阅读说明：本技术 虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的药物应用 (Pharmaceutical application of total extract of polygonum cuspidatum, polydatin or resveratrol ) 是由 詹华强 胡伟慧 董婷霞 段然 于 2018-06-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇作为制备可与血管内皮生长因子结合而抑制血管生成的药物的应用,首次发现虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇抗血管生成作用,首次发现虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇可有效抑制血管内皮细胞的增值、迁移和小管形成,可有效抑制斑马鱼肠下静脉血管的生成,具有抗血管生成活性,可作为血管生成抑制剂,可作为制备用于治疗和预防肿瘤、关节炎、银屑病、眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的药物。(The invention relates to an application of giant knotweed total extract, polydatin or resveratrol in preparing a medicament which can be combined with vascular endothelial growth factor to inhibit angiogenesis, wherein the giant knotweed total extract, polydatin and resveratrol have the effect of resisting angiogenesis for the first time, and the giant knotweed total extract, polydatin and resveratrol can effectively inhibit the proliferation, migration and tubule formation of vascular endothelial cells, can effectively inhibit the formation of subcutaneous vein vessels of zebra fish, have the activity of resisting angiogenesis, can be used as an angiogenesis inhibitor, and can be used for preparing medicaments for treating and preventing tumor, arthritis, psoriasis, ophthalmic diseases, atherosclerosis and other angiogenesis-dependent and angiogenesis-related diseases.)

虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的药物应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的药物应用。

背景技术

血管生成是人体内一种生理现象，在胚胎发育和组织损伤修复中起着重要的作用。血管生成是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程，包括内皮细胞分泌蛋白酶降解基底膜、内皮细胞的增殖和迁移、新生毛细血管管腔结构的形成，募集周细胞以稳定新形成的毛细血管网、通过原始血管的重塑和扩展形成成熟的血管网。

抑制血管生成分子和促进血管生成分子间的动态平衡被认为是调控血管生成的“开关”。正常生理状况下，抑制血管生成分子和抗血管生成分子之间处于相对平衡状态，血管生成机制处于“关闭”状态；仅在胚胎发育、生殖、创伤修复以及女性的生理周期等机体正常生理过程中发生。但是在实体肿瘤中，血管生成会失去控制，造成恶性结果：一方面，新生血管可以为肿瘤细胞带来丰富的氧气和养料，并带走代谢产物；另一方面，肿瘤细胞可通过新生的血管向远处转移。如果瘤体中不存在血管生成，肿瘤的生长将处于停滞状态甚至发生退化；而如果瘤体中存在血管生成，肿瘤的体积则呈指数增长，例如各种原因引起的肿瘤、眼部新血管形成、关节炎、皮肤疾患、动脉粥样硬化等疾病的发生与发展，都与病理性的血管生成有重大关系。因此，抗血管生成是治疗恶性肿瘤的有效方法，肿瘤抗血管生成治疗被认为是治疗恶性肿瘤具有重大医学价值的策略之一。抗血管生成是一个极其复杂的过程，包括对血管生成调控因子的干预，抑制血管基底膜和细胞外基质降解，抑制内皮细胞***、迁移和增值等。

目前***的方法多样，效果不一，抑制肿瘤血管生成的治疗方法优点在于：1.毒副作用小，对正常细胞的损伤较小；2.具有广谱效应；3.不易产生耐药性；4.可与其他治疗方法相互补充。因此，该治疗方法具有广阔的应用前景。与此同时，该治疗方法还是一种较新的治疗方法，亟需进行相关的研究。

虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)的干燥根茎和根，性味苦寒，归肝、胆、经，有活血定痛、清热利湿、解毒、化痰止咳等功效，中医临床用于治疗湿热黄疸，肺热咳嗽，疮痈肿毒，关节痹痛，经闭，经痛，水火烫伤，跌打损伤等。对虎杖的药理学活性研究表明：虎杖具有抗炎、降血脂、抑制血小板聚集、抗血栓、抗休克、抗氧化等作用，虎杖还具有抗肿瘤作用，通过抑制细胞DNA和RNA的合成抑制人早幼白细胞(HL-60)，对小鼠肉瘤、小鼠肝瘤、小鼠乳腺瘤、小鼠艾氏腹水癌、小鼠淋巴瘤及小鼠黑色素瘤均有抑制作用，但目前还没有虎杖抑制新生血管形成并作为血管形成抑制剂使用的报道。

