阅读说明：本技术 一种银杏叶改性双金属去除污水厂出水中抗生素抗性基因的方法 (Method for removing antibiotic resistance genes in effluent of sewage plant by using modified double metals of ginkgo leaves ) 是由 高景峰 段婉君 邬志龙 张文治 王雨薇 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：一种银杏叶改性双金属去除污水厂二级出水中抗生素抗性基因的方法,属于分子生物学领域。室温条件下,以银杏叶提取液作为分散剂与稳定剂,钴作为金属催化剂,通过化学还原法制备了表面修饰型和负载型银杏叶改性的铁钴双金属颗粒,用于抗生素抗性基因的去除。同时改变合成用量,提高银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除抗生素抗性基因能力(钴负载量为0～10％；银杏叶改性型铁钴双金属颗粒的投加浓度为0.84～1.68g/L)。本发明利用银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除抗生素抗性基因,方法简单快捷,绿色环保,能在短时间内达到去除抗生素抗性基因的目的,并极大的提高了改性铁的利用能力。(A method for removing antibiotic resistance genes in secondary effluent of a sewage plant by using modified bimetal ginkgo leaves belongs to the field of molecular biology. At room temperature, ginkgo leaf extract is used as a dispersant and a stabilizer, cobalt is used as a metal catalyst, and surface-modified and supported ginkgo leaf modified iron-cobalt bimetallic particles are prepared by a chemical reduction method and are used for removing antibiotic resistance genes. Meanwhile, the synthetic dosage is changed, and the capability of the ginkgo leaf modified iron-cobalt bimetallic particles for removing antibiotic resistance genes is improved (the cobalt loading is 0-10%; and the adding concentration of the ginkgo leaf modified iron-cobalt bimetallic particles is 0.84-1.68 g/L). The method for removing the antibiotic resistance genes by utilizing the ginkgo leaf modified iron-cobalt bimetallic particles is simple, rapid, green and environment-friendly, can achieve the purpose of removing the antibiotic resistance genes in a short time, and greatly improves the utilization capacity of the modified iron.)

一种银杏叶改性双金属去除污水厂出水中抗生素抗性基因的 方法

技术领域

本发明属于纳米材料，废水处理及分子生物学领域，具体涉及一种银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除污水厂二级出水中抗生素抗性基因的方法。

背景技术

抗生素耐药基因可以编码在细菌染色体或染色体外质粒中，从而触发抗生素抗性基因的生化防御机制。这种机制允许细菌在相应的抗生素化合物存在下生存，这可能严重损害抗生素的功效，对公众健康构成威胁。抗生素抗性基因被认为是一种新兴的环境污染物。此外，污水处理厂作为抗生素抗性向环境扩散的主要“热点”之一，也引起了人们的极大关注。同时，污水处理厂是抑制抗生素抗性基因传播的主要场所之一。因此，在全球范围内，控制污水处理厂中的抗生素抗性基因是应对耐药性的一个新挑战。

污水处理厂常用的消毒技术主要有氯化、紫外线处理、臭氧氧化。氯化消毒是一种灭活微生物的消毒方法。然而，氯可以形成各种消毒副产物，其毒性比母体化合物高。与氯化消毒相比，紫外线消毒不会产生消毒副产品。然而，GiovannaFerro等人分析了紫外/过氧化氢过程对抗生素抗性基因去除的潜能。结果表明，经240min处理后，bla TEM基因表达量增加到3.7×10³copies/mL，qnr S基因的去除率在初始样品(5.1×10⁴copies/mL)和最终样品(4.3×10⁴copies/mL)之间无明显变化。庄姚等人利用臭氧氧化消解污水处理厂二级出水磺胺类抗性基因sul 1和四环素类抗性基因tet G，发现这两类抗生素抗性基因的削减效果都随着臭氧剂量的增加而增加，当臭氧浓度从27mg/L增加至177.6mg/L时，两类抗生素抗性基因分别从0.5log和0.2log增加至3.2log和2.5log，因此要达到理想的去除效果，需要消耗大量的臭氧。总之，这些方法可能不足以成功去除抗生素抗性基因(细菌等在抗生素条件下产生的抗体基因)。因此，为了有效去除污水处理厂二级出水中的抗生素抗性基因，需要建立新的消毒灭菌方法。

