一种水红花子提取物在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用
阅读说明：本技术 一种水红花子提取物在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用 (Application of fructus Polygoni orientalis extract in preparing medicine for preventing or treating non-alcoholic fatty liver disease ) 是由 栗政 陈凯 李进冬 周磊 陈艳 花慧莲 李建华 瞿建江 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了水红花子提取物作为唯一活性成分在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用。本发明中,水红花子提取物主要含有黄酮和多酚酸类化合物,能有效缓解游离脂肪酸诱导的人肝细胞中脂质蓄积,降低甘油三酯和胆固醇水平,降低氧化应激和炎症因子水平,说明水红花子提取物能对非酒精性脂肪肝起到显著的治疗作用,可用于制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物。(The invention provides application of a fructus polygoni orientalis extract as a unique active ingredient in preparing a medicament for preventing or treating non-alcoholic fatty liver diseases. In the invention, the fructus polygoni orientalis extract mainly contains flavone and polyphenolic acid compounds, can effectively relieve lipid accumulation in human liver cells induced by free fatty acid, reduce triglyceride and cholesterol levels, and reduce oxidative stress and inflammatory factor levels, which indicates that the fructus polygoni orientalis extract can play a significant role in treating non-alcoholic fatty liver and can be used for preparing medicaments for preventing or treating non-alcoholic fatty liver diseases.)
技术领域
本发明涉及水红花子(Polygoni Orientalis Fructus)提取物的新用途，尤其涉及水红花子提取物在制药领域的新用途，确切地说是水红花子提取物在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的用途。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种与肥胖密切相关的代谢应激性肝损伤，其疾病谱包括从非酒精性肝脂肪变性进展到非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化和肝硬化，最终导致肝细胞癌。随着肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征的增加，NAFLD已成为发达国家最常见的肝脏疾病，大约影响全球三分之一的人口，是当前全球面临的巨大且不断增长的疾病负担之一。在我国，NAFLD已成为第一大慢性肝病和健康体检肝生化指标异常的首要原因。NAFLD除了累及肝脏，还与2型糖尿病、心脑血管疾病以及慢性肾病的发病密切相关。为此，NAFLD已成为当代医学领域的新挑战，严重危害人类生命健康，因此NAFLD预防与治疗策略的探索已刻不容缓。
目前，NAFLD的防治措施主要包括生活方式改变与药物治疗。以饮食干预与运动为核心的生活方式改变能有效控制/逆转单纯性NAFLD，因此被普遍推荐用于NAFLD初级阶段的治疗。但是，生活方式的改变很难长时间维持，实施困难，因此往往无法达到预期的效果。而且，其对肝纤维化患者疗效不明显。目前，尚无批准的针对NAFLD的治疗药物。临床上推荐使用降糖药物如二甲双胍、吡格列酮，降血脂药物如非诺贝特，抗氧化补充剂如维生素E来治疗NAFLD。但因这些药物或存在副作用、或加剧肝脏负担、或药效欠佳，使用上受到限制。因此，开发安全有效的治疗药物和保健产品具有重要创新意义和临床价值。
水红花子(Polygoni Orientalis Fructus,POF)是药用植物红蓼(Polygonumorientale L.)的干燥成熟果实。红蓼为蓼科蓼属一年生草本植物，广泛分布于江苏、山东、河北、山西等中国大多数省份。红蓼叶绿且花密，果实入药，为常见的观赏与药用两用植物。水红花子味咸、微辛，性微寒，归肝、胃经，具有散血消癥、消积止痛、利水消肿等功能。近年来，国内外学者对水红花子成分、生物活性进行了研究。研究结果表明水红花子具有多种有益的药理作用和保健效果，包括缓解急性肝损伤、抗炎、抗氧化、调节免疫和抗肿瘤等作用。目前，对水红花子的研究多集中于水红花子黄酮的分析检测，也有关于水红花子提取物对大鼠肝损伤治疗作用的研究，现有专利涉及水红花子中黄酮化合物的制备，但水红花子单独应用于NAFLD的防治研究尚未有报道。