虎杖苷(Polydatin)是从蓼科植物属虎杖的干燥根茎中提取的第四种单体，故又名虎杖结晶4号，也可称为白藜芦醇苷。分子式：C₂₀H₂₂O₈，分子量：390.131468，化学结构如下所示：

现代药理学研究表明，虎杖苷对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用，但目前还没有虎杖苷可与血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)结合进而抑制新生血管形成并作为血管形成抑制剂使用的报道。

白藜芦醇(Resveratrol)是一种非黄酮类多酚化合物，常见于葡萄树外皮、种子、茎秆以及叶子中，尤其是在诸如Vitis(葡萄属)vinifera、Vitis rotundifolia以及Vitislabrusca等葡萄种类中，白藜芦醇的含量更为丰富。白藜芦醇还存在于廖属植物的根中，如虎杖以及何首乌。分子式：C₁₄H₁₂O₃，分子量：228.24，化学结构如下所示：

现代药理学研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗突变、抗氧化、抗菌抗炎、保肝、诱导细胞凋亡及***调节等生物药理活性，虽目前已有少数白藜芦醇具有抗心血管活性的报道，但对于白藜芦醇可与血管内皮生长因子结合进而抑制新生血管形成并作为血管形成抑制剂使用，尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的药物应用，解决现有技术中尚未有杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇用于制备抑制血管生成的药物的问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇作为制备可与血管内皮生长因子结合而抑制血管生成的药物的应用。也就是说，虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可作为制备血管生成抑制剂的药物的应用。

在本发明的应用中，所述血管生成为肿瘤血管新生，且肿瘤为实体肿瘤，所述实体肿瘤为原发性或继发性实体肿瘤。

在本发明的应用中，所述肿瘤血管新生为肿瘤病变组织的血管新生或肿瘤导致的血管新生。即虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇作为制备抑制肿瘤血管新生的药物的应用。

在本发明的应用中，所述的肿瘤血管新生为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血管癌症的血管新生。即虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇作为制备抑制白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血管癌症的血管新生的药物的应用。

在本发明的应用中，所述血管生成为银屑病病变组织血管新生、Paget’s疾病血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、关节炎病变组织的血管新生、动脉粥样硬化病变处的血管新生或新生血管性眼病的血管生成，所述的新生血管性眼病为原发性或继发性新生血管性眼病。

也就是说，虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可以作为制备抑制银屑病病变组织血管新生的药物的应用。

虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可以作为制备抑制Paget’s疾病血管新生的药物的应用。

虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可以作为制备抑制良性血管增生疾病的血管新生的药物的应用。

虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可以作为制备抑制关节炎病变组织的血管新生的药物的应用。

虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可以作为制备抑制动脉粥样硬化病变处的血管新生的药物的应用。

虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇可以作为制备抑制新生血管性眼病的血管生成的药物的应用。

在本发明的应用中，所制备的药物中还可以包含有其它药学上可接受的成分。

在本发明的应用中，其它药学上可接受的成分含有至少一种药学上可接受的辅料。

在本发明的应用中，其它药学上可接受的成分也可以是其它的药物。当制备的药物中含有虎杖苷时，其它药学上可接受的成分可以是含有与虎杖苷拮抗作用以外的其它药物，即与虎杖苷没有拮抗作用的药物；当制备的药物中含有白藜芦醇时，其它药学上可接受的成分含有与白藜芦醇拮抗作用以外的其它药物，即与白藜芦醇没有拮抗作用的药物。

在本发明的应用中，制备的药物是含有虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的胶囊剂、片剂、微囊片剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或口服液。

在本发明的应用中，制备的药物的给药方式为注射、口服、吸入式喷雾或透皮给药。

实施本发明的虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的药物应用，具有以下有益效果：本发明提供了虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇新的用途，首次发现虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇抗血管生成作用，首次发现虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇可有效抑制血管内皮细胞的增值、迁移和小管形成，可有效抑制斑马鱼肠下静脉血管的生成，具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂，可作为制备用于治疗和预防肿瘤、关节炎、银屑病、眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的药物。

