50mL/g、55mL/g、60mL/g、65mL/g、70mL/g等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(3)所述水浴处理的温度为70-100℃，所述水浴处理的时间为3-7h。
上述70-100℃中的具体数值可以选择70℃、72℃、75℃、77℃、80℃、82℃、85℃、87℃、90℃、92℃、95℃、97℃、100℃等。
上述3-7h中的具体数值可以选择3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(4)所述离心在15-40℃下进行，所述离心的速度为3000-5000r/min，所述离心的时间为10-30min。
上述15-40℃中的具体数值可以选择15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。
上述3000-5000r/min中的具体数值可以选择3000r/min、3200r/min、3500r/min、3700r/min、4000r/min、4200r/min、4500r/min、4700r/min、5000r/min等。
上述10-30min中的具体数值可以选择10min、12min、15min、17min、20min、22min、25min、27min、30min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(4)所述浓缩的终点体积为1/6-1/4倍的上清液体积，例如1/6倍、1/5.8倍、1/5.5倍、1/5.2倍、1/5倍、1/4.8倍、1/4.5倍、1/4.2倍、1/4倍等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(4)所述溶剂为20％-50％乙醇，所述20％-50％为乙醇的体积分数，例如20％、22％、25％、27％、30％、32％、35％、37％、40％、42％、45％、47％、50％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选25％-35％乙醇。
与其他浓度的乙醇相比，选择25％-35％乙醇作为溶剂去除褐藻胶，其去除效果最好，进而能够进一步提高制备得到的角叉菜提取物的抗氧化能力。
优选地，步骤(4)所述加溶剂去褐藻胶在15-25℃下进行0.5-2h。
上述15-25℃中的具体数值可以选择15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃等。
上述0.5-2h中的具体数值可以选择0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(5)所述离心在15-40℃下进行，所述离心的速度为3000-5000r/min，所述离心的时间为10-30min。
上述15-40℃中的具体数值可以选择15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。
上述3000-5000r/min中的具体数值可以选择3000r/min、3200r/min、3500r/min、3700r/min、4000r/min、4200r/min、4500r/min、4700r/min、5000r/min等。
上述10-30min中的具体数值可以选择10min、12min、15min、17min、20min、22min、25min、27min、30min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(5)所述浓缩的终点体积为1/6-1/4倍的上清液体积，例如1/6倍、1/5.8倍、1/5.5倍、1/5.2倍、1/5倍、1/4.8倍、1/4.5倍、1/4.2倍、1/4倍等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(5)所述溶剂为80％-95％乙醇，所述80％-95％为乙醇的体积分数，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(5)所述溶剂的体积为3-5倍的浓缩后的上清液体积，步骤(5)所述沉淀在0-8℃下进行12-16h。
上述3-5倍中的具体数值范围可以选择3倍、3.2倍、3.4倍、3.6倍、3.8倍、4倍、4.2倍、4.4倍、4.6倍、4.8倍、5倍等。
上述0-8℃中的具体数值范围可以选择0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等。
上述12-16h中的具体数值范围可以选择12h、12.5h、13h、13.5h、14h、14.5h、15h、15.5h、16h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(6)所述离心在15-40℃下进行，所述离心的速度为3000-5000r/min；离心的时间为10-30min。
