柯萨奇病毒a10型毒株及其应用
阅读说明：本技术 柯萨奇病毒a10型毒株及其应用 (Coxsackie virus A10 type strain and application thereof ) 是由 张改梅 李国顺 朱凤才 樊欢 嵇红 赵丽丽 谢学超 马廷涛 陈磊 肖海峰 顾美荣 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体公开了柯萨奇病毒A10型毒株及其应用。本发明的柯萨奇病毒A10型毒株,其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该毒株交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强,为建立稳定的感染动物模型提供了攻击毒株,并可作为柯萨奇病毒A10型免疫血清的中和抗体效价测定的检测毒株,为柯萨奇病毒A10型相关单/多价疫苗研发提供了技术支持。(The invention relates to the technical field of biology, and particularly discloses a coxsackievirus A10 type strain and application thereof. The amino acid sequence of the P1 structural protein of the coxsackie virus A10 strain is shown in SEQ ID NO. 1. The strain has good cross neutralization capability, stable heredity and strong toxicity, provides an attack strain for establishing a stable infection animal model, can be used as a detection strain for measuring the titer of a neutralizing antibody of coxsackie virus A10 type immune serum, and provides technical support for research and development of a coxsackie virus A10 type related single/multi-valent vaccine.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及柯萨奇病毒A10型毒株及其应用。
背景技术
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），多发生于5岁以下儿童，表现口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前缺乏有效治疗药物对症治疗。
近年来，随着EV-A71疫苗的推广，CV-A6和CV-A10导致的发病率逐年上升，近几年的流行病学调查中，柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10, CV-A10)在零星病例或手足口病暴发中的检出率逐渐升高。近几年的流行病学调查表明CV-A10已成为近年来手足口病流行的主要病原之一，这对手足口病的预防和控制提出了挑战。
已上市的EV-A71疫苗对CV-A10无交叉保护作用。中和抗体检测是开展CV-A10流行病学调查和疫苗免疫原性评价的关键指标之一。中和抗体效价检测的准确性与使用的检测毒株密切相关。在2008-2012年主要是亚基因型C1局限于少数地区流行，但2010年以后C2逐渐取代C1成为主要的亚基因型（Ji T, Guo Y, Huang W, Shi Y, Xu Y, Tong W, Yao W,Tan Z, Zeng H, Ma J, Zhao H, Han T, Zhang Y, Yan D, Yang Q, Zhu S, Zhang Y,Xu W. The emerging sub-genotype C2 of CoxsackievirusA10 Associated with Hand,Foot and Mouth Disease extensively circulating in mainland of China. Sci Rep.2018 Sep 6;8(1):13357.）。建立符合目前疾病流行特征的基因型标准检测毒株，固定检测用毒株代次，提高疫苗中和抗体检测的准确性、重复性，对保障疫苗临床前和临床试验的免疫原性评价具有重要意义。目前，国内外尚未有柯萨奇病毒A10型标准检测毒株，亟需企业自行筛选并建立标准检测毒株。
此外，Li Shuxuan等发表了关于CV-A10疫苗和抗体评价的乳鼠模型（Li Shuxuan,Zhao Huan, Yang Lisheng, et al. A neonatal mouse model of coxsackievirus A10infection for anti-viral evaluation[J]. Antiviral Research. 2017,144:247-255.）。CV-A10感染1日龄的BalB/c（近交系）、C57BL/6（近交系）、KM（远交系）、ICR（远交系）四种不同品系乳鼠，通过腹腔注射，每只100μl，每只乳鼠约注射105TCID50，观察20天。7天内100%死亡。近交系BalB/c遗传背景清晰，且遗传更稳定，故而以1日龄BalB/c乳鼠作为动物模型，腹腔注射100μl，观察20天，LD50为5.78TCID50/只。由于小鼠对临床分离获得的毒株易感性普遍较差，只有个别临床分离病毒能够使小鼠感染，多数均为鼠适应突变病毒株。因此在目前国内外尚未有柯萨奇病毒A10型相关检测标准毒株和用于疫苗保护性评价用攻击毒株的情况下，更加有必要提供一种新的柯萨奇病毒A10型毒株，以满足现有技术发展的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一株交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强的柯萨奇病毒A10型毒株及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供一种柯萨奇病毒A10型毒株，其P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
在所述柯萨奇病毒A10型毒株基因组中，以上所述的P1结构蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
具体地，本发明提供的柯萨奇病毒A10型毒株含有P1结构蛋白以及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D；其中，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-10所示。
本发明提供的柯萨奇病毒A10型毒株的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO.4-10所示的非结构蛋白。
优选地，所述柯萨奇病毒A10型毒株的基因组中，P1结构蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ IDNO.11-17所示。
以上所述的结构蛋白和非结构蛋白的编码基因在所述柯萨奇病毒A10型毒株的基因组上的排列顺序为VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。VP1、VP2、VP3和VP4组成结构蛋白P1。
本发明提供由如SEQ ID NO.2所示的基因以及如SEQ ID NO.11-17所示的基因顺次连接组成的重组核酸分子。
进一步优选地，所述柯萨奇病毒A10型毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示。所述SEQ ID NO.3中的1-746bp为5’UTR的核酸序列，747-953bp为VP4的核酸序列，954-1718bp为VP2的核酸序列，1719-2438bp为VP3的核酸序列，2439-3332bp为VP1的核酸序列，3333-3782bp为2A的核酸序列，3783-4079bp为2B的核酸序列，4080-5066bp为2C的核酸序列，5067-5324bp为3A的核酸序列，5325-5390bp为3B的核酸序列，5391-5939bp为3C的核酸序列，5940-7325bp为3D的核酸序列，7326-7328bp为终止密码子，7329-7407bp为3’UTR的核酸序列。
具体地，本发明提供柯萨奇病毒A10型毒株R06030451，该毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCC No.19533。
柯萨奇病毒A10型毒株R06030451的基因组编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白以及序列如SEQ ID NO.4-10所示的非结构蛋白，其基因组序列如SEQ ID NO.3所示，亚型为C2型。
本发明提供的上述柯萨奇病毒A10型毒株具有较强的毒力，在基因型内和基因型间具有较好的交叉中和能力，免疫原性好，能够以RD等细胞作为基质细胞进行快速繁殖。
进一步地，本发明提供与所述柯萨奇病毒A10型相关的生物材料，其为以下（1）-（8）中的任意一种：
（1）序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白；
（2）编码序列如SEQ ID NO.1所示的P1结构蛋白的核酸分子；
（3）序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.3所示序列的互补序列所示的核酸分子；
（4）含有（2）或（3）中所述核酸分子的表达盒；
（5）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组载体；
（6）含有（2）或（3）中所述核酸分子的重组微生物；
（7）含有（2）或（3）中所述核酸分子的细胞系；
（8）检测（2）或（3）中所述核酸分子的引物或探针。
以上（2）或（3）中所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。
以上（4）中所述的表达盒为在（2）或（3）中所述的核酸分子的上游、下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。
以上（5）中所述的重组载体为携带（2）或（3）中所述的核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。
以上（6）中所述的重组微生物可为细菌或病毒。
以上（7）中所述的细胞系为动物细胞系，所述动物细胞系为不可繁殖为动物个体的动物细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞系，包括但不限于RD、Vero、MRC-5等其他细胞。
以上（8）中所述的引物、探针为能够与（2）或（3）中所述核酸分子结合并进行PCR扩增的寡核苷酸。
本发明还提供所述柯萨奇病毒A10型毒株的病毒样颗粒，其含有P1结构蛋白以及选自非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D中的任意一种或多种；所述P1结构蛋白具有如SEQID NO.1所示的序列，所述非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D分别具有如SEQ ID NO.4-10所示的序列。