附图说明

图1是虎杖总提取物高效液相指纹图；

图2A是虎杖总提取物抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验方块图；

图2B是虎杖苷抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验方块图；

图2C是白藜芦醇抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验方块图；

图3A是虎杖总提取物抑制HUVEC划痕迁移的照片及其量化图；

图3B是虎杖苷抑制HUVEC划痕迁移的照片及其量化图；

图3C是白藜芦醇抑制HUVEC划痕迁移的照片及其量化图；

图4A是虎杖总提取物抑制HUVEC Transwell小室垂直迁移的照片及其量化图；

图4B是虎杖苷抑制HUVEC Transwell小室垂直迁移的照片及其量化图；

图4C是白藜芦醇抑制HUVEC Transwell小室垂直迁移的照片及其量化图；

图5A是虎杖总提取物抑制HUVEC小管生成的照片及其量化图；

图5B是虎杖苷抑制HUVEC小管生成的照片及其量化图；

图5C是白藜芦醇抑制HUVEC小管生成的照片及其量化图；

图6A是虎杖总提取物抑制斑马鱼肠下静脉血管生成的照片及其量化图；

图6B是虎杖苷抑制斑马鱼肠下静脉血管生成的照片及其量化图；

图6C是白藜芦醇抑制斑马鱼肠下静脉血管生成的照片及其量化图；

图7A是虎杖总提取物可与VEGF结合特异性阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)介导的信号通路发挥其抗血管生成作用的照片及其量化图；

图7B是虎杖苷可与VEGF结合特异性阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)介导的信号通路发挥其抗血管生成作用的照片及其量化图；

图7C是白藜芦醇可与VEGF结合特异性阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)介导的信号通路发挥其抗血管生成作用的照片及其量化图；

图8A是表明虎杖苷可与VEGF结合的照片及其量化图；

图8B是表明白藜芦醇可与VEGF结合的照片及其量化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的虎杖总提取物、虎杖苷或白藜芦醇的药物应用作进一步说明：

本发明的目的是要开发和利用可与血管内皮生长因子结合的虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇。通过对虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇进行深入细致研究，首次发明了虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇可抑制血管内皮生长因子诱导的血管生成，对人脐静脉内皮细胞增殖、细胞迁移、小管形成均有显著的抑制作用。在动物模型中，虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇可以显著抑制斑马鱼肠下静脉血管的生成，进一步明确了其抗血管生成作用，可以用于肿瘤抗血管生成。为进一步充分说明本发明的药物应用，现通过以下实施例来说明。

实施例1：虎杖总提取物的制备和虎杖总提取物的高效液相指纹图谱

1、方法

将虎杖药材粉碎，称取50g，至于容量瓶中，用1000mL、50％乙醇浸泡提取三天，提取液60℃真空浓缩至30mL后真空冻干，即得虎杖总提取物，冻干粉真空保存。

称取冻干粉100mg，置于15mL的离心管中，加入4mL、50％甲醇，超声15分钟后，1000x g条件下离心5分钟，得上清液，上清液进样前，使用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，进样分析。使用的分析仪器为带有自动进样器和二元泵的安捷伦液相，色谱柱为安捷伦,Grace VisionHT C18柱(4.6x 250mm,5μm)，流动相为乙腈(溶剂A)和0.2％甲酸水溶液(溶剂B)，流速为1mL/min，柱温为室温，梯度洗脱，流动相比例如下：0-60分钟，10-35％溶剂A；60-96分钟，35-100％溶剂A。进样体积为10μL，检测波长为280nm。虎杖苷和白藜芦醇作为该虎杖总提取物的指标成分。

2、结果与结论

请参照图1，在上述分析条件下，虎杖的乙醇提取物中的各化学成分均达到基本分离，可作为虎杖药材质量控制方法应用。在该虎杖的乙醇提取物中，虎杖苷与白藜芦醇的含量分别为12.8mg/g和5.13mg/g。