上述15-40℃中的具体数值可以选择15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。
上述3000-5000r/min中的具体数值可以选择3000r/min、3200r/min、3500r/min、3700r/min、4000r/min、4200r/min、4500r/min、4700r/min、5000r/min等。
上述10-30min中的具体数值可以选择10min、12min、15min、17min、20min、22min、25min、27min、30min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可任意选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(6)所述收集沉淀后还包括对沉淀进行洗涤，所述洗涤的试剂为无水乙醇。
优选地，所述洗涤的次数为1-3次，例如1次、2次、3次。
优选地，所述洗涤后还包括对沉淀进行干燥，所述干燥采用冷冻干燥方式，所述干燥的时间为0.5-1h，例如0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种角叉菜多糖提取物，所述角叉菜多糖提取物采用如第一方面所述的角叉菜多糖提取物的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的角叉菜多糖提取物在制备食品添加剂或药品添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的角叉菜多糖提取物的制备方法操作简单，且制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果显著，可应用于食品添加剂或药品添加剂领域。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述实施例、对比例所涉及的角叉菜产自青海高原，购自洛斯文特农资专卖店。
实施例1
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，所述角叉菜多糖提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)冷冻干燥角叉菜24h，粉碎，过60目筛，得角叉菜藻粉；
(2)步骤(1)所得角叉菜藻粉回流3次，每次回流的时间为4h，在40℃下烘干，得脱脂藻粉；
所述回流中使用的溶剂为95％乙醇，所述95％为乙醇的体积分数，所述溶剂与角叉菜藻粉的液料比为15mL/g；
(3)在100℃下水浴处理步骤(2)所得脱脂藻粉6h，得第一混合液；
所述水浴处理在超声波辅助下进行，超声功率为300w，超声时间为50min，所述水浴处理的液料比为50mL/g；
(4)步骤(3)所得第一混合液在25℃下以4000r/min的转速离心20min，浓缩上清液至1/5体积，在20℃下用30％乙醇处理1h，得第二混合液；
(5)步骤(4)所得第二混合液在20℃下以4000r/min的转速离心20min，浓缩上清液至1/5体积，在4℃下用4倍的浓缩后上清液体积的95％乙醇处理12h，得第三混合液；
(6)步骤(5)所得第三混合液在25℃下以4000r/min的转速离心20min，用无水乙醇洗涤沉淀3次，冷冻干燥0.5h，得角叉菜多糖提取物。
实施例2
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，所述角叉菜多糖提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)冷冻干燥角叉菜28h，粉碎，过70目筛，得角叉菜藻粉；
(2)步骤(1)所得角叉菜藻粉回流2次，每次回流的时间为6h，在55℃下烘干，得脱脂藻粉；
所述回流中使用的溶剂为无水甲醇，与角叉菜藻粉的液料比为15mL/g；
(3)在90℃下水浴处理步骤(2)所得脱脂藻粉5h，得第一混合液；
所述水浴处理在超声波辅助下进行，超声功率为300w，超声时间为60min，所述水浴处理的液料比为60mL/g；
(4)步骤(3)所得第一混合液在15℃下以4500r/min的转速离心15min，浓缩上清液至1/6体积，在20℃下用20％乙醇处理2h，得第二混合液；
(5)步骤(4)所得第二混合液在35℃下以3000r/min的转速离心30min，浓缩上清液至1/6体积，在0℃下用3倍的浓缩后上清液体积的90％乙醇处理14h，得第三混合液；
(6)步骤(5)所得第三混合液在15℃下以5000r/min的转速离心10min，用无水乙醇洗涤沉淀2次，冷冻干燥0.5h，得角叉菜多糖提取物。
实施例3
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，所述角叉菜多糖提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)冷冻干燥角叉菜21h，粉碎，过50目筛，得角叉菜藻粉；