以上所述的病毒样颗粒可采用昆虫载体系统表达上述结构蛋白、非结构蛋白的编码基因。
本发明还提供含有以上所述的柯萨奇病毒A10型毒株、生物材料或病毒样颗粒的免疫原性组合物。
所述免疫原性组合物中除含有所述柯萨奇病毒A10型毒株、生物材料或病毒样颗粒外，还可含有有利于柯萨奇病毒A10型毒株发挥免疫原性的佐剂。所述佐剂包括但不限于铝佐剂。
进一步地，本发明提供柯萨奇病毒A10型毒株或所述的生物材料或所述病毒样颗粒的如下任意一种应用：
（1）在柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；
（2）在柯萨奇病毒的免疫血清中和抗体含量检测中的应用；
（3）在柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；
（4）在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；
（5）在预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物的筛选或药效评价中的应用；
（6）在制备诊断柯萨奇病毒感染的试剂或试剂盒中的应用；
（7）在柯萨奇病毒的流行病学调查中的应用；
（8）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的疫苗中的应用；
（9）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的药物中的应用；
（10）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗体中的应用；
（11）在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒引起疾病的抗血清中的应用。
以上（1）中，所述应用具体为作为疫苗免疫原性评价的标准检测毒株。
以上（3）中，所述应用具体为作为用于疫苗保护性评价的攻击毒株。
以上（4）中，所述动物模型优选为鼠模型。
以上（1）-（11）中，所述柯萨奇病毒优选为柯萨奇病毒A10型毒株。
以上（5）和（8）-（11）中，所述柯萨奇病毒引起疾病优选为手足口病。
本发明提供一种抗体或抗血清，其为以所述柯萨奇病毒A10型毒株或所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原制备得到。
本发明还提供一种抗体或抗血清的制备方法，该方法包括：以所述柯萨奇病毒A10型毒株、所述生物材料或所述病毒样颗粒为免疫原免疫动物，经分离获得抗柯萨奇病毒A10型的抗体或抗血清。
本发明提供一种产品，其含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：
（1）上述柯萨奇病毒A10型毒株；
（2）上述生物材料；
（3）上述病毒样颗粒；
（4）上述柯萨奇病毒A10型毒株的抗体或抗血清。
以上所述的产品优选为用于柯萨奇病毒A10型疫苗免疫原性或保护性评价的产品，或者为用于柯萨奇病毒A10型感染动物模型构建的产品，或者为用于诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染的产品。
所述产品可为试剂、试剂盒、疫苗或药物。
作为本发明的一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A10型疫苗免疫原性或保护性评价的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株。
作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于柯萨奇病毒A10型感染动物模型构建的试剂，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株。
作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于预防柯萨奇病毒A10型感染的疫苗，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株。
本发明所述的疫苗可为全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）。
优选地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗，其中所述柯萨奇病毒A10型毒株被灭活。所述疫苗还可含有佐剂，所述佐剂包括但不限于铝佐剂。
本发明还提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述柯萨奇病毒A10型毒株在细胞上培养，收获病毒液，将收获的病毒液经灭活、纯化后获得疫苗原液，将所述疫苗原液与佐剂混合。
作为本发明的另一种实施方式，所述产品为用于治疗柯萨奇病毒A10型感染的药物，其含有所述柯萨奇病毒A10型毒株的抗体或抗血清。
本发明还提供以上所述的产品在柯萨奇病毒A10型疫苗的免疫原性评价或保护性评价、制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用。
本发明还提供以上所述的产品在诊断、预防或治疗柯萨奇病毒A10型感染中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明通过病毒分离、筛选、蚀斑纯化和动物攻毒实验，筛选到的毒株同时具备了交叉中和能力好、遗传稳定、毒力强的属性。该毒株的强毒力为建立稳定的感染动物模型提供了攻击毒株。
该毒株在基因型内和型间交叉性良好，可作为柯萨奇病毒A10型免疫血清的中和抗体效价测定的检测毒株，为柯萨奇病毒A10型相关单/多价疫苗研发提供支持。
该毒株免疫原性好、滴度高，腹腔注射102CCID50病毒液可使1日龄乳鼠6天内100%死亡。表明该毒株是一株强毒力的毒株。对小鼠具有高致病和致死能力的强毒株对于构建CV-A10小鼠模型至关重要。
附图说明
图1为本发明实施例1中毒株的型内交叉中和研究结果。
图2为本发明实施例5中攻击毒株筛选-存活曲线。
图3为本发明实施例5中LD50确定-存活曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明的基本研究方法为：
（1）对已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A10型阳性的咽肛试子样本，在RD细胞上进行分离，并经过3次传代适应性培养，对收获的病毒液进行初步的鉴定，主要包括病毒滴定、抗原含量测定、分子生物学鉴定（病毒确定，核酸序列测定分析亚型）、免疫原性试验、及交叉中和能力的研究、基因组测序等，初步获得合适的中和抗体检测毒株和攻击毒株（初筛毒株）。
（2）初筛毒株分别进行3次蚀斑纯化，在RD细胞上进行3次传代适应性培养（P4代），对收获的病毒液进行检定，病毒液检定主要包括病毒滴定。根据病毒检定结果结合病毒病变进程、病变融合度，建立原始种子，并进行相关评价研究和传代稳定性研究。评价研究主要包括病毒滴定、免疫原性研究、致病性研究及交叉中和能力的研究等。传代稳定性研究主要是将病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定、基因测序检测（基因组测序分析）。根据以上研究结果选择交叉保护范围广、遗传稳定性好、滴度高的毒株一株作为中和抗体检测毒株；遗传稳定性好、致病性强的毒株一株作为疫苗保护性评价的攻击毒株。
（3）中和抗体检测候选毒株确立后，对其进行病毒滴定。然后对其进行滴度标定及专属性评价。确定该检测毒株的标示滴度，从而确定中和试验时检测滴度株的稀释倍数。专属性评价旨在验证该检测毒株只对CV-A10型免疫血清有特异性中和能力，而对其他肠道病毒如EV-A71、CV-A6及CV-A16免疫血清无交叉反应。从而证明该毒株适用于柯萨奇病毒A10型免疫血清的中和抗体效价的检测。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 柯萨奇病毒A10型毒株的初步筛选
临床样本的处理：
在生物安全柜中将每一份样品（已经过荧光定量PCR检测为柯萨奇病毒A10型阳性的咽肛试子样本）取0.25 ml加入离心管中。加入2.5μl青链霉素溶液，混匀，4 ℃放置过夜。2000 rpm 离心20 min，上清存于2~8℃以备接种。
病毒分离培养：
取准备好的长至80-90%密度的健康无污染的RD细胞，弃去细胞培养液。将处理好的样品0.2ml/孔接种于6孔板内，每一份样品接种1孔，同时加入0.2 ml/孔病毒培养液，置35℃ 5%CO2培养箱中吸附1h。之后每孔补加3.5ml病毒培养液，置35℃ 5%CO2培养箱中静置培养。设置2孔生长状态良好且未接种标本的细胞作为细胞对照。
病毒收获及适应性传代培养：
每天观察并记录接种后细胞特征性肠道病毒致细胞病变效应（CPE）情况。如果出现CPE且CPE程度达+++以上时，冻融一次，收获细胞培养物，用0.2μm针头滤器过滤，0.2ml/支分装病毒液，于-60℃冰箱保存，取病毒液继续传代三次，每代冻融一次，2000 rpm 4℃离心10 min，上清分装，于-60℃冰箱保存，做好标记和记录。如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传三代，继续观察。
病毒鉴定：
对获得的病毒分离阳性株的第3代病毒液进行病毒鉴定试验，主要包括病毒滴定、分子生物学鉴定（病毒鉴定及病毒基因型分型）及免疫原性试验、交叉中和能力的研究、基因组测序等。
病毒滴定：
（1）检测方法：将经三次传代的病毒液用无血清的培养液在离心管中10倍梯度稀释，从10-1~10-8。将稀释好的病毒加入96孔培养板，8孔/稀释度，0.1ml/孔。同时每孔加入100μl RD细胞悬液（1.5×105个/ml）。再另外取8~16孔加入细胞悬液，0.1ml/孔，补加稀释液0.1ml/孔，作为细胞对照。加盖封板，轻轻拍打混匀，置于35℃，5% CO2培养箱中静置培养，第7天判断结果。每个样品进行3次重复。
（2）病毒滴度计算：按Behrens-Karber公式计算LgCCID50。
LgCCID50 = L-d (S-0.5)，其中：
L = 实验中使用的病毒的最低稀释度的对数值；
d = 稀释梯度的对数值；
S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。
具体参见中华人民共和国卫生部．手足口病预防控制指南(2009版)．[EB/OL]．(2009-06-04) http://www.gov.cn/gzdt/2009-06/04/content_1332078.htm。
分子生物学鉴定：
采用RT-PCR法鉴定CV-A10病毒，将CV-A10阳性的病毒株进行VP1核酸序列测定，并根据VP1核苷酸序列进行CV-A10基因型分型。
RT-PCR法鉴定CV-A10病毒：
提取病毒核酸，应用EV组肠道病毒核酸检测通用引物及CV-A10核酸检测引物进行CV-A10病毒鉴定。
（1）扩增引物设计如下：
A、人肠道病毒核酸检测通用引物序列（产物长度400-500bp）
59F: 5’-CYTTGTGCGCCTGTTTT-3’（SEQ ID NO.18）；
588R: 5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’（SEQ ID NO.19）；
153F: 5’-CAAGYACTTCTGTMWCCCC-3’（SEQ ID NO.20）；
541R: 5’-CCCAAAGTAGTCGGTTCC-3’（SEQ ID NO.21）。
以上引物中，Y代表C/T，M代表A/C，W代表A/T。
B、CV-A10 核酸检测引物序列（产物长度 1kb）
