阅读说明：本技术 一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法 (Method for enriching polygonum hydropiper volatile oil by adopting macroporous resin ) 是由 杨小生 彭梅 王瑜 杨娟 罗忠圣 陈发菊 廖秀 梁语嫣 于 2019-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法,该方法首先利用质量分数为75-85％乙醇超声提取30-60min,过滤后将滤液稀释至乙醇浓度为40％,然后采用DPH100型大孔树脂或强酸性阳离子树脂经水洗脱至流出液无颜色,最后,经质量分数为90％的乙醇洗脱,收集的流出液为辣蓼的挥发性成分。采用该方法制备的辣蓼挥发油对小鼠急性软组织挫伤具有很好的治疗作用,与空白组比较,差异极显著(P<0.05),与阳性对照云南白药喷雾剂比较,效果相当,无统计学差异；小鼠抗炎实验表明,该方法制备的辣蓼挥发油具有抑制小鼠二甲苯致炎症作用,因此,该工艺方法可应用到跌打损伤药物的制备工艺中。(The invention discloses a method for enriching polygonum hydropiper volatile oil by adopting macroporous resin, which comprises the steps of firstly carrying out ultrasonic extraction for 30-60min by using 75-85% ethanol by mass fraction, diluting filtrate until the ethanol concentration is 40% after filtering, then eluting by adopting DPH100 type macroporous resin or strong acid cation resin through water until effluent liquid is colorless, finally eluting by using 90% ethanol by mass fraction, and collecting effluent liquid as volatile components of polygonum hydropiper. The polygonum hydropiper volatile oil prepared by the method has good treatment effect on acute soft tissue contusion of mice, has very obvious difference (P is less than 0.05) compared with a blank group, has equivalent effect compared with a positive control Yunnan white drug powder spray, and has no statistical difference; anti-inflammatory experiments on mice show that the polygonum hydropiper volatile oil prepared by the method has the effect of inhibiting inflammation caused by xylene in mice, so that the process method can be applied to the preparation process of the medicament for treating traumatic injury.)

一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法

技术领域

本发明属于中药成分提取领域，具体的涉及一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法。

背景技术

辣蓼(Polygonum hydropiperL.)属于蓼科蓼属植物水蓼的干燥全草，味辛、性温。分布广泛，在贵州主要分布于黔东南州，多生于河滩、水沟边、山谷湿地海拔50～3500m处。具有祛风利湿，散瘀止痛，健脾化湿、除湿化滞、止痢止痛、解毒化瘀解毒消肿，杀虫止痒之功效。常用于痢疾，胃肠炎，腹泻，风湿关节痛，跌打肿痛，功能性子宫出血等病症的治疗；外用于毒蛇咬伤，皮肤湿疹等。主要含有黄酮、萜类、挥发油，糖苷等功能活性成分。

挥发油是其主要活性成分之一。挥发油具有抗菌、杀虫等活性，对抗炎镇痛具有很强的活性，其抗炎镇痛效果与云南白药的效果相当。挥发油是一类结构或化学性质相似的物质混合物，而不是单一的化合物，在分离纯化技术上没有办法将其分离成单一的化合物，也无相应的对照成分，同时挥发油的药理活性是一类物质的共同作用，若是分离成单一的成分其药理活性会消失或者下降，因此不能采用常规的现代分离技术将其分离。

辣蓼挥发油具有特殊的辛辣味，同时辣蓼挥发油在发挥抗炎镇痛时必须具有这样的特殊辛辣味，当采用水蒸气蒸馏法提取辣蓼挥发油时，所提取得到的挥发油不具备辣蓼的特殊辛辣味，缺少这种辛辣味的挥发油不具有治疗抗炎镇痛的活性。同时辣蓼挥发性成分在治疗抗炎镇痛方面的特殊性成分具有热不稳定性，当温度达到35℃以上时，辣蓼挥发油失去了抗炎镇痛的活性，因此不能采用传统方法萃取制备辣蓼挥发油。