(2)步骤(1)所得角叉菜藻粉回流1次，回流的时间为12h，在35℃下烘干，得脱脂藻粉；
所述回流中使用的溶剂为无水丙酮，与角叉菜藻粉的液料比为15mL/g；
(3)在80℃下水浴处理步骤(2)所得脱脂藻粉7h，得第一混合液；
所述水浴处理在超声波辅助下进行，超声功率为300w，超声时间为40min，所述水浴处理的液料比为70mL/g；
(4)步骤(3)所得第一混合液在30℃下以3500r/min的转速离心25min，浓缩上清液至1/4体积，在20℃下用50％乙醇处理0.5h，得第二混合液；
(5)步骤(4)所得第二混合液在15℃下以4500r/min的转速离心15min，浓缩上清液至1/4体积，在8℃下用5倍的浓缩后上清液体积的80％乙醇处理16h，得第三混合液；
(6)步骤(5)所得第三混合液在35℃下以3000r/min的转速离心30min，用无水乙醇洗涤沉淀2次，冷冻干燥0.5h，得角叉菜多糖提取物。
实施例4
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)所述回流中使用的溶剂“95％乙醇”替换为添加量相同的“无水乙醚”，其他条件参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)所述回流中使用的溶剂“95％乙醇”替换为添加量相同的“无水乙酸乙酯”，其他条件参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)所述回流中使用的溶剂“95％乙醇”替换为添加量相同的“95％乙醇和无水乙酸乙酯的组合”，其中95％乙醇与无水乙酸乙酯的体积比为1:1，其他条件参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)所述回流中使用的溶剂“95％乙醇”替换为添加量相同的“95％乙醇和无水乙醚的组合”，其中95％乙醇与无水乙醚的体积比为1:1，其他条件参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)所述回流中使用的溶剂“95％乙醇”替换为添加量相同的“无水乙酸乙酯和无水乙醚的组合”，其中无水乙酸乙酯与无水乙醚的体积比为1:1，其他条件参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)所述回流中使用的溶剂“95％乙醇”替换为添加量相同的“95％乙醇、无水乙酸乙酯和无水乙醚的组合”，其中95％乙醇、无水乙酸乙酯与无水乙醚的体积比为1:1:1，其他条件参照实施例1。
实施例10
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(4)所述溶剂“30％乙醇”替换为添加量相同的“20％乙醇”，其他条件参照实施例1。
实施例11
本实施例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(4)所述溶剂“30％乙醇”替换为添加量相同的“50％乙醇”，其他条件参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于省略步骤(2)中的回流脱脂操作，其他条件参照实施例1。
对比例2
本对比例提供一种角叉菜多糖提取物的制备方法，其与实施例1的区别仅在于省略步骤(4)中的加溶剂去褐藻胶操作，其他条件参照实施例1。
测试例1
对实施例1-11和对比例1和2制备得到的角叉菜多糖提取物的提取率进行评价。
采用苯酚硫酸法测定总糖含量，多糖在硫酸作用下，先水解为单糖，并迅速脱水生成糖醛酸衍生物，与苯酚反应生成橙黄色物质，该物质在490nm处有特征吸收，与标准系列比较定量。以葡萄糖为标准品，测试角叉菜多糖含量。
具体操作步骤如下；
(1)将1mg制备得到的角叉菜多糖提取物溶于1mL蒸馏水中，配置成待测液；
(2)将步骤(1)所得待测液全部转移至20mL具塞玻璃试管，用蒸馏水补至1mL，加入1mL苯酚(5％)；
(3)迅速加入5mL浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10min；
(4)使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于30℃水浴中反应20min，在490nm处测定吸光值。
按照下式计算样品中多糖含量：
其中：m1---多糖含量标准曲线上对应含糖量(ug)；
V1---样品定容体积(mL)；
m2---样品质量(g)；
V2---比色测定时所移取样品测定液体积(mL)；
0.9---葡萄糖与葡聚糖换算系数。
实施例1-11和对比例1和2制备得到的角叉菜多糖提取物的提取率比较结果见表1。
表1
组别
提取率
实施例1
3.53％
实施例2
3.19％
实施例3
3.24％
实施例4
2.89％
实施例5
2.98％
实施例6
3.63％
实施例7
3.66％
实施例8
3.65％
实施例9
3.83％
实施例10
3.05％
实施例11
