阅读说明：本技术 一种具有两亲性淀粉纳米粒子及其制备方法 (Starch nano particle with amphipathy and preparation method thereof ) 是由 黄强 李松南 孙瑞云 张斌 扶雄 于 2019-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有两亲性淀粉纳米粒子及其制备方法,包括如下步骤：(1)将淀粉原料用醋酸-醋酸钠缓冲溶液配成淀粉浆液,并调节pH至4.5～6.5,沸水浴糊化后,冷却至酶适温度,加入脱支酶持续搅拌,再沸水浴加热,然后离心分层,获得上清液为短直链淀粉分散液；将蛋白溶解于乙醇水溶液中,搅拌使其充分溶解,制得蛋白分散液；(2)将蛋白分散液逐滴滴加到短直链淀粉分散液中,充分混合后持续搅拌,离心分层,将所得上清液进行重结晶,真空浓缩或离心,干燥后即得到具有两亲性的淀粉纳米粒子。该发明工艺简单,产品呈现纳米级球形,粒径范围在200～500nm,接触角为72～81°,可用于食品级微胶囊壁材、乳化剂和药物递送载体。(The invention discloses an amphiphilic starch nanoparticle and a preparation method thereof, and the preparation method comprises the following steps: (1) preparing starch slurry from a starch raw material by using an acetic acid-sodium acetate buffer solution, adjusting the pH to 4.5-6.5, gelatinizing in a boiling water bath, cooling to an enzyme proper temperature, adding debranching enzyme, continuously stirring, heating in the boiling water bath, and then centrifuging and layering to obtain a supernatant which is a short straight-chain starch dispersion liquid; dissolving protein in ethanol water solution, stirring to fully dissolve the protein to prepare protein dispersion liquid; (2) dropwise adding the protein dispersion into the short amylose dispersion, fully mixing, continuously stirring, centrifuging, layering, recrystallizing the obtained supernatant, concentrating in vacuum or centrifuging, and drying to obtain the starch nanoparticles with amphipathy. The method is simple in process, the product is in a nano-scale spherical shape, the particle size range is 200-500nm, the contact angle is 72-81 degrees, and the product can be used for food-grade microcapsule wall materials, emulsifiers and drug delivery carriers.)

一种具有两亲性淀粉纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白复合诱导脱支淀粉重结晶，特别是涉及一种具有两亲性淀粉纳米粒子的制备方法，该方法涉及蛋白复合诱导脱支淀粉重结晶使其自组装，从而得到具有两亲性淀粉纳米粒子的目的，属于食品工业领域。

背景技术

生物基纳米材料，兼具“纳米效应”和“绿色环保”的优点，被广泛应用于生物、材料、化工、食品和医药等领域。淀粉是一种天然无毒的生物大分子，资源丰富、具有生物相容性好和生物可降解等性质，可作为生物基纳米材料的原料。淀粉纳米粒子在材料、医药、食品等领域有诸多潜在应用，如可增强淀粉膜和复合材料的拉伸强度，改善水蒸气透过性，可应用于食品级包装材料中；可附载功能性活性成分，如氟芬那酸(Jain et al.,2008,European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,69(2),426-435)和胰岛素(Santander-Ortega et al.,2010,Journal of Controlled Release,141(1),85-92)，作为给药载体，应用于医药领域；也可作为乳化剂，用于制备食品级乳液体系或脂溶性活性物质递送载体。