挥发油的色谱鉴定法一般采用薄层色谱法和气相色谱—质谱(GC/MS)联用法薄层色谱常采用硅胶G，采用石油醚：乙酸乙酯一定的比例作为系统展开剂，挥发性成分分子量比较小时，小分子成分会挥发，所以在硅胶板上看不到明显的斑痕，因此与原提液比较，可间接推断小分子挥发性成分的存在。因此本发明采用薄层色谱间接证明了90％乙醇大孔树脂洗脱液中存在小分子量的挥发性成分。而GC/MS即能证明挥发性成分的存在，还可以通过计算机与数据库的标准谱对照的组分，根据质谱碎片规律进行解析，并参考有关文献数据加以确认复挥发性成分的每个成分的结构分析及分子量确定。因此本发明采用GC/MS确定了辣蓼挥发性成分均为小分子成分，还初步确定了部分成分的结构，为挥发油的药理作用提供了充分的依据。

目前挥发油的常用提取分离方法包括：

(1)提取方法：包括水蒸气蒸馏、有机溶剂浸取法、冷压法，其中水蒸气蒸馏利用挥发油的挥发性和水不相混溶的性质进行的提取。通过加热使挥发油从其他物质中分离出来，这也是从植物中提取挥发油最常用的方法；有机溶剂浸取法是针对不宜用水蒸气蒸馏法提取的原料，可以直接用有机溶剂进行提取；如采用油脂类吸收挥发油，常常用来提取贵重的挥发油，如玫瑰油等。用石油醚、***等有机溶剂，采用连续回流提取法或冷浸法进行提取；还有也是比较常用的就是二氧化碳超临界流体萃取法用于提取挥发油，具有防止氧化、热解及提高品质的突出优点；冷压法适用于含油量较高的新鲜植物药材的提取，通常将压榨后的药材再用水蒸气蒸馏法提取残留挥发油。

(2)分离方法：包括冷冻处理、分馏法、化学分离法、层析分离法等，其中冷冻处理是将挥发油置于0℃以下或-20℃使析出结晶，取出结晶再经重结晶可得纯品；如薄荷脑；分馏法是以各物质的沸点作为分离的依据，常采用减压分馏法分离挥发性成分；化学分离法根据挥发油中各组分所连的官能团不同，选择适当的化学方法处理，使各组分达到分离的方法；层析分离法包括吸附色谱法：一般是将分馏法或化学分离法得到的部位用吸附色谱法进一步分离；硝酸银络合薄层：依据其双键的数目和位置的不同，与硝酸银形成π-络合物的难易及稳定性的差异进行分离；其他色谱：制备性气-液色谱法；制备性薄层色谱。

申请人通过大量实验验证，采用传统的提取分离方法对辣蓼挥发油进行提取分离，得到挥发油不具有治疗抗炎镇痛的活性。因此，需要结合辣蓼挥发油的特性，以辣蓼挥发油的抗炎镇痛的活性为指标，筛选一种适宜的挥发油提取分离方法。

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本发明的目的在于提供一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法，得到的挥发油抗炎镇痛活性效果显著。解决现有技术中采用传统挥发油提取分离方法无法复制到辣蓼挥发油的提取分离的问题，并利用薄层色谱，GC/MS等色谱方法证明了挥发性成分的组成。

为实现上述目的，本发明主要采用的技术方法是利用大孔树脂、酸性阳离子树脂吸附法洗脱得到辣蓼挥发油，通过利用小鼠急性软组织挫伤模型对其抗炎镇痛活性进行验证，并利用薄层色谱和GC/MC对挥发性成分进行初步判断。得出该技术方法可行实用。该技术方案的具体步骤包括：

A.制备辣蓼乙醇浸提物:将新鲜或干燥辣蓼粉碎后，按辣蓼重量的5-10倍加入质量分数 75％的乙醇浸泡20-24h,然后使用超声提取30-60min，提取后采用纱布过滤，将滤液加水稀释到乙醇质量分数为40-50％，得到辣蓼乙醇浸提物；

B.过柱纯化洗脱：首先对DPH系列大孔树脂或D061系列强酸性阳离子树脂进行预处理，其次将步骤A中得到的辣蓼乙醇浸提物，经DPH100大孔树脂或D061系列强酸性阳离子树脂，先采用纯水洗去叶绿素及大极性物质至洗脱液无色，然后采用质量分数40％的乙醇洗脱至洗脱液无色；