CA10-VP1- WHF: 5’- GGTATCAAACCAATTACGTGGTCC -3’（SEQ ID NO.22）；
CA10-VP1- WHR: 5’-AACAAGCAGGTCTCGAGAAC-3’（SEQ ID NO.23）。
（2）病毒核酸提取：
按照说明书中顺序和用量向96孔板添加试剂和病毒样品，然后置于核酸提取仪中，按照预设的程序抽提核酸；将提取好的核酸分装至EP管中，标记样品信息和日期，保存至-60℃冰箱。
（3）PCR扩增：
1）HEV- 5’UTR通用引物PCR扩增
a. 第一轮PCR扩增：
配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表1），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表2）。
表1 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增反应体系
表2 HEV-5’UTR通用引物第一轮PCR扩增程序
b. 第二轮PCR扩增：
配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表3），然后加入0.4μl第一轮PCR扩增产物为模板，放入PCR仪运行程序（见表4）。
表3 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增反应体系
表4 HEV-5’UTR通用引物第二轮PCR扩增程序
2）CV-A10 VP1特异性引物PCR扩增
配制除扩增模板成分以外的PCR扩增反应体系（配方见表5），然后加入0.4μl供试品病毒基因组并混匀，放入PCR仪运行程序（见表6）。
表5 VP1特异性引物PCR扩增反应体系
表6 VP1特异性引物PCR扩增程序
3）用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
4）结果判断
HEV-5’UTR通用引物扩增阳性样本应能观察到大小为400bp的目的条带，VP1特异性引物扩增阳性样本应能观察到大小为1kb的目的条带。标本的实验室诊断结果根据表7进行判断。其中，HEV（－）代表HEV- 5’UTR通用引物未扩增出目的条带，HEV（＋）代表HEV- 5’UTR通用引物扩增出目的条带；CV-A10（－）代表CV-A10 VP1特异性引物未扩增出目的条带，CV-A10（＋）代表CV-A10 VP1特异性引物扩增出目的条带。
表7
CV-A10基因型分型：
将鉴定为CV-A10阳性的病毒株进行VP1核酸序列扩增及序列测定，根据VP1核酸序列进行CV-A10基因型分型。结果显示均为C2型。
免疫原性研究：
挑选滴度高的毒株，应用NIH小鼠进行免疫原性分析。
将20株第三代病毒液制备成相同病毒滴度（7.0LgCCID50/ml），免疫NIH小鼠（SPF级，18-22g，雌性），各毒株组10只，分别编号。按照0、14天两针免疫程序，分别腹腔注射灭活病毒500 μl/只，同时设置培养基对照组，分别于一免、二免后14天采血，分离血清。采用微量细胞病变法测定血清抗特异性中和抗体效价，分析阳转率及中和抗体水平。
中和抗体效价测定步骤：将待测血清按1:8稀释，经56 ℃灭活30 min，加至96孔板中，0.05ml/孔，作2倍系列稀释后，分别与100CCID50的CV-A10病毒悬液于37℃中和1~3h；加入1.5×105个/ml的RD细胞悬液，0.1ml/孔，置35±0.5℃，5% CO2培养箱中培养7d。将能抑制50%细胞病变的最高稀释度定为CV-A10抗体的中和效价，并以稀释倍数的倒数表示。每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32~320 CCID50/孔时试验判为成立。以中和效价≥8判为CV-A10中和抗体阳性，阴性样品的几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）均按4计算。
试验结果显示，一免阳转率即可达到80%以上，二免阳转率均可达到100%，一免中和抗体效价在1:19~1:273之间，二免中和抗体效价在1:247~1:7476之间，其中，R603的中和抗体效价可达1:7476，表明为优势毒株。
交叉中和能力研究：
将毒株与毒株免疫血清进行交叉中和能力研究，以毒株对全部待测血清的中和抗体效价倍数差反映交叉中和能力。倍数差低代表该毒株具有较均一的交叉中和检测能力，筛选中和抗体GMT高且倍数差较低的毒株，作为检测候选毒株。
a. 型内交叉中和研究：
挑选上述筛选到的免疫原性和滴度基因序列综合评价较好的属同一基因亚型的8株初筛毒株（R603、R210、R629、R601、R579、R620、R624、R617）进行型内交叉中和研究（以8株毒株和对应的8份免疫血清进行交叉中和反应），免疫血清为2次免疫小鼠14天后采集的血清（具体步骤参见上述血清抗特异性中和抗体效价的测定）。以毒株对全部血清的中和抗体效价GMT和倍数差（MAX/MIN）反映交叉中和能力。结果见图1和表8，编号为R603的初筛毒株检测各免疫血清的中和抗体效价GMT为1:2111，倍数差为8。
表8
b. 型间交叉中和研究：
以包括1株A基因型（Kowalik, Genbank no: AY421767）、17株C2基因型株（2014-2019年中国大陆分离获得的毒株）在内的18个CV-A10毒株进行型间交叉中和研究（委托中国食品药品检定研究院进行，毒株及其对应的免疫血清均来自中国食品药品检定研究院），将全部毒株以1 ml分别在0、2 w免疫大鼠，3 w采血分离血清，将全部血清分别与18株CV-A10病毒株进行交叉中和检测。本试验中上述型内交叉中和的5个毒株（R603/R210/R629/R601/R579）参与其中，结果显示，5个毒株检测血清中和抗体效价GMT的倍数差均在384~2304之间，其中R603倍数差为384。表明该毒株对现有的柯萨奇病毒A和C基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。
实施例2 蚀斑纯化
将初筛毒株的病毒稀释液接种进行第一次蚀斑纯化。
（1）细胞准备：取已长成单层的RD细胞经洗涤、消化后接种于6孔细胞培养板中，7×105个细胞/孔，补加细胞培养液（RD细胞）至 4 ml，置5% CO2 培养箱中37±1℃静置培养48小时至长成致密单层。弃去原培养液，用无血清的维持液（MEM培养液）清洗细胞表面，洗去残留的牛血清与死细胞。
（2）病毒准备：将病毒液进行适当倍数的稀释。
（3）病毒吸附：将稀释好的病毒液进行接种，0.4ml/孔，同时设置病毒液对照和细胞对照，置 5% CO2 培养箱中35℃吸附1~2小时，期间每隔15~20min轻轻晃动细胞板数次，使其接触整个细胞表面。
（4）覆盖与培养：吸附完毕后，弃去病毒液，病毒对照和细胞对照，加入病毒维持液3ml/孔。其余各孔沿壁缓慢加入琼脂糖和病毒维持液混合物，每孔3ml，室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层，把加入琼脂糖的培养板倒置于5% CO2培养箱内37±1℃培养，细胞对照和液体病毒对照培养板正置培养，每天观察并记录，蚀斑情况（形态、大小及数量）及病毒对照病变情况。
（5）蚀斑培养：将单个蚀斑，用200μl带滤芯的枪头挑取至含有100μl病毒维持液的1.5ml EP管中，反复吹打混匀，接种至细胞已长至单层的6孔细胞培养板中，置5% CO2培养箱中37±1℃培养，每天观察CPE。待细胞出现CPE达75%时，收集上清液，于-60℃冰箱中保存。此时病毒代次为P2代。
（6）鉴定及分析：将P2代病毒进行病毒滴度检测。
（7）选择滴度较高的毒株进行第二次和第三次蚀斑纯化，操作同上。
实施例3 检测候选毒株的确定
将经三次蚀斑纯化的毒株扩增至第5代建立原始种子，并对其进行相关检定研究以及传代稳定性研究，根据传代稳定性研究结果选择交叉保护范围广、遗传稳定性好、滴度高的毒株作为检测候选毒株。如未特别说明，检测方法同实施例1。
原始种子毒株的检定研究主要包括免疫原性、病毒滴定、基因组测序分析、交叉中和能力研究。
传代稳定性研究主要是将原始种子病毒液按一定比例在RD细胞上进行连续传代培养至第15代，对传代过程中每代毒株进行病毒滴定、基因组序列分析。
毒株检定研究结果显示编号为R06030451的毒株的免疫原性良好（一免后血清阳转率即可达到100%，二免后血清阳转率为100%，二免后中和抗体效价GMT值为1:1691），滴度为8.04LgCCID50/ml，基因组序列与初筛毒株R603一致。型内交叉中和研究结果（见表9）显示该毒株检测免疫血清中和抗体的GMT值为1:913（1:431~1:913），倍数差为8，表明该毒株具有较好的交叉中和检测能力。其中，毒株R06170333、R06030151、R06010343、R02100543为将实施例1中的初筛毒株R617、R603、R601、R210进行多次蚀斑纯化获得的原始种子。
表9 型内交叉中和能力研究结果
型间交叉中和结果显示，编号为R06030451的毒株的血清对全部毒株的中和抗体效价倍数差最小，与实施例1中检测的初筛毒株R603毒株相当，表明编号为R06030451的毒株对现有的柯萨奇病毒A、C基因型具有较为均一的交叉中和检测能力。
传代稳定性研究表明编号为R06030451的毒株连续传15代，滴度趋势稳定（7.92~8.58 LgCCID50/ml之间），基因组序列一致。表明该毒株遗传稳定性好。
上述编号为R06030451的毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A10型，保藏编号为CGMCC No.19533。
R06030451毒株的基因组序列如SEQ ID NO.3所示，P1蛋白的编码基因序列如SEQID NO.2所示，P1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-10所示，非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的编码基因序列分别如SEQ ID NO.11-17所示。
实施例4 检测毒株滴度标定和专属性评价
由3名实验员，分别独立进行9次滴度测定，结果表明滴度均值为7.903LgCCID50/ml（95%CI：7.868-7.937），符合正态分布。专属性研究表明与同为肠道病毒的柯萨奇病毒A16血清（毒株保藏编号为CGMCC No.19534，该毒株名称为R00880662，该毒株已于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A16型）、肠道病毒71型血清和柯萨奇病毒A6血清（毒株保藏编号为CGMCC No.19532，该毒株名称为R01170631，该毒株已于2021年7月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为柯萨奇病毒A6型）均无交叉中和现象，研究方法参见实施例1中的型内交叉中和研究方法。
实施例5 致病性研究
根据实施例1中的免疫原性结果，选择最优的2个毒株进行致病性初步研究，根据结果挑选致病性最强的毒株进行LD50研究。
初步研究将取冻存的2个毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液稀释至105CCID50/0.05ml，分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个毒株1窝（5-10只），另设含2%FBS的病毒维持液为对照组。记录实际小鼠数量。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况。结果显示同样的攻毒剂量，编号R06030451的毒株攻毒后第3天使乳鼠100%死亡，另外一个毒株R06010343攻毒后第6天使乳鼠100%死亡，见图2。表明编号R06030451的毒株具有更强的毒力。因此选择该毒株作为攻击毒株，进行LD50研究。