3.01％
对比例1
1.03％
对比例2
1.15％
结果显示：实施例1-11制备得到的角叉菜多糖提取物的提取率较高，其中，实施例6-8制得的角叉菜多糖提取物提取率相较于实施例1稍高，实施例9制得的角叉菜多糖提取物的提取率最高，实施例10和11制得的角叉菜多糖提取物的提取率相较于实施例1稍低，对比例1和2制得的角叉菜多糖提取物的提取率较低。
对比例1和2制备得到的角叉菜多糖提取物的提取率较低。
测试例2
利用体外实验对实施例1-11和对比例1和2制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果进行评价。测试方法如下：
将角叉菜多糖提取物溶于无水乙醇中，配制成1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL、24mg/mL的一系列待测样品溶液。
(1)DPPH自由基的清除能力测试：
配制0.2mmol/L的DPPH溶液(溶剂为无水乙醇)；
样品测定A1：取100μL待测样品溶液与100μL DPPH溶液于96孔板中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值，记为A1；
样品空白A2：取100μL待测样品溶液与100μL无水乙醇于96孔板中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值，记为A2；
试剂空白A0：取100μL DPPH溶液与100μL无水乙醇于96孔板中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值，记为A0；
(2)ABTS自由基的清除能力测试：
配制5mmol/L ABTS储备液，用无水乙醇稀释，使稀释后的溶液在734nm处吸光值为0.7±0.02(30℃条件下)，得ABTS工作液。
样品测定A1：吸取190μL ABTS工作液，加入10μL待测样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值，记为A1；
样品空白A2：吸取190μL无水乙醇，加入10μL待测样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值，记为A2；
试剂空白A0：吸取190μL ABTS工作液，加入10μL无水乙醇，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值，记为A0；
(3)羟自由基的清除能力测试：
样品测定A1：在96孔板中加入60μL FeSO4溶液，60μL水杨酸溶液，最后加入60μLH2O2溶液启动反应，混匀后于37℃孵育15min；加入待测样品溶液20μL，37℃孵育15min，测定510nm处吸光值，记为A1；
样品空白A2：在96孔板中加入60μL FeSO4溶液，60μL水杨酸溶液，最后加入60μL蒸馏水，混匀后于37℃孵育15min；加入待测样品溶液20μL，37℃孵育15min，测定510nm处吸光值，记为A2；
试剂空白A0：在96孔板中加入60μL FeSO4溶液，60μL水杨酸溶液，最后加入60μLH2O2溶液启动反应，混匀后于37℃孵育15min；加蒸馏水20μL，37℃孵育15min，测定510nm处吸光值，记为A0；
以待测样品溶液的浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标，绘制变化曲线，以计算角叉菜多糖提取物清除自由基的IC50值。
测试结果见表2。
表2
结果显示：实施例1-11制得的角叉菜多糖提取物对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基均具有较强的清除能力，即具有显著的抗氧化效果。其中，实施例6-8制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果相较于实施例1稍好，实施例9制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果最好，实施例10和11制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果相较于实施例1稍差，对比例1和2制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果较差。
测试例3
利用基于秀丽线虫(以下简称线虫)模型的体内实验对实施例1-11和对比例1和2制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果进行评价。测试方法如下：
(1)线虫培养基、试剂配制：
①1M磷酸钾缓冲液
KH2PO4 108.39g
K2HPO4 35.69g
加水至1L，调pH值至6.0。
②M9缓冲液
加水至1L，121℃灭菌15min，宜现用现配。
③LB液体培养基
胰蛋白胨 10g/L
氯化钠 10g/L