需要说明的是，虎杖总提取物也可以是利用水或95％乙醇提取得到，或者可以通过有机溶剂，如甲醇、丙酮、异丙醇等等，其它现有的任何可以针对虎杖提取的方法所得到的虎杖总提取物，均可以实现本发明的药物应用，均在本发明的保护范围之内，下述实施例2-9的实验中是以本实施例1提取方式提取出的虎杖总提取物为例进行说明，其它提取方法的虎杖总提取物这里就不再详细赘述。其中，利用水提取虎杖总提取物参见如下过程：将虎杖药材粉碎，称取50g，至于容量瓶中，用1000mL水浸泡过夜，超声提取1小时，重复提取两次，取上清液真空冻干，即得虎杖水提取物，冻干粉真空保存。利用95％乙醇提取虎杖总提取物参见如下过程：将虎杖药材粉碎，称取50g，至于容量瓶中，用1000mL95％乙醇浸泡过夜，超声提取1小时，重复提取两次，合并两次提取的上清液，60℃真空浓缩后真空冻干，即得虎杖醇提取物，冻干粉真空保存。

实施例2：虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇抑制人脐静脉内皮细胞的(HUVEC)增殖实验

采用四唑盐(MTT)比色法观察阳性对照组癌思停(Avastin)组以及不同给药浓度的虎杖苷提取物、虎杖苷、白藜芦醇对HUVEC的增殖抑制作用，表明虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇具有良好地抑制HUVEC增殖的作用，并存在浓度依赖关系。

1、方法

HUVEC细胞以5.0×10³个/mL的密度接种于96孔培养板培养，每孔100μL，待细胞生长达到80％融合后，将10ng/mL VEGF或不同浓度的虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇加入孔中，作用48小时后每孔加入MTT溶液10μL，37℃继续培养4小时后终止培养，弃去培养上清液，每孔加150μL DMSO，振荡10min充分溶解，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值。以未加药的孔作为对照，按如下公式计算细胞活力：

细胞活力(％)＝(OD_样品-OD_对照品)/OD_对照品×100％

2、结果与结论

请参照图2A、2B、2C，图2A是虎杖总提取物抑制HUVEC的增殖的方块图，图2B是虎杖苷抑制HUVEC的增殖的方块图，图2C是白藜芦醇抑制HUVEC的增殖的方块图。如图2A、2B、2C所示，虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇对HUVEC的增殖抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例3：虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)划痕迁移实验

1、方法

HUVEC细胞以20×10⁴个/孔的密度接种于接种于12孔板中培养，过夜让细胞贴壁，待细胞生长达到80％融合后，使用200μL吸管尖，在每孔中间划伤一个横向的伤口，弃培养基，PBS洗一遍，于培养液中分别单独加入10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇，并设置一个未加药的空白实验。利用配有摄影机的显微镜在50倍放大率下于0和8小时后拍下每孔内细胞层覆盖率的变化。再利用TScratch软件把恢复生长速度数据化，按照下式计算细胞恢复生长速度：

回复率％＝(At₀-At₈)/At₀×100％，

其中，At₀：给药0小时后所测的划痕面积；At₈：给药8小时后所测的划痕面积。

2、结果与结论

请参照图3A、3B、3C，图3A是虎杖总提取物抑制HUVEC的划痕迁移的照片及量化图，图3B是虎杖苷抑制HUVEC的划痕迁移的照片及量化图，图3C是白藜芦醇抑制HUVEC的划痕迁移的照片及量化图。如图3A、3B、3C所示，虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇对HUVEC的划痕迁移抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例4：虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Transwell小室垂直迁移实验

Transwell法检测HUVEC迁移。Transwell是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室(chamber)，小室的底层有一层通透性的膜(一般常用的是聚碳酸酯膜polycarbonate membrane)，这层膜带有孔径大小0.1-12.0μm的微孔，实验中细胞置于小室上，在小室下含有的趋化因子或生长因子的作用下，细胞透过聚碳酸酯膜，从而进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面的研究。

1、方法

下室加入500μL HUVEC培养基，上室中分别加入含有10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇的HUVEC(20×10⁴细胞/孔)，置于37℃培养箱中培养24小时，未加药的组为对照。24小时后，从培养箱取出培养板，弃去孔中培养液，加入500μL、甲醇溶液常温固定20分钟，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，然后加入200μL、0.01％结晶紫染色，最后用PBS溶液洗去多余的结晶紫染料，在倒置显微镜下观察拍照。