取冻存的R06030451毒株迅速融化，用含2%FBS的病毒维持液做10倍系列稀释，至103、102、101、100、10-1CCID50/0.05ml五个浓度。将每个稀释度病毒液分别腹腔接种1日龄Balb/C乳鼠，每只50μl，每个稀释度1窝（5-10只），另设含2%FBS的病毒维持液为对照组。第四天观察对照组有无非特异性死亡，并记录实际小鼠数量。连续观察21天，记录小鼠发病和死亡情况，按照Reed-Muench法计算病毒的累计死亡率和LD50值。
对照组21天存活率100%，试验成立。结果显示102 CCID50/只攻毒组的乳鼠6天全部死亡，而10 CCID50/只攻毒组的乳鼠13天全部死亡，而1 CCID50/只攻毒组的死亡率为33.3%。按Reed-muench法计算，以稀释度为标准，LD50为2.5×10-7；以滴度为标准，LD50为8.47CCID50/ml，存活曲线见图3。表明该毒株为致病力强的毒株，可以用于柯萨奇病毒A10相关疫苗保护性评价。
实施例6 灭活疫苗的制备
取实施例3建立的柯萨奇病毒A10型毒株R06030451原始种子，在Vero细胞上进行适应性传代，传5代，收获病毒液，按实施例2进行3次蚀斑纯化后，继续传4代，经鉴定合格的病毒液收获。采用细胞工厂或者生物反应器在Vero细胞上进行扩大培养，按MOI=0.0005接种病毒，待病变达75%以上收获病毒液。将收获的病毒液经离心或过滤后，采用甲醛1:4000灭活3天（或者β-丙内酯1:4000于5±3℃灭活1天），37℃水解2小时。将灭活液进行超滤浓缩、层析纯化，纯化液经除菌过滤后获得疫苗原液（灭活也可在病毒纯化后进行）。
将上述疫苗原液与氢氧化铝佐剂按适宜比例吸附后，制备成灭活疫苗。疫苗蛋白浓度为20μg/ml，铝浓度0.8mg/ml。
实施例7 灭活疫苗的免疫原性
将实施例6中配制的灭活疫苗进行小鼠免疫试验。其中，小鼠的免疫方法如下：将NIH小鼠（SPF级，18-22g，雌性）随机分成2组，每组小鼠10只，按0、14天的免疫程序进行腹腔免疫，0.5ml/只，于第14、28天进行采血，同时将病毒维持液作为对照组。采集的血清进行中和抗体检测，具体方法见实施例1。结果显示，1免后14天，疫苗组血清效价100%阳转，中和抗体水平GTMs 可达1:641；二免后14天，中和抗体水平GTMs 可达1:3447；对照组阳转率为0%，GTMs＜1：8，表明使用柯萨奇病毒A10型毒株R06030451制备的灭活疫苗具有很好的免疫效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京民海生物科技有限公司
<120> 柯萨奇病毒A10型毒株及其应用
<130> KHP211120539.4YS
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 862
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr
20 25 30
Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln
35 40 45
Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Arg Glu Leu
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro
100 105 110
Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser
115 120 125
Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser
130 135 140
Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val
145 150 155 160
Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys
165 170 175
Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu
180 185 190
Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Pro Asn Lys Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly
210 215 220
Thr Thr Gly Ala Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val
225 230 235 240
Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg
245 250 255
Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro
260 265 270
Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro
275 280 285
Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile
290 295 300
Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln
305 310 315 320
Ala Val Ser Gln Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln
325 330 335
Phe Leu Thr Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe
340 345 350
Thr Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu
355 360 365
Glu Leu Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu
370 375 380
Ala Thr Gly Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys
385 390 395 400
Ala Asp Glu Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly
405 410 415
Pro Trp Gln Ser Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln
420 425 430
Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met
435 440 445
Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln
450 455 460
Pro Ala Asn Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp
465 470 475 480
Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn
485 490 495
Thr His Phe Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr
500 505 510
Ala Gly Val Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro
515 520 525
Glu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp
530 535 540
Asn Phe Thr Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln
545 550 555 560
Ala Val Leu Gln Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu
565 570 575
Gly Asn Thr Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Val Thr Asn Val Glu Ser
580 585 590
Ala Ala Asn Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val
595 600 605
Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp
610 615 620
Glu Asn Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu
625 630 635 640
Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val
645 650 655
Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp
660 665 670
Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met
675 680 685
Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr
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Glu Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro
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Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr
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Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln
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Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr
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Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr
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Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val
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Val Ser Arg Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met
805 810 815
Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln
820 825 830
Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Val Thr