5g/L的纳米零价铁在污泥的高温厌氧消化体系中能显著削减体系内四环素类抗性基因和int I1的丰度；将纳米零价铁投加到猪粪的厌氧消化体系后，抗生素抗性基因的削减量提高了33.3％。因此，纳米零价铁对抗生素抗性基因有一定的削减作用。然而关于纳米铁系金属对二级处理出水抗生素抗性基因丰度的影响的研究却鲜有报道。纳米铁系颗粒是以纳米零价铁为主要存在形式的颗粒，具体包括纳米零价铁为基础的双金属颗粒、经某种方法改性或负载的纳米零价铁以及铁系双金属颗粒。Robert W.Gillham等在1994年开创性地使用纳米零价铁处理氯代烃，这在全世界掀起了纳米铁系颗粒的研究热潮，研究者对纳米铁系颗粒修复环境中污染物的研究热度与脚步已持续二十余年，依旧没有放缓的迹象。尽管双金属颗粒能有效去除污染物，但是缺乏稳定性，这主要是由于双金属颗粒自身的高表面能和磁性，纳米级的颗粒极容易团聚成微米级或粒径更大的颗粒。颗粒的团聚使得颗粒的迁移性和比表面积降低，与污染物的接触面积变小，而且双金属颗粒也容易与水或氧气反应使得颗粒表面被钝化，进一步降低反应活性。改性型纳米铁系颗粒能在一定程度上抑制颗粒间的团聚以及颗粒表面的钝化，越来越多的稳定性颗粒被制备出来以替代非改性的纳米铁系金属颗粒。

银杏是地球上最古老的植物之一，主要成分含有多种黄酮(游离黄酮和黄酮苷)、萜内酯、酚酸和原花青素。银杏叶属于农林废弃物，农林废弃物是一种可再生、无污染、成本低廉的材料，且符合“以废治废”的理念。这类物质大多呈中性，覆盖在颗粒表面能提供空间位阻作用、抑制颗粒的团聚。高景峰等人研究发现，当目标污染物为活性艳蓝KN-R时，银杏叶改性型铁钴双金属颗粒可在5.5min以内完成对初始浓度为900mg/L活性艳蓝KN-R的完全去除。高景峰等人还进行了批次试验，研究对三氯生的去除；结果发现反应5min后，银杏叶改性型铁钴双金属颗粒比不改性的铁钴双金属对三氯生的去除效果提升72.4％。但银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对基因型污染物的削减能力还未得到研究。

针对以上问题，本发明提供了一种银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除污水厂二级出水中抗生素抗性基因的方法。该方法能够快速环保地去除二次出水中的抗生素抗性基因，减少抗生素抗性传播风险，有利于再生水的资源化利用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种银杏叶改性金属纳米颗粒去除污水厂二级出水中抗生素抗性基因的方法，包括如下步骤：

步骤一：将银杏叶改性的金属纳米颗粒先用丙酮清洗，然后用去离子水清洗三次；

步骤二：室温下，将所述银杏叶改性的金属纳米颗粒加入到污水处理厂二级出水中，搅拌或/和振荡不超过10min后，过滤分离，将整个体系水相经过滤完成对二级出水中抗生素抗性基因的去除。

其中，所述颗粒包括纳米零价铁颗粒、纳米铁钴颗粒、银杏叶改性的纳米零价铁颗粒和杏叶改性型铁钴双金属颗粒。

其中，金属纳米颗粒中钴的专利百分含量为0-10％。

其中，所述二级出水的初始pH值为5-9。

其中，所述二级出水的初始控制原水溶解氧为0.35-8.94mg/L。

其中，所述二级出水中银杏叶改性金属纳米颗粒浓度为0.84-1.68g/L。

其中，所述二级出水中抗生素抗性基因的初始浓度为2.21×10²-2.54×10⁸copies/mL。

银杏叶改性金属纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)用去离子水洗净银杏叶上的灰尘杂质，干燥优选在105℃干燥24h；

(2)将干燥的银杏叶粉碎，筛分，优选选取粒径在300μm以下的银杏叶粉末；

(3)将银杏叶粉末浸泡在无水甲醇里超声，优选按照20-60g/L的比例将银杏叶粉末浸泡在无水甲醇里，超声1h；

(4)将银杏叶粉末甲醇液过滤，滤液即为银杏叶提取液；经过0.45μm有机系滤膜真空抽滤；

(5)室温下，将银杏叶提取液与硫酸亚铁溶液混合，得到铁盐-银杏叶提取液混合液；优选在恒温水浴摇床里振荡5min，转速为210-250rpm，温度为25℃。

(6)室温下，将硼氢化钾溶液加入铁盐-银杏叶提取液混合液反应，得到银杏叶改性型纳米铁颗粒的悬浮液，边加边振荡，溶液立刻冒气泡，体系里生成黑色固体，硼氢化钾溶液加完后静置，直至体系不再冒气泡。

(7)将氯化钴溶液与银杏叶改性的纳米铁悬浮液混合反应，生成银杏叶改性型纳米铁钴双金属颗粒；置于恒温水浴摇床振荡20min，转速为210-250rpm，温度为25℃。