酵母粉 5g/L
蒸馏水配制，用1M的氢氧化钠溶液调pH至7.0，121℃灭菌15min。
④线虫生长固体培养基(Nematode Growth Medium，NGM)1L
摇匀后，121℃灭菌30min，80℃恒温15min，加入灭菌后的下列溶液(其中胆固醇过滤除菌，其余溶液高温灭菌)。
⑤裂解液
用4mL蒸馏水溶解0.1g NaOH和1.3mL NaClO混合均匀(现配现用)。
(2)线虫基本操作方法
①大肠杆菌OP50的培养
取OP50的菌种于LB平板划线，挑取单菌落于10mL LB液体培养基中，37℃下，200rpm，振荡培养12h，至OD600等于0.4，用于接种NGM喂养正常组线虫。
②E.coli OP50的涂布
在每个NGM平板上加适量的菌液(一般直径60mm平板加100μL)，用无菌的涂布器或玻璃试管底部将菌液均匀地涂布在NGM平板上，注意菌液边缘应距离平板边缘0.5cm左右。涂布好细菌的NGM平板在室温(21-25℃)下过夜，置于冷室或4℃冰箱中待用。
③线虫同期化
用M9缓冲溶液将年轻成虫洗至无菌EP管中，加适量裂解液裂解线虫，置于低速离心机上3000rpm离心1min，弃上清，再用M9冲洗线虫2次，离心弃上清后用移液枪吸取EP管底部线虫滴于NGM的无菌区，约48h后裂解的线虫体内的受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同步化用于试验。
④线虫裂解
用1mL M9缓冲溶液将NGM平板上的年轻成虫反复冲洗两次再转移至无菌2mL离心管中，加入1mL现配的裂解液，充分振荡3-5min后，以3000rpm的转速离心1min，弃上清。再用1mL M9缓冲液冲洗线虫，并以同样条件离心2次，弃上清，余下0.3-0.4mL的含虫卵缓冲液。然后用移液枪轻轻吹打混匀虫卵，吸取100μL左右含虫卵的缓冲液滴于NGM平板上靠近OP50的无菌区域。约48h后线虫受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同期化。挑取L4期幼虫转移至药物板用于各项指标测定。
(3)含角叉菜多糖的NGM配制：
将1mg角叉菜多糖溶解在1mL无菌水中配制成母液，取98μL E.coli OP50菌液和2μL母液混合均匀。用移液枪吸取100-150μL混合后的菌液轻缓的打在每个NGM平板上中央。空白组吸取100-150μL E.coli OP50菌液均匀进行涂布。将涂布好细菌的NGM平板避光晾干后封膜，4℃保存备用。
(4)线虫体内活性氧的积累测试：
将空白组线虫和经角叉菜多糖处理96h后的试验组线虫转移到NGM板上以去除大肠杆菌。转移3次后，把线虫转移到含有50μL M9缓冲液的96孔荧光板上，每孔转移80条，每组设三个平行。同时加入50μL用M9缓冲液配制的100μM的H2DCF-DA溶液，用50μL不含线虫的H2DCF-DA溶液和50μL M9缓冲液作为空白对照。立即将96孔板放入酶标仪中测定荧光强度，反应温度25℃，发射波长528nm，激发波长485nm。每隔20min测定一次，反应6h，每次读数前震荡。由于线虫体内ROS的积累与荧光物质DCF的生成量成正比，因此，各组荧光强度可直接反映线虫体内ROS的积累量。
(5)线虫体内CAT活力测试：
分别从空白组线虫和经角叉菜多糖处理96h后的试验组线虫中各挑200条放入无菌水中冲洗，低速离心去上清液，反复三次后定容到0.5mL，在研磨仪中低温研磨1min。研磨后加入1％chap溶液定容至1mL，低温离心(4℃，12000r/min，15min)，收集上清液4℃放置待测。酶活的测定按照南京建成生物工程所BCA和CAT测试盒说明书要求进行操作。
测试结果见表3。
表3
结果显示：实施例1-11制得的角叉菜多糖提取物均能显著降低线虫体内活性氧的积累，同时显著增强线虫体内CAT活力，即具有显著的抗氧化效果。其中，实施例6-8制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果相较于实施例1稍好，实施例9制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果最好，实施例10和11制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果相较于实施例1稍差，对比例1和2制得的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果较差。
综上所述，本发明提供的角叉菜多糖提取物的制备方法操作简单，且制备得到的角叉菜多糖提取物的抗氧化效果显著，可应用于食品添加剂或药品添加剂领域。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的角叉菜多糖提取物及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
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