C.收集辣蓼挥发油：将步骤B洗脱好的柱子加入质量分数为90％的乙醇继续洗脱，收集洗脱液，经洗脱至1.2个柱体积后，此后收集的液体为辣蓼挥发油。

其中步骤A中制备辣蓼乙醇浸提物中超声波功率为400-600W。步骤B中大孔树脂的预处理方法：将新购大孔树脂DPH系列经无水乙醇浸泡后上柱，纯水洗至水无乙醇，用真空泵将树脂柱中水分抽干；强酸性阳离子树脂的预处理处理：采用质量分数为5％氢氧化钠溶液洗脱后，然后纯水洗至中性，然后采用质量分数为10％乙酸溶液洗脱，再纯水洗脱至中性，用真空泵将树脂柱中水分抽干。

采用上述方法制备的辣蓼挥发油对小鼠急性软组织挫伤具有治疗作用，能够抑制小鼠二甲苯致炎症作用，应用其开发成治疗跌打损伤的药物。

采用上述方法制备的辣蓼挥发油的薄层色谱经石油醚：乙酸乙酯为5:1的展开剂展开后，经5％乙醇硫酸溶液显色后，与80％乙醇超生提取液比较，90％乙醇洗脱挥发油不具备原提取液除原点以外的薄层斑点。

采用上述方法制备的辣蓼挥发油的GC-MS与80％超声波浸提液GC/MS挥发性成分比较，该挥发油具有的挥发油性成分与80％超声波浸提液GC/MS挥发性成分一致，均为小分子成分，且该挥发性成分经大孔树脂洗脱后成分较80％超声波浸提液少，达到了洗脱除杂的效果。

为了验证该方法的可行性，通过设计动物实验确认辣蓼挥发油治疗小鼠抗炎镇痛活性，利用小鼠急性软组织挫伤模型对其抗炎镇痛活性进行验证，具体实验方案如下：

(1)辣蓼挥发油抗炎镇痛活性实验

实验设计：将昆明种小鼠50只雌雄各半分为5组，分别为辣蓼超声浸提液组(稀释至含乙醇浓度为40％)、辣蓼90％乙醇洗脱组(大孔树脂洗脱后将其稀释至含乙醇为40％)、辣蓼 90％乙醇洗脱组(阳离子树脂洗脱稀释至含乙醇为40％)、阳性对照(云南白药组，未经稀释)、空白组(给予生理盐水)。

急性软组组挫伤模型建立：将昆明种小鼠后臀部5％硫化钠脱毛后用50g砝码20cm高处自由下落打击60下至小鼠患处出现红肿。于造模24h后将小鼠随机分为空白组、给药组，空白组给予生理盐水涂抹患处，各给药组给予相应药液，每天按时给药3次，连续给药3d。于造模后第5天处死小鼠，解剖小鼠。

实验结果表明：90％的乙醇大孔树脂及酸性阳离子树脂洗脱挥发油具有对小鼠急性软组织挫伤及二甲苯至小鼠炎症有很好的治疗作用，给药第二天、第三天小鼠基本无红肿、无淤青。解剖小鼠患处发现，挥发油组小鼠患处无红肿、瘀血、炎症浸出物。与空白组比较，差异极显著(P<0.01)。具体见表1

表1不同方法提取辣蓼挥发油治疗小鼠跌打损伤得分(n＝10)

与空白组比较，^*P<0.05,^**P<0.01

(2)抑制小鼠二甲苯致炎症作用

二甲苯致小鼠炎症模型建立，采用50只昆明小鼠雌雄各半，随机分为5组，辣蓼原乙醇浸提液组、辣蓼90％乙醇洗脱组(大孔树脂洗脱)、辣蓼90％乙醇洗脱组(阳离子树脂洗脱)、阳性对照(云南白药组)、空白组(给予生理盐水)。每组10只小鼠。各组小鼠腹部涂抹药液，每天3次，连续给药7天，于第7天最后一次给药30min后，每只小鼠右耳均匀涂抹30微升二甲苯，2h后处死小鼠，剪下小鼠双耳，用8mm打孔器取双耳同样面积大小组织称重，计算左右耳两侧面积之并计算肿胀率。