(8)磁选法分离出银杏叶改性型纳米铁钴双金属颗粒，用去离子水和丙酮洗涤，颗粒保存在丙酮中。

非改性型纳米铁钴双金属颗粒制备及保存方法与上述步骤类似，除了不引入银杏叶提取液。

本发明所述的超声功率为60-100W，温度为20-40℃。

本发明所述的银杏叶粉末与硫酸亚铁的质量比为0-1.4987，且不为0；硼氢化钾硫酸亚铁的质量比为0.3880-0.7761；银杏叶粉末与氯化钴的质量比为0-1990.8553，且不为0。

本发明的优势与有益效果是：

(1)本发明基于一种银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除污水厂二级出水中抗生素抗性基因的方法，能够对二次出水中抗生素抗性基因进行有效去除。

(2)利用银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除抗生素抗性基因，可以通过磁分离的方式回收金属颗粒，防止二次污染。

(3)整个工艺操作简单，方便快捷，具有深远的应用前景。

附图说明

图1为实施例1不同纳米颗粒去除污水厂二级出水中抗生素抗性基因的效果对比；

图2为实施例2在不同钴负载量下银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对污水厂二级出水中抗生素抗性基因的去除；

图3为实施例3在不同初始pH值下银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对污水厂二级出水中抗生素抗性基因的去除；

图4为实施例4在不同初始溶解氧值下银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对污水厂二级出水中抗生素抗性基因的去除；

图5为实施例5在不同银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加剂量下对污水厂二级出水中抗生素抗性基因的去除。

具体实施方案

下面结合

具体实施方式

进一步说明本发明，但本发明并不局限于实施例。

实施例1

25℃下，将200mL二级出水与1.12g/L颗粒(包括银杏叶改性型铁钴双金属颗粒，双金属颗粒中钴负载量为10％)混合于250mL具塞锥形瓶，置于磁力搅拌器上以转速250rpm搅拌处理。在特定反应时间后，分离过滤，将整个体系水相经过聚醚砜水系滤膜(孔径0.25μm，直径50mm)真空抽滤，完成对二次出水中抗生素抗性基因的去除。

为了验证银杏叶改性型铁钴双金属颗粒去除二次出水中抗生素抗性基因效果，设置三个对照实施例，25℃下，将200mL二沉池出水与1.12g/L纳米零价铁颗粒/纳米铁钴颗粒/银杏叶改性的纳米零价铁颗粒/银杏叶改性型铁钴双金属颗粒(钴负载量为10％)混合于250mL具塞锥形瓶，置于磁力搅拌器上以转速250rpm搅拌处理。在特定反应时间后，分离过滤，将整个体系水相经过聚醚砜水系滤膜(孔径0.25μm，直径50mm)真空抽滤，完成对二次出水中抗生素抗性基因的去除。

抗生素抗性基因在四种颗粒处理后丰度变化如图1所示。四种颗粒都能使原水中绝大多数抗生素抗性基因(acrA-02、bla TEM、erm B、mef A、mex B、qnr A、tetM)和整合子int I3以及转座子TP 614丰度降低至检测限以下，但银杏叶改性型铁钴双金属颗粒削减这些抗生素抗性基因至无法检出的程度所用反应时间可缩短30％。抗生素抗性基因去除效果遵循银杏叶改性型铁钴双金属颗粒>银杏叶改性的纳米零价铁颗粒>纳米铁钴颗粒>纳米零价铁颗粒的顺序。

实施例2

银杏叶提取液与20mL硫酸亚铁溶液(0.20M)以体积比1.5:1混合于200mL具塞锥形瓶，混合液经过振荡(250rpm，25℃，5min)后，逐滴向其中加入20mL硼氢化钾溶液(0.60M)，生成银杏叶改性的纳米零价铁颗粒。为了合成不同钴负载量的银杏叶改性型铁钴双金属颗粒，将20mL、浓度分别为0、0.0019、0.0038、0.0095、0.0190M氯化钴溶液与银杏叶改性的纳米零价铁颗粒混合，混合体系在恒温水浴摇床(250rpm，25℃)里振荡20min。

25℃下，将200mL二沉池出水与1.12g/L钴负载量分别为0％、1％、2％、5％、10％的银杏叶改性型铁钴双金属颗粒混合于250mL具塞锥形瓶，置于磁力搅拌器上以转速250rpm搅拌处理。在特定反应时间后，分离过滤，将整个体系水相经过聚醚砜水系滤膜(孔径0.25μm，直径50mm)真空抽滤，完成对二次出水中抗生素抗性基因的去除。