2、结果与讨论

迁移后的细胞经结晶紫染色后显***，请参照图4A、4B、4C，图4A是虎杖总提取物抑制HUVEC Transwell小室垂直迁移的照片及量化图，图4B是虎杖苷抑制HUVECTranswell小室垂直迁移的照片及量化图，图4C是白藜芦醇抑制HUVEC Transwell小室垂直迁移的照片及量化图。如图图4A、4B、4C所示，虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇对HUVECTranswell小室垂直迁移的抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例5：虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管生成实验

运用Matrigel胶检测HUVEC的小管形成作用。人工基膜Matrigel胶是从小鼠EHS肉瘤中提取的基膜成分，在37℃下可自发形成凝胶状的人工基膜，具有天然基膜的生物学作用。人脐静脉内皮细胞可以在Matrigel胶上粘附成管，从而可用于研究药物对内皮细胞小管形成作用的影响。

1、方法

取200μL Matrigel胶溶液加入到预冷的12孔培养板中，然后放置于37℃培养箱孵育1小时使胶固化。将10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇的HUVEC(20×10⁴细胞/孔)分别加入铺有Matrigel的12孔板中，置于37℃培养箱培养8小时，未加药的组为对照，8小时后在倒置光学显微镜下观察血管形成。

2、结果与结论

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)可在Matrigel上延伸生长呈管状并相互连接，形成三维网状结构，请参照图5A、5B、5C，图5A是虎杖总提取物抑制HUVEC小管形成的照片及量化图，图5B是虎杖苷抑制HUVEC小管形成的照片及量化图，附图5C是白藜芦醇抑制HUVEC小管形成的照片及量化图。如图5A、5B、5C所示，虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇对HUVEC小管形成的抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例6：虎杖总提取物抑制斑马鱼肠下静脉血管(SIV，subintestinal vessel)形成实验

斑马鱼肠下静脉血管(SIV，subintestinal vessel)生长在卵黄囊两侧，其形状似一个篮子，肠下静脉血管(SIV)由体节腹侧向下延伸的长度约为50～100μm。

1、方法

实验分组及胚胎处理：取70只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后23hpf(hour-postfertilization，hpf)，随机分为7组，每组胚胎数量为10只。操作时将胚胎均匀分配至12孔细胞培养板中，每孔10只胚胎，每孔胚胎饲养用水1mL。

药物处理：用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)迅速将预先配置好的10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的虎杖总提取物加入12孔细胞培养板对应的孔中，每孔1mL。加药液之前，用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)将12孔细胞培养板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出，此操作需在短时间内预先完成，以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40～70％。将12孔板包裹号，做好实验标记，迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养48小时(培养箱温度控制在28.5℃)。48小时后，使用4％多聚甲醛于4℃环境中固定斑马鱼胚胎20小时后，依次使用PBST(0.1％吐温)、50％甲醇、甲醇，每次清洗胚胎5分钟，将斑马鱼胚胎浸于甲醇中，置于-20℃环境中脱水两小时；脱水后，使用PBST(0.1％吐温)洗去多余的甲醇，使用nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indol-yl-phosphate(NBT/BCIP)对斑马鱼胚胎进行染色后，在倒置光学显微镜下观察血管形成。

2、结果与结论

请参照图6A，图6A是虎杖总提取物抑制斑马鱼肠下静脉血管形成的照片及其量化图。如图6A所示，虎杖总提取物对斑马鱼肠下静脉血管形成的抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例7：虎杖苷抑制斑马鱼肠下静脉血管(SIV，subintestinal vessel)形成实验

斑马鱼肠下静脉血管(SIV，subintestinal vessel)生长在卵黄囊两侧，其形状似一个篮子，肠下静脉血管(SIV)由体节腹侧向下延伸的长度约为50～100μm。

1、方法

实验分组及胚胎处理：取60只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后23hpf(hour-postfertilization，hpf)，随机分为6组，每组胚胎数量为10只。操作时将胚胎均匀分配至12孔细胞培养板中，每孔10只胚胎，每孔胚胎饲养用水1mL。

药物处理：用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)迅速将预先配置好的10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的虎杖苷加入12孔细胞培养板对应的孔中，每孔1mL。加药液之前，用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)将12孔细胞培养板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出，此操作需在短时间内预先完成，以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40～70％。将12孔板包裹号，做好实验标记，迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养48小时(培养箱温度控制在28.5℃)。48小时后，使用4％多聚甲醛于4℃环境中固定斑马鱼胚胎20小时后，依次使用PBST(0.1％吐温)、50％甲醇、甲醇，每次清洗胚胎5分钟，将斑马鱼胚胎浸于甲醇中，置于-20℃环境中脱水两小时；脱水后，使用PBST(0.1％吐温)洗去多余的甲醇，使用nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indol-yl-phosphate(NBT/BCIP)对斑马鱼胚胎进行染色后，在倒置光学显微镜下观察血管形成。