835 840 845
Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met
850 855 860
<210> 2
<211> 2586
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggagctc aagtctcgac gcaaaaatcc ggcagtcatg agactggtaa tgtagccact 60
ggaggatcta caataaactt cactaacatc aactattata aagattctta cgccgcgtca 120
gctacccggc aagacttcac acaagatccg aagaaattca cacaaccagt gttagactct 180
attagagaac tatcaggccc tttgaactct ccttctgtgg aagcttgtgg ttatagtgat 240
agggtcgccc agctcactgt tgggaactcc tccattacta cccaagaggc tgctaatatc 300
gtattagctt atggagagtg gcctgagtac tgccctgaca cagacgcaac tgccgtggat 360
aaaccaactc gcccggacgt gtctgtcaac aggttctaca ctttggactc caaaatgtgg 420
caagaaaatt cgactggttg gtattggaag ttccctgacg tgctgaacaa aacgggtgtg 480
ttcggacaga atgcccaatt tcattacttg taccggtcgg gtttctgctt gcatgtacag 540
tgtaatgcta gtaagtttca ccagggggcc cttcttgtgg ctgtgatacc agaatttgtg 600
atcgctggca gagggtctaa cacaaaacca aataaagcgc cccacccagg gtttaccaca 660
actttccctg gcaccaccgg tgctacattc catgacccat acgttctgga ttccggggta 720
ccattgagtc aggctctaat atacccccat cagtggatca atctccgcac taacaactgt 780
gcaactgtta tagttccata catcaatgct gttccgtttg actcagccat caaccatagc 840
aattttgggc taatagtgat accagttagc ccgctgaagt attcgtccgg ggcaactact 900
gcaatcccaa tcactatcac tatagccccc ctgaattcag agtttggagg actgcgacaa 960
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gatgatgaca ctgcagcgcc catcctccca ggattcaccc ccacacccac aattcacata 1080
ccaggggaag tacactcttt gctggagttg tgtagggtgg agactatttt ggaagtgaac 1140
aacaccacag aagcaacagg attaacaagg ctcttaatac cagtgtcctc gcagaacaaa 1200
gccgatgagt tgtgtgctgc gtttatggtt gatccaggcc gaattggacc ttggcaatct 1260
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tttatgttca caggatcttt tatggcaaca ggcaagatgc tggtggccta ctccccgccc 1380
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cagaccaatt acgtggtccc gccagaaacc cctggagagg catatattat tgcaatgggg 1620
gcggcacaag acaacttcac tttgaagatc tgcaaggata ctgatgaagt gacacaacaa 1680
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cgtagagcta ttagcagtgt tacaaatgtt gaatccgcgg ccaacaccac tcccagttca 1800
caccgactag agactggacg cgtaccagcg ctacaggctg cagagacggg tgccacttct 1860
aatgccacag atgagaacat gattgagacc cgttgtgtgg ttaacagaaa tggggtgttg 1920
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gatgggggga cggacaccac tgggtatgct acatgggaca tagacattat gggttttgtc 2040
caactccgca gaaaatgcga gatgttcaca tacatgaggt tcaacgcaga attcacattt 2100
gtcacaacga cagagaatgg agaggctcgt ccgtacatgc tacaatatat gtatgtgccc 2160
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<210> 3
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<212> DNA
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<400> 3
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ccactttcgg ccagcacccg gagacctcaa acacaacata cggattgtgc ccaaacaata 3120
tgatgggcac atttgcagtg agagttgtta gtagagaggc aagtcaacta aaactacaga 3180
ctagagtgta catgaagctt aagcatgtga gggcctgggt cccaagaccg atcaggtctc 3240
agccatacct gctcaaaaac ttccccaatt acgacagtag caaggttacc aacagtgcac 3300
gggaccgttc cagtatcaag caagctaata tgggtaaatt tgggcaacaa tctggcgcca 3360
tctacgttgg taactacaga gtggtcaata ggcacctggc cacccacaat gactgggcca 3420
acctggtgtg ggaagacagt tctcgagacc tgcttgtttc gtctaccacc gcccagggtt 3480
gcgatacgat tgcccgttgt gagtgtcaga caggggtgta ctattgtaac tcaaggagga 3540
aacattaccc agtcagtttc tctaaaccta gcctcgtctt cgtagaggcc agtgagtatt 3600
accctgctag atatcaatct cacctaatgc tcgctgcagg ccactctgaa cctggggatt 3660
gcgggggtat attgaggtgt cagcatggtg tggttggcat agtgtccact ggaggcaacg 3720
gtcttgtcgg ttttgctaac gtgagggacc tcttatggtt ggatgaagaa gccatggaac 3780
agggagtatc tgactatatc aagggactcg gcgacgcctt tggtactggc tttactgatg 3840
cagtgtctag ggaagtggag gccctgaaaa attacctgat tggttccgag ggagcggtgg 3900
agaagatcct gaagaacttg gtgaaactca tatcagctct ggtcatagtt atcagaagtg 3960
actacgacat ggtcaccctt accgcaactc tagctctgat tgggtgtcac gggagcccat 4020
gggcgtggat caaagcaaag acggcgtcca tcttaggtat tcctatggca cagaagcaga 4080
gtgcatcttg gcttaagaag ttcagtgata tggcgaacgc tgcaaaggga ttagagtgga 4140
tctccaacaa aatcagcaaa tttattgatt ggctcaagga aaagatcatt ccagccgcaa 4200
aggaaaaagt cgagtttctt aataacctca agcaactgcc cttgatggaa aaccaaattg 4260
ctaacttaga acagtccgct gcttcacaag aagaccttga agtcatgttt ggtaatgtgt 4320
catacctagc acacttttgt cgcaagttcc agccactcta tgcaactgaa gcgaagagag 4380
tgtacgcctt agagaagaga atgaataatt acatgcagtt caagagcaaa caccgtattg 4440
aacctgtatg tttgattatc aggggctcac caggaactgg caagtcactt gccacaggta 4500
taatagcaag agccattgct gacaaatatc actctagtgt gtactccctt ccaccagacc 4560
cagatcactt tgatggatac aagcaacaag tggtgacagt catggatgat ctgtgccaaa 4620
acccagatgg caaagatatg tcattgtttt gtcaaatggt atccactgtc gattttatac 4680
ccccaatggc ttcactggaa gaaaaaggtg tatccttcac atctaaattt gttattgctt 4740
caactaatgc tagcaacatc attgtcccca cggtctcaga ctctgacgct atccgtagga 4800
gatttttcat ggattgtgat atcgaagtga ctgactctta taagacagac ttaggccgct 4860
tagatgcagg tagggccgca aagctctgct cagagaataa cactgccaat ttcaagaggt 4920
gcagcccgct agtgtgcggt aaagccatcc aactgagaga taggaagtcc aaagtcaggt 4980
atagcgtaga cactgtggta tcagaattag ttagggagta tagcaacagg tctgctatag 5040
ggaacactat agaagcttta ttccaagggc ctcctaaatt caggcctgta agaattagtc 5100