中国专利申请CN201610316887.4涉及一种治疗非酒精性脂肪性肝病的复方中药组合物及其制备方法和应用。其特征在于采用下述中药按重量份配比：郁金3～5份、苍术4～6份、决明子3～5份、山楂3～5份、鬼箭羽2～4份、水红花子4～6份。现有专利公开的复方中药组合物除了水红花子外，还包含郁金、苍术、决明子、山楂和鬼箭羽，并未揭示其复方中药组合物中的水红花子可以单独作为活性成分用于治疗非酒精性脂肪性肝病。
现有技术也未有关于水红花子提取物可以单独作为活性成分用于治疗非酒精性脂肪性肝病的报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是：针对NAFLD的治疗现状，提出一种水红花子提取物的新用途，即水红花子提取物作为唯一活性成分在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用。
经过大量的实验研究，本发明意外发现水红花子提取物作为唯一活性成分，单独作用，就能有效治疗游离脂肪酸诱导的人源肝细胞(LO2)内脂质蓄积，降低肝细胞内甘油三酯和胆固醇水平，降低肝细胞内氧化应激和肝细胞内炎症因子水平，为NAFLD的防治提供新的安全有效的选择。
本发明提出的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供水红花子提取物作为唯一活性成分在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用。
本发明中，所述水红花子提取物主要含有以下化合物：
本发明中，所述水红花子提取物的制备方法可以以水为提取溶剂，采用超声提取或者回流提取得到提取物；也可以以有机溶剂为提取溶剂，采用超声提取或者回流提取得到提取物；还可以以任意一种现有的中药提取方法提取得到提取物。
本发明中，所述水红花子提取物的制备方法优选以乙醇为提取溶剂，并采用超声提取得到提取物。
本发明中，所述水红花子提取物的制备方法优选实施的步骤如下：水红花子干燥药材经粉碎后用80％乙醇浸泡，然后超声提取，合并提取液，过滤，回收溶剂，浓缩即可得到水红花子提取物，所述水红花子干燥药材与80％乙醇的质量体积比为1g：2mL。
本发明的第二个目的是提供一种预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物的药物组合物，所述的药物组合物以上述水红花子提取物作为唯一活性成分，所述的药物组合物包括预防或治疗上有效量的水红花子提取物，以及药学上可接受的辅料或载体。
本发明中，所述的药学上可接受的辅料或载体是药学领域中可得到的常见类型，可以包括黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂或基质等中的一种或多种。
本发明中，所述的药学上可接受的辅料或载体优选选自淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、植物油、维晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羟甲基淀粉钠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、维粉硅胶、葡萄糖、甘露醇和木糖醇中的一种或多种。
本发明中，所述的组合物可以按照常规工艺，制成药学上可接受的各种剂型，如颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、滴剂、口服液、气雾剂、滴鼻剂或注射剂等。
本发明中，所述非酒精性脂肪肝疾病为非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及非酒精性肝硬化中的任一种。
本发明的技术方案具有如下技术效果：
(1)本发明提供的水红花子提取物主要含有黄酮、酚酸、植物甾醇类化合物。本发明通过大量实验筛选验证得出：本发明的水红花子提取物单独作用即可对非酒精性脂肪肝疾病NAFLD具有治疗效果。
(2)据中国药典记载，水红花子具有散血消癥、消积止痛、利水消肿等功能。已报道的水红花子水提取物和醇提取物可用于治疗动物肝纤维化、肝硬化、高尿酸血症、免疫性肝损伤、肝癌。但是目前没有水红花子提取物作为唯一活性成分用于治疗NAFLD的相关报道。非酒精性脂肪肝NAFLD是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征，也是一种临床常见病症，据文献报道，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与氧化应激存在着密切的关系。
(3)在对水红花子提取物的药理实验研究中，本发明意外地发现水红花子提取物单独作用就能有效改善肝细胞脂质蓄积；能有效改善肝细胞脂质水平，缓解脂质蓄积造成的肝细胞损伤；能有效缓解肝细胞内氧化应激；水红花子提取物能有效缓解肝细胞炎症，证明水红花子提取物可作为唯一活性成分用于制备预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病药物。
附图说明
图1为水红花子提取物液相色谱-质谱联用分析色谱图。
图2为水红花子提取物对脂肪酸诱导的LO2细胞内脂质蓄积的影响。