实验结果表明，辣蓼原提液(稀释至含乙醇浓度40％)、大孔树脂90％乙醇洗脱液(稀释至含乙醇浓度40％)、阳离子90％乙醇洗脱液(稀释至含乙醇浓度40％)对二甲苯致炎症有抑制作用，其作用效果是大孔树脂洗脱部分效果优于阳离子树脂洗脱部分，优于原提液的作用效果，三者作用效果均显著高于空白组(P<0.05或P<0.01)，具体数据见表2。

表2不同处理的辣蓼挥发油对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(n＝10)

与空白组比较，^*P<0.05,^**P<0.01

从外观上观察，给药三天后，空白组患处还能见红肿、还有大量淤青，外观观察愈合程度接近70％。云南白药组及辣蓼各给药组红肿消失，云南白药组有少量淤青，辣蓼原提取液稀释组要稍微肿胀，大孔树脂洗脱及阳离子树脂洗脱辣蓼挥发油组无淤青，阳离子树脂组有少量红肿，辣蓼原提取液组有少量淤青。从外观上观察愈合程度大90％以上，具体见附图1。其中图 1中A1：空白组第一天，A3空白组第三天；B1：阳性对照云南白药组第一天,B3：阳性对照云南白药组第三天；C1：DPH100大孔树脂组第一天,C3：DPH100大孔树脂组第三天；D1：酸性阳离子树脂组第一天,D3：酸性阳离子树脂组第三天；E1：辣蓼原提取液组第一天,E3：辣蓼原提取液组第三天。

为了验证该方法的可行性，制备所得的物质为小分子挥发性成分，本发明采用薄层色谱和 GC/MS对超声波浸提原液和90％乙醇大孔树脂洗脱液进行成分比较和鉴别，薄层色谱采用硅胶G254标准板，采用石油醚：乙酸乙酯(5:1)展开系统，经紫外360nm显色，辣蓼超声浸提原液在原点处有黄色荧光，而90％乙醇原点处无荧光，采用5％乙醇硫酸显色后，辣蓼90％乙醇与40％乙醇不具有超声浸提液大分子成分的挥发性斑迹，小分子挥发性成分会随溶剂蒸发，因此不显示挥发性成分的斑点。可初步推断90％乙醇洗脱为小分子挥发性成分，薄层色谱图见图2。

为了进一步验证90％乙醇洗脱部分为小分子挥发性成分，本发明采用GC/MS对辣蓼超声浸提原液和90％乙醇洗脱进行成分分析，所采用的色谱条件为：仪器：HP6890/5975CGC/MS 联用仪(美国安捷伦公司)。色谱柱为FLM-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，初始温度 40℃(保持2min)，以5℃/min升温至325℃后，以8℃/min升温至310℃后，保持9min，运行时间：56min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999％)；柱前压7.65psi，载气流量1.0mL/min，分流，分流比10:1，溶剂延迟时间：6.0min。

离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1894V；接口温度280℃；质量范围29～450amu。

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist05和Wiley275标准质谱图，确定了12种挥发性化学成分，其中未知成分有9种，辣蓼90％乙醇洗脱部分具有6个挥发性成分，有4个未知成分，90％乙醇洗脱的6个成分分别能能与辣蓼原超声总提液一致，其分子两都分别在320左右，为挥发性小分子成分。用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数，见表3所示。

表3辣蓼80％乙醇超声浸提液与经大孔树脂90乙醇洗脱液GCMS成分对比表

附图说明

图1不同给药组小鼠患处红肿淤青愈合程度对比图

图2大空树脂洗脱液与超声浸提液挥发性成分的薄层色谱图；其中40％表示大孔树脂洗脱部分，原代表超声浸提总液，90％表示大孔树脂90％乙醇洗脱部分。

具体实施方式

实施例1

一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法的操作步骤：

A.制备辣蓼乙醇浸提物:将新鲜或干燥辣蓼粉碎后，按辣蓼重量的5倍加入质量分数75％的乙醇浸泡24h,然后使用超声提取30min，提取后采用布氏漏斗过滤，将滤液加水稀释到乙醇质量分数为50％，得到辣蓼乙醇浸提物；