ttgatgagaa acccgctcca gatgccatta gtgacctgct tgctagtgtt gatagtgaag 5160
aggtgcggca gtactgcaga gatcaaggat ggataatacc tgaaacgcca accaacgtgg 5220
agcggcatct caatagggca gtactagtga tgcaatccat cgctactgta gtcgcagttg 5280
tgtcccttgt ttatgttatc tacaagctat ttgctggttt ccaaggcgca tattctggag 5340
cgcccaggca agctctcaag aaacctgtgt tgaggacagc cactgttcaa gggcccagct 5400
tagattttgc cctgtccctc ctacgacgta acgtcaggca ggtgcaaacc gaccaagggc 5460
actttaccat gcttggggta cgtgaccacc ttgctatctt acctcgtcac tcgcaaccag 5520
ggaagaccat ctgggttgaa cacaagttgg tcaatgtgct tgatgctgtt gagctagtgg 5580
atgaacaagg tgttaatttg gagctcacac tagtaaccct agataccaat gagaagttta 5640
gagatgtcac caagttcatt ccagagaata tcagtggagt cagtgatgcc acattaataa 5700
tcaacactga acacatgcca tcaatgtttg tcccggtagg agatgttgtt caatatgggt 5760
tcctaaatct tagtggtaaa ccaacccaca ggaccatgat gtacaatttc cctacaaagg 5820
ctggacagtg tggaggcgtg gtaacatctg tcggtaaaat cattggcatc cacattggag 5880
gcaacgggcg tcaagggttt tgcgctggcc tgaagaggag ttactttgca agtgagcaag 5940
gtgaaatcca atgggtgaaa cctaacaagg agaccggcag attaaatatc aatggtccaa 6000
cacgcaccaa gttagagccc agtgtgttcc atgatctgtt tgagggcaac aaggagccag 6060
cagtcctaac aagcaaggat cccagattag aggttgactt tgagcaggct ctcttctcca 6120
agtatgtggg taatgtcctc cacgaacctg atgaatatgt gaagcaggca gccctccact 6180
acgcaaatca gctcaagcaa ctggatataa acaccaataa gatgagcatg gaggaagcgt 6240
gctatggcac agagaacctg gaagcaattg acctccatac tagcgcgggg tacccataca 6300
gtgctttggg cataaagaag agggacatac tagatcctac cactaaggac ataacaaaaa 6360
tgaagtttta catggataag tatggcttgg atttacctta ctccacctac gttaaagatg 6420
aacttaggcc tctggacaag atcaagaaag ggaagtcccg cttaatagaa gctagcagcc 6480
tgaatgattc agtgtacctc agaatgactt ttggccacct gtatgaagca ttccatgcaa 6540
acccagggac tgtgaccgga tcagcagttg ggtgcaatcc ggatgtgttc tggagtaaac 6600
tcccaatcct actcccaggc tcgctatttg cctttgacta ttcaggctat gatgctagtc 6660
ttagccccgt ctggtttagg gctttggaga tggtcttacg ggacatcggc tattcagagg 6720
aagcagtgtc actcatagaa ggaataaatc acacccatca tgtgtatcgg aataaaacat 6780
attgtgttct tggcgggatg ccgtcaggat gttctggtac ttccattttc aactcgatga 6840
tcaacaacat catcattagg acgcttttaa tcaaaacctt taaagggata gatctggacg 6900
agttgaatat ggtggcctat ggagatgatg tgctggctag ttatcctttc cctattgatt 6960
gtcttgagtt agctaagact ggcaaggagt atgggctgac catgacacct gcggacaaat 7020
caccttgctt caatgaagtg acgtgggaaa atgccacctt tctgaagaga gggtttctac 7080
cagatcatca attcccattc ttgattcatc ccacaatgcc catgaaagaa attcacgaat 7140
ctatacgctg gactaaagat gcgtgcaata cccaagacca tgtgcgctct ctgtgtttat 7200
tagcttggca caatggtaag gatgaatatg aaaaatttgt gagcacaatt agatcagtcc 7260
cagttgggag agcattggca attccgaatt ttgagaattt gagaagaaat tggctcgaac 7320
tattttagat ttacagttga aagctggacc ccgccagaaa tctggtcgtg ttaatgactg 7380
gtgggggtaa atttgttata cccagag 7407
<210> 4
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Lys Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg
1 5 10 15
Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val
20 25 30
Trp Glu Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln
35 40 45
Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Glu Cys Gln Thr Gly Val Tyr Tyr
50 55 60
Cys Asn Ser Arg Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Ser Lys Pro Ser
65 70 75 80
Leu Val Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser
85 90 95
His Leu Met Leu Ala Ala Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly
100 105 110
Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly
115 120 125
Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asn Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp
130 135 140
Glu Glu Ala Met Glu Gln
145 150
<210> 5
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Val Ser Asp Tyr Ile Lys Gly Leu Gly Asp Ala Phe Gly Thr Gly
1 5 10 15
Phe Thr Asp Ala Val Ser Arg Glu Val Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Leu
20 25 30
Ile Gly Ser Glu Gly Ala Val Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Val Lys
35 40 45
Leu Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Ser Asp Tyr Asp Met Val
50 55 60
Thr Leu Thr Ala Thr Leu Ala Leu Ile Gly Cys His Gly Ser Pro Trp
65 70 75 80
Ala Trp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ile Leu Gly Ile Pro Met Ala
85 90 95
Gln Lys Gln
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Ala Ser Trp Leu Lys Lys Phe Ser Asp Met Ala Asn Ala Ala Lys
1 5 10 15
Gly Leu Glu Trp Ile Ser Asn Lys Ile Ser Lys Phe Ile Asp Trp Leu
20 25 30
Lys Glu Lys Ile Ile Pro Ala Ala Lys Glu Lys Val Glu Phe Leu Asn
35 40 45
Asn Leu Lys Gln Leu Pro Leu Met Glu Asn Gln Ile Ala Asn Leu Glu
50 55 60
Gln Ser Ala Ala Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Met Phe Gly Asn Val
65 70 75 80
Ser Tyr Leu Ala His Phe Cys Arg Lys Phe Gln Pro Leu Tyr Ala Thr
85 90 95
Glu Ala Lys Arg Val Tyr Ala Leu Glu Lys Arg Met Asn Asn Tyr Met
100 105 110
Gln Phe Lys Ser Lys His Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu Ile Ile Arg
115 120 125
Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg
130 135 140
Ala Ile Ala Asp Lys Tyr His Ser Ser Val Tyr Ser Leu Pro Pro Asp
145 150 155 160
Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln Val Val Thr Val Met Asp
165 170 175
Asp Leu Cys Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Met Ser Leu Phe Cys Gln