在不同钴负载量下银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对污水厂二级出水中抗生素抗性基因的去除如图2所示。银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对bla TEM、ere A、ermB、qnr A、sul 1等抗生素抗性基因的去除率随钴负载量的增加而增加。当钴负载量为10％时，处理10min后，原水中所有抗生素抗性基因甚至低于检测限。经不同钴负载量的银杏叶改性型铁钴双金属颗粒处理后，整合子int I1、int I3和转座子TP 614、tnpA-04的丰度削减幅度分别达3.98、3.92、3.87、3.65个数量级。银杏叶改性型铁钴双金属颗粒能有效抑制抗生素抗性基因的水平转移及传播扩散。blaTEM、ere A、int I1(clinic)、sul 1、tetM-01和tnpA-04基因在钴负载量为10％时低于检测线，而在其他负载量下均不能降低到检测线以下，抗生素抗性基因的削减现象最明显，所以钴负载量为10％效果最好。

实施例3

25℃下，分别将200mL初始pH值为5.00、7.33(原始)和9.00的二级出水与1.12g/L钴负载量为10％银杏叶改性型铁钴双金属颗粒混合于250mL具塞锥形瓶，置于磁力搅拌器上以转速250rpm搅拌处理。在特定反应时间后，分离过滤，将整个体系水相经过聚醚砜水系滤膜(孔径0.25μm，直径50mm)真空抽滤，完成对二次出水中抗生素抗性基因的去除。

在不同初始pH值下银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对抗生素抗性基因的去除如图3所示。原水中五种抗生素抗性基因(acrA-02、erm B、mef A、qnr A和tet M)的初始丰度分别为3.59×10⁴、9.93×10⁵、1.12×10⁴、9.49×10⁵和7.76×10⁵copies/mL，整合子int I3丰度为2.33×10⁴copies/mL，转座子tnpA-04和TP 614丰度分别为1.71×10⁴和9.41×10⁴copies/mL。在三种pH值下，反应10min后，原水中编码耐多药的抗生素抗性的外泵基因acrA-02、编码大环内酯类抗性的酶保护基因erm B、喹诺酮类抗性基因qnr A、和转座子TP614丰度都低于检测限。在中性条件下，除了以上四种基因，整合子int I1和int I3也被削减至低于检测限，无法进行抗生素抗性基因的水平转移扩散。即原始pH7.33下处理效果最好。

实施例4

25℃下，分别将200mL初始pH值为7.33的二级出水与1.12g/L钴负载量为10％银杏叶改性型铁钴双金属颗粒混合于250mL具塞锥形瓶，在溶解氧值为0.35(无氧，经纯度>99.9％的氮气连续吹脱10min)和8.94(有氧，不除溶解氧)mg/L条件下进行反应。在特定反应时间后，分离过滤，将整个体系水相经过聚醚砜水系滤膜(孔径0.25μm，直径50mm)真空抽滤，完成对二次出水中抗生素抗性基因的去除。

在不同初始溶解氧值下银杏叶改性型铁钴双金属颗粒对抗生素抗性基因的去除如图4所示。在有氧和无氧条件下，整合子int I3和转座子TP 614被银杏叶改性型铁钴双金属颗粒处理低于检测限，阻断了抗生素抗性基因水平转移扩散。但银杏叶改性型铁钴双金属颗粒在有氧和无氧条件下对int I1(clinic)、sul 1和tnpA-04基因的去除差异最明显，分别降到1160.19和217.78copies/mL、1418.84和661.66copies/mL、1840.97和545.00copies/mL。原水中抗生素抗性基因的去除率在无氧条件下比在有氧条件下更高。

实施例5

25℃下，将200mL初始pH值为7.33的二级出水分别与0.84、1.12、1.40和1.68g/L钴负载量为10％的银杏叶改性型铁钴双金属颗粒混合于250mL具塞锥形瓶，置于磁力搅拌器上以转速250rpm搅拌处理。在特定反应时间后，分离过滤，将整个体系水相经过聚醚砜水系滤膜(孔径0.25μm，直径50mm)真空抽滤，完成对二次出水中抗生素抗性基因的去除。

银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加剂量对抗生素抗性基因的去除如图5所示。当银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加剂量分别为0.84、1.12、1.40和1.68g/L时，包括acrA-02、mef A、qnr A在内的抗生素抗性基因以及包括int I3和TP 614的移动遗传元件的丰度被削减至检测限以下，ere A、erm B、tet M在三种银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加剂量下(不为1.12g/L)也被削减至检测限以下，且银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加量在1.12g/L时sul 1残留的丰度最高，银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加量在1.40g/L时blaTEM残留丰度最高，过高的银杏叶改性型铁钴双金属颗粒投加浓度反而不利于抗生素抗性基因的去除。