B.过柱纯化洗脱：首先对DPH100大孔树脂或强酸性阳离子树脂进行预处理，其次将步骤A中得到的辣蓼乙醇浸提物，经DPH100大孔树脂或强酸性阳离子树脂，先采用纯水洗去叶绿素及大极性物质至洗脱液无色，然后采用质量分数10％的乙醇洗脱至洗脱液无色，然后采用质量分数40％的乙醇洗脱至洗脱液无色；

C.收集辣蓼挥发油：将步骤B洗脱好的柱子加入质量分数为90％的乙醇继续洗脱，收集洗脱液，每隔10mL收集一段，收集到3段后，此后收集的液体为辣蓼挥发油。

其中步骤A中制备辣蓼乙醇浸提物中超声波功率为600W。步骤B中大孔树脂的预处理方法：将新购大孔树脂DPH系列经无水乙醇浸泡后上柱，纯水洗至水无乙醇，用真空泵将树脂柱中水分抽干；强酸性阳离子树脂的预处理处理：采用质量分数为5％氢氧化钠溶液洗脱后，然后纯水洗至中性，然后采用质量分数为10％乙酸溶液洗脱，再纯水洗脱至中性，用真空泵将树脂柱中水分抽干。

实施例2

一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法的操作步骤：

A.制备辣蓼乙醇浸提物:将新鲜或干燥辣蓼粉碎后，按辣蓼重量的10倍加入质量分数75％的乙醇浸泡20h,然后使用超声提取60min，提取后采用布氏漏斗过滤，将滤液加水稀释到乙醇质量分数为40％，得到辣蓼乙醇浸提物；

B.过柱纯化洗脱：首先对DPH系列大孔树脂或强酸性阳离子树脂进行预处理，其次将步骤A中得到的辣蓼乙醇浸提物，经DPH系列大孔树脂或强酸性阳离子树脂，先采用纯水洗去叶绿素及大极性物质至洗脱液无色，然后采用质量分数40％的乙醇洗脱至洗脱液无色；

C.收集辣蓼挥发油：将步骤B洗脱好的柱子加入质量分数为90％的乙醇继续洗脱，收集洗脱液，经1.2个柱体积后，此后收集的液体为辣蓼挥发油。

其中步骤A中制备辣蓼乙醇浸提物中超声波功率为400W。步骤B中大孔树脂的预处理方法：将新购大孔树脂DPH100经无水乙醇浸泡后上柱，纯水洗至水无乙醇，用真空泵将树脂柱中水分抽干；强酸性阳离子树脂的预处理处理：采用质量分数为5％氢氧化钠溶液洗脱后，然后纯水洗至中性，然后采用质量分数为10％乙酸溶液洗脱，再纯水洗脱至中性，用真空泵将树脂柱中水分抽干。

实施例3

一种采用大孔树脂富集辣蓼挥发油的方法的操作步骤：

A.制备辣蓼乙醇浸提物:将新鲜或干燥辣蓼粉碎后，按辣蓼重量的8倍加入质量分数75％的乙醇浸泡22h,然后使用超声提取50min，提取后采用布氏漏斗过滤，将滤液加水稀释到乙醇质量分数为45％，得到辣蓼乙醇浸提物；

B.过柱纯化洗脱：首先对DPH系列大孔树脂或强酸性阳离子树脂进行预处理，其次将步骤A中得到的辣蓼乙醇浸提物，经DPH100大孔树脂或强酸性阳离子树脂，先采用纯水洗去叶绿素及大极性物质至洗脱液无色，然后采用质量分数10％的乙醇洗脱至洗脱液无色，然后采用质量分数40％的乙醇洗脱至洗脱液无色；

C.收集辣蓼挥发油：将步骤B洗脱好的柱子加入质量分数为90％的乙醇继续洗脱，收集洗脱液，每隔10mL收集一段，收集到4段后，此后收集的液体为辣蓼挥发油。

其中步骤A中制备辣蓼乙醇浸提物中超声波功率为500W。步骤B中大孔树脂的预处理方法：将新购大孔树脂DPH100经无水乙醇浸泡后上柱，纯水洗至水无乙醇，用真空泵将树脂柱中水分抽干；强酸性阳离子树脂的预处理处理：采用质量分数为5％氢氧化钠溶液洗脱后，然后纯水洗至中性，然后采用质量分数为10％乙酸溶液洗脱，再纯水洗脱至中性，用真空泵将树脂柱中水分抽干。