180 185 190
Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu
195 200 205
Lys Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe Val Ile Ala Ser Thr Asn Ala
210 215 220
Ser Asn Ile Ile Val Pro Thr Val Ser Asp Ser Asp Ala Ile Arg Arg
225 230 235 240
Arg Phe Phe Met Asp Cys Asp Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Thr
245 250 255
Asp Leu Gly Arg Leu Asp Ala Gly Arg Ala Ala Lys Leu Cys Ser Glu
260 265 270
Asn Asn Thr Ala Asn Phe Lys Arg Cys Ser Pro Leu Val Cys Gly Lys
275 280 285
Ala Ile Gln Leu Arg Asp Arg Lys Ser Lys Val Arg Tyr Ser Val Asp
290 295 300
Thr Val Val Ser Glu Leu Val Arg Glu Tyr Ser Asn Arg Ser Ala Ile
305 310 315 320
Gly Asn Thr Ile Glu Ala Leu Phe Gln
325
<210> 7
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Pro Pro Lys Phe Arg Pro Val Arg Ile Ser Leu Asp Glu Lys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Asp Ala Ile Ser Asp Leu Leu Ala Ser Val Asp Ser Glu Glu
20 25 30
Val Arg Gln Tyr Cys Arg Asp Gln Gly Trp Ile Ile Pro Glu Thr Pro
35 40 45
Thr Asn Val Glu Arg His Leu Asn Arg Ala Val Leu Val Met Gln Ser
50 55 60
Ile Ala Thr Val Val Ala Val Val Ser Leu Val Tyr Val Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Leu Phe Ala Gly Phe Gln
85
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Ala Tyr Ser Gly Ala Pro Arg Gln Ala Leu Lys Lys Pro Val Leu
1 5 10 15
Arg Thr Ala Thr Val Gln
20
<210> 9
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Val Arg
1 5 10 15
Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp
20 25 30
His Leu Ala Ile Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp
35 40 45
Val Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp
50 55 60
Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp Thr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Arg Asp Val Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Gly
85 90 95
Val Ser Asp Ala Thr Leu Ile Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met
100 105 110
Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser
115 120 125
Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala
130 135 140
Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly Ile
145 150 155 160
His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg
165 170 175
Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln
180
<210> 10
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn
1 5 10 15
Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp
20 25 30
Leu Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro Ala Val Leu Thr Ser Lys Asp Pro
35 40 45
Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly
50 55 60
Asn Val Leu His Glu Pro Asp Glu Tyr Val Lys Gln Ala Ala Leu His
65 70 75 80
Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu Asp Ile Asn Thr Asn Lys Met Ser
85 90 95
Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu
100 105 110
His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg
115 120 125
Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Lys Asp Ile Thr Lys Met Lys Phe Tyr
130 135 140
Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp
145 150 155 160
Glu Leu Arg Pro Leu Asp Lys Ile Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile
165 170 175
Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val Tyr Leu Arg Met Thr Phe Gly
180 185 190
His Leu Tyr Glu Ala Phe His Ala Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser
195 200 205
Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu
210 215 220
Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser
225 230 235 240
Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu Glu Met Val Leu Arg Asp Ile
245 250 255
Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr
260 265 270
His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro
275 280 285
Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile
290 295 300
Ile Ile Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp
305 310 315 320
Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro
325 330 335
Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu Ala Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly
340 345 350
Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Thr
355 360 365
Trp Glu Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Pro Asp His Gln
370 375 380
Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu
385 390 395 400
Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala Cys Asn Thr Gln Asp His Val Arg
405 410 415
Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly Lys Asp Glu Tyr Glu Lys
420 425 430
Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val Pro Val Gly Arg Ala Leu Ala Ile
435 440 445
Pro Asn Phe Glu Asn Leu Arg Arg Asn Trp Leu Glu Leu Phe
450 455 460
<210> 11
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtaaatttg ggcaacaatc tggcgccatc tacgttggta actacagagt ggtcaatagg 60
cacctggcca cccacaatga ctgggccaac ctggtgtggg aagacagttc tcgagacctg 120
cttgtttcgt ctaccaccgc ccagggttgc gatacgattg cccgttgtga gtgtcagaca 180
ggggtgtact attgtaactc aaggaggaaa cattacccag tcagtttctc taaacctagc 240
ctcgtcttcg tagaggccag tgagtattac cctgctagat atcaatctca cctaatgctc 300
gctgcaggcc actctgaacc tggggattgc gggggtatat tgaggtgtca gcatggtgtg 360