2、结果与结论

请参照图6B，图6B是虎杖苷抑制斑马鱼肠下静脉血管形成的照片及其量化图。如图6B所示，虎杖苷对斑马鱼肠下静脉血管形成的抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例8：白藜芦醇抑制斑马鱼肠下静脉血管(SIV，subintestinal vessel)形成实验

斑马鱼肠下静脉血管(SIV，subintestinal vessel)生长在卵黄囊两侧，其形状似一个篮子，肠下静脉血管(SIV)由体节腹侧向下延伸的长度约为50～100μm。

1、方法

实验分组及胚胎处理：取60只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后23hpf(hour-postfertilization，hpf)，随机分为6组，每组胚胎数量为10只。操作时将胚胎均匀分配至12孔细胞培养板中，每孔10只胚胎，每孔胚胎饲养用水1mL。

药物处理：用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)迅速将预先配置好的10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的白藜芦醇加入12孔细胞培养板对应的孔中，每孔1mL。加药液之前，用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)将12孔细胞培养板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出，此操作需在短时间内预先完成，以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40～70％。将12孔板包裹号，做好实验标记，迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养48小时(培养箱温度控制在28.5℃)。48小时后，使用4％多聚甲醛于4℃环境中固定斑马鱼胚胎20小时后，依次使用PBST(0.1％吐温)、50％甲醇、甲醇，每次清洗胚胎5分钟，将斑马鱼胚胎浸于甲醇中，置于-20℃环境中脱水两小时；脱水后，使用PBST(0.1％吐温)洗去多余的甲醇，使用nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indol-yl-phosphate(NBT/BCIP)对斑马鱼胚胎进行染色后，在倒置光学显微镜下观察血管形成。

2、结果与结论

请参照附图6C，图6C是白藜芦醇抑制斑马鱼肠下静脉血管形成的照片及其量化图。如图6C所示，白藜芦醇对斑马鱼肠下静脉血管形成的抑制作用呈剂量依赖关系。

实施例9：虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇特异性阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)介导的信号通路发挥其抗血管生成作用

1、方法

采用western-blot实验评价虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇对VEGF依赖性血管生成的作用。将HUVEC细胞接种于12孔板内(20×10⁴细胞/孔)，置于37℃培养箱孵育24小时。采用无血清培养基饥饿培养1小时后，分别加入10ng/mL的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)、200μg/mL的癌思停和不同浓度的虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇，给药。使用低浓度裂解液对HUVEC细胞进行裂解，收集细胞裂解液，于8％-10％SDS-PAGE胶上样。采用biacore实验技术、分子结合软件(Molecular Docking，Vina，PhyMol)分别考察单体白藜芦醇、虎杖苷和血管内皮生长因子之间的分子相互作用。

2、结果与结论

请参照图7A、7B、7C。图7A是虎杖总提取物呈剂量依赖性的抑制磷酸化的VEGFR2表达水平，以及对其下游的Akt、Erk、eNOS、JNK也呈现显著抑制作用；图7B是虎杖苷呈剂量依赖性的抑制磷酸化的VEGFR2表达水平，以及对其下游的Akt、Erk、eNOS、JNK也呈现显著抑制作用；图7C是白藜芦醇呈剂量依赖性的抑制磷酸化的VEGFR2表达水平，以及对其下游的Akt、Erk、eNOS、JNK也呈现显著抑制作用。图8A表明虎杖苷可与VEGF结合；图8B表明白藜芦醇可与VEGF结合。

实施例10：虎杖总提取物、虎杖苷、白藜芦醇的制剂

将虎杖总提取物、或虎杖苷、或白藜芦醇与合适的辅料混合，可按照不同工艺制成不同的剂型如：胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂，作为制备用于治疗和预防肿瘤、关节炎、银屑病、眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的药物制剂，各个剂型的制备方法均是现有技术中常用的制备方法，这里不再进行赘述。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。