图3为水红花子提取物对脂肪酸诱导的LO2细胞氧化应激的影响。
具体实施方式
实施例1水红花子提取物的制备
1.水红花子提取物的制备
水红花子干燥药材(购自北京同仁堂，产地安徽亳州)，经粉碎机打成粉末，称取50g粉末在80％乙醇(100mL)中浸泡2h，室温下超声提取30min，然后过滤收集滤液。将滤渣在室温下再次超声提取30min，过滤收集滤液。合并滤液并在减压下浓缩成油状物。
2.水红花子提取物的液相色谱-质谱联用分析
将获得的油状物溶解在80％甲醇(5mL)中，然后15000×g离心15min，取上清液，用0.22μm尼龙膜过滤器过滤，样品溶液采用液相色谱-质谱联用分析。本实验的色谱条件为：采用Sepax GP-C18色谱柱(2.1mm×150mm,1.8μm)，以含0.1％甲酸的水为流动相A，乙腈为流动相B；流速为0.2mL/min，柱温为35℃，采用以下梯度洗脱程序：0-7-15-20-25-30-40min,20％-30％-40％-50％-55％-65％-20％B，进样量为5μL。质谱条件为：Q-TOF质谱配备电喷雾离子源，离子源采用负离子模式，离子喷雾电压为3000V，蒸发器温度280℃；鞘气压力50psi；毛细管温度320℃，辅助气体压力15psi，全扫模式覆盖m/z 100-1000范围，二级质谱碎裂使用不同的碰撞能量进行。通过将得到的色谱峰保留时间、精确分子离子质量和产物离子与相应的化学标准品和文献数据进行匹配，鉴定出30种主要化学成分(图1，表1)。
表1水红花子提取物中主要化学成分
实施例2水红花子提取物对NAFLD的改善作用
1.材料与试剂
油酸钠、棕榈酸钠、油红O、牛血清白蛋白(BSA)和溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)购自Sigma Aldrich公司，人源肝细胞系LO2细胞购自ATCC公司，细胞培养用1640培养基、青霉素-链霉素双抗溶液和胎牛血清(FBS)购自GIBCO Invitrogen公司，甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，活性氧荧光探针CM-H2DCFA购自Molecular Probes，炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因引物购自华大基因。
2.实验方法
LO2细胞在1640培养液(含10％FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中培养，置于37℃培养箱中，提供5％CO2。细胞分为对照组(NC)，模型组(FFA)和实施例1制备的水红花子提取物的给药组(POF高、中、低三个剂量组)细胞贴壁后对照组细胞换1640培养液，模型组和给药组细胞换含有1mM脂肪酸(油酸钠和棕榈酸钠摩尔比为2:1)的1640培养液诱导细胞NAFLD模型，给药组细胞添加实施例1中的提取物(终浓度分别为5,10and 20μg/mL)，细胞继续培养24h。
细胞处理结束后，采用油红O溶液染色评估细胞内脂滴蓄积程度，按试剂盒说明检测细胞内TG、TC、ALT和AST含量，采用CM-H2DCFA荧光探针检测细胞内活性氧水平，采用RT-QPCR检测细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。
3.结果
3.1肝细胞内脂质蓄积情况
如图2所示，与NC组相比，FFA组细胞内脂滴蓄积明显增多，而POF组与FFA组相比，高剂量POF组细胞内脂滴明显减少，脂质蓄积减轻，说明水红花子提取物能有效改善肝细胞脂质蓄积。
3.2肝细胞内生化指标
如表2所示，与NC组相比，FFA组细胞内TG、TC和ALT水平显著升高，而POF组与FFA组相比，高剂量POF组细胞内TG、TC和ALT水平均显著降低，中剂量POF组细胞内TC和ALT水平显著降低，低剂量POF组细胞内ALT水平显著降低，药理效应呈现剂量依赖性。以上结果说明水红花子提取物能有效改善肝细胞脂质水平，缓解脂质蓄积造成的肝细胞损伤。
表2肝细胞内生化指标测量结果
***p<0.001与对照组相比；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001与模型组相比
3.3肝细胞内氧化应激评估
如图3所示，与NC组相比，FFA组细胞内活性氧水平显著增高，而POF组与FFA组相比，高剂量POF组细胞内活性氧水平显著降低，说明水红花子提取物能有效缓解肝细胞内氧化应激。
3.4肝细胞内炎症因子水平
如表3所示，与NC组相比，FFA组细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著升高；而POF组与FFA组相比，高、中剂量POF组细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著降低，低剂量POF组细胞内TNF-α和IL-6的mRNA表达水平显著降低，药理效应呈剂量依赖性。以上结果表明水红花子提取物能有效缓解肝细胞炎症。
表3细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平
***p<0.001与对照组相比；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001与模型组相比
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
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