gttggcatag tgtccactgg aggcaacggt cttgtcggtt ttgctaacgt gagggacctc 420
ttatggttgg atgaagaagc catggaacag 450
<210> 12
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggagtatctg actatatcaa gggactcggc gacgcctttg gtactggctt tactgatgca 60
gtgtctaggg aagtggaggc cctgaaaaat tacctgattg gttccgaggg agcggtggag 120
aagatcctga agaacttggt gaaactcata tcagctctgg tcatagttat cagaagtgac 180
tacgacatgg tcacccttac cgcaactcta gctctgattg ggtgtcacgg gagcccatgg 240
gcgtggatca aagcaaagac ggcgtccatc ttaggtattc ctatggcaca gaagcag 297
<210> 13
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtgcatctt ggcttaagaa gttcagtgat atggcgaacg ctgcaaaggg attagagtgg 60
atctccaaca aaatcagcaa atttattgat tggctcaagg aaaagatcat tccagccgca 120
aaggaaaaag tcgagtttct taataacctc aagcaactgc ccttgatgga aaaccaaatt 180
gctaacttag aacagtccgc tgcttcacaa gaagaccttg aagtcatgtt tggtaatgtg 240
tcatacctag cacacttttg tcgcaagttc cagccactct atgcaactga agcgaagaga 300
gtgtacgcct tagagaagag aatgaataat tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 360
gaacctgtat gtttgattat caggggctca ccaggaactg gcaagtcact tgccacaggt 420
ataatagcaa gagccattgc tgacaaatat cactctagtg tgtactccct tccaccagac 480
ccagatcact ttgatggata caagcaacaa gtggtgacag tcatggatga tctgtgccaa 540
aacccagatg gcaaagatat gtcattgttt tgtcaaatgg tatccactgt cgattttata 600
cccccaatgg cttcactgga agaaaaaggt gtatccttca catctaaatt tgttattgct 660
tcaactaatg ctagcaacat cattgtcccc acggtctcag actctgacgc tatccgtagg 720
agatttttca tggattgtga tatcgaagtg actgactctt ataagacaga cttaggccgc 780
ttagatgcag gtagggccgc aaagctctgc tcagagaata acactgccaa tttcaagagg 840
tgcagcccgc tagtgtgcgg taaagccatc caactgagag ataggaagtc caaagtcagg 900
tatagcgtag acactgtggt atcagaatta gttagggagt atagcaacag gtctgctata 960
gggaacacta tagaagcttt attccaa 987
<210> 14
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggcctccta aattcaggcc tgtaagaatt agtcttgatg agaaacccgc tccagatgcc 60
attagtgacc tgcttgctag tgttgatagt gaagaggtgc ggcagtactg cagagatcaa 120
ggatggataa tacctgaaac gccaaccaac gtggagcggc atctcaatag ggcagtacta 180
gtgatgcaat ccatcgctac tgtagtcgca gttgtgtccc ttgtttatgt tatctacaag 240
ctatttgctg gtttccaa 258
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcgcatatt ctggagcgcc caggcaagct ctcaagaaac ctgtgttgag gacagccact 60
gttcaa 66
<210> 16
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggcccagct tagattttgc cctgtccctc ctacgacgta acgtcaggca ggtgcaaacc 60
gaccaagggc actttaccat gcttggggta cgtgaccacc ttgctatctt acctcgtcac 120
tcgcaaccag ggaagaccat ctgggttgaa cacaagttgg tcaatgtgct tgatgctgtt 180
gagctagtgg atgaacaagg tgttaatttg gagctcacac tagtaaccct agataccaat 240
gagaagttta gagatgtcac caagttcatt ccagagaata tcagtggagt cagtgatgcc 300
acattaataa tcaacactga acacatgcca tcaatgtttg tcccggtagg agatgttgtt 360
caatatgggt tcctaaatct tagtggtaaa ccaacccaca ggaccatgat gtacaatttc 420
cctacaaagg ctggacagtg tggaggcgtg gtaacatctg tcggtaaaat cattggcatc 480
cacattggag gcaacgggcg tcaagggttt tgcgctggcc tgaagaggag ttactttgca 540
agtgagcaa 549
<210> 17
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtgaaatcc aatgggtgaa acctaacaag gagaccggca gattaaatat caatggtcca 60
acacgcacca agttagagcc cagtgtgttc catgatctgt ttgagggcaa caaggagcca 120
gcagtcctaa caagcaagga tcccagatta gaggttgact ttgagcaggc tctcttctcc 180
aagtatgtgg gtaatgtcct ccacgaacct gatgaatatg tgaagcaggc agccctccac 240
tacgcaaatc agctcaagca actggatata aacaccaata agatgagcat ggaggaagcg 300
tgctatggca cagagaacct ggaagcaatt gacctccata ctagcgcggg gtacccatac 360
agtgctttgg gcataaagaa gagggacata ctagatccta ccactaagga cataacaaaa 420
atgaagtttt acatggataa gtatggcttg gatttacctt actccaccta cgttaaagat 480
gaacttaggc ctctggacaa gatcaagaaa gggaagtccc gcttaataga agctagcagc 540
ctgaatgatt cagtgtacct cagaatgact tttggccacc tgtatgaagc attccatgca 600
aacccaggga ctgtgaccgg atcagcagtt gggtgcaatc cggatgtgtt ctggagtaaa 660
ctcccaatcc tactcccagg ctcgctattt gcctttgact attcaggcta tgatgctagt 720
cttagccccg tctggtttag ggctttggag atggtcttac gggacatcgg ctattcagag 780
gaagcagtgt cactcataga aggaataaat cacacccatc atgtgtatcg gaataaaaca 840
tattgtgttc ttggcgggat gccgtcagga tgttctggta cttccatttt caactcgatg 900
atcaacaaca tcatcattag gacgctttta atcaaaacct ttaaagggat agatctggac 960
gagttgaata tggtggccta tggagatgat gtgctggcta gttatccttt ccctattgat 1020
tgtcttgagt tagctaagac tggcaaggag tatgggctga ccatgacacc tgcggacaaa 1080
tcaccttgct tcaatgaagt gacgtgggaa aatgccacct ttctgaagag agggtttcta 1140
ccagatcatc aattcccatt cttgattcat cccacaatgc ccatgaaaga aattcacgaa 1200
tctatacgct ggactaaaga tgcgtgcaat acccaagacc atgtgcgctc tctgtgttta 1260
ttagcttggc acaatggtaa ggatgaatat gaaaaatttg tgagcacaat tagatcagtc 1320
ccagttggga gagcattggc aattccgaat tttgagaatt tgagaagaaa ttggctcgaa 1380
ctattt 1386
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cyttgtgcgc ctgtttt 17
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
attgtcacca taagcagcc 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagyacttc tgtmwcccc 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccaaagtag tcggttcc 18
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggtatcaaac caattacgtg gtcc 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aacaagcagg tctcgagaac 20
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