目前制备淀粉纳米粒子的方法主要有酸水解法、沉淀法、机械法和微乳液法。酸水解法是在酸性条件下将淀粉颗粒的无定形区水解，从而得到排列紧密的纳米级晶体，但制备时间长、得率较低，需要消耗大量的无机酸(Putaux et al.,2003,Biomacromolecules,4(5), 1198-1202)。沉淀法是将充分溶解的淀粉溶液逐渐加入到非溶剂体系中或反之，使淀粉分子逐渐沉淀形成淀粉纳米粒子，但重结晶过程不好控制，且形成的淀粉纳米粒子团聚现象严重(Chin et al.,2011,Carbohydrate Polymers,86(4),1817-1819；Qin et al.,2016,Industrial Crops and Products,87,182-190)。机械法是通过球磨、均质、挤压、辐照、超声等物理手段将淀粉颗粒的尺寸逐渐减小到纳米级，但对设备要求较高，动力消耗大、处理时间较长 (Song et al.,2011,Carbohydrate Polymers,85(1),208-214；BelHaaj et al.,2013,Carbohydrate Polymers,92(2),1625-1632；Singh et al.,2011,Carbohydrate Polymers,83(4),1521-1528)。微乳液法是通过表面活性剂的乳化将充分溶解的淀粉溶液与之不相容的有机溶液形成均一稳定的油包水乳液，在交联剂的作用下，使水相中的淀粉分子交联形成淀粉纳米粒子从而析出，但对设备的要求比较高、能耗大，引入大量有机试剂(Shi et al.,2011,Carbohydrate Polymers,83(4),1604-1610)。以上这些制备方法，对制备设备要求较高，同时使用过多的无机酸及化学试剂，带来环境问题，而有毒的化学试剂也会使这些淀粉纳米粒子在食品和医药等领域的应用受到限制。

目前制备得到的淀粉纳米粒子多为亲水性，在淀粉分子中引入具有疏水性质的基团，使其兼具亲水和疏水的两亲特性，能够在食品、医药、生物降解材料、化妆品和化工催化等高附加值领域具有更广泛的应用。目前疏水改性淀粉主要集中在辛烯基琥珀酸淀粉酯(OS淀粉)，由辛烯基琥珀酸酐(OSA)与淀粉在碱性条件下反应形成的一种化学改性淀粉。具有两亲性的OS淀粉，可附载疏水性活性物质，作为其口服递送的载体；可作为食品乳化剂和增稠剂，应用于微胶囊包埋和饮料香精等领域；可替代来源有限、品质不稳定的***胶，缓解我国对进口***胶的依赖程度；可作为流动性粉末载体，逐步替代面粉工业中传统使用的磷酸钙盐、滑石粉的使用；具有慢消化性质，可作为一种低GI的食品辅料；可与润滑油混合进行轻纱上浆，提高纺织性能和上浆能力。但美国食品和药物管理局(FDA)规定食品中OS淀粉制备过程中的OSA添加量不能高于3％，取代度不超过0.02，限制了高取代的OS淀粉在食品领域应用。而且OS淀粉在制备过程中、水相分散系中淀粉与长链疏水酸酐进行酯化非均相反应，导致其取代度低和反应效率低，改进方法中引入的有机试剂和其他物理方式或酶制剂预处理，无疑增加了其安全性和生产成本的问题，因此，发明一种“绿色”、“环保”和“简单”的具有两亲性淀粉纳米粒子的制备方法显得尤为重要。

发明内容

本发明目的在于提供一种工艺简单、原料来源丰富、绿色环保的两亲性淀粉纳米粒子制备方法，所得产品呈现纳米级球形，粒径范围在200～500nm，接触角为72～81°，可用作食品级微胶囊壁材、乳化剂和药物递送载体，应用于食品、化妆品和医药等领域。

本发明的技术方案是先将淀粉原料在沸水浴中充分糊化后，在酶适条件下加入脱支酶进行酶解，沸水浴再次加热，中速离心分层，沉淀为长直链淀粉和失活脱支酶，上清液为短直链淀粉分散液。通过逐滴滴加蛋白乙醇水分散液到短直链淀粉分散液中，充分混合后持续搅拌，低速离心分层，沉淀为未复合上的较长链的短直链淀粉和蛋白聚集体，上清液为短直链淀粉与蛋白复合溶液。最后将短直链淀粉与蛋白复合溶液在一定条件下进行自组装重结晶，真空浓缩或离心，干燥后即可得到具有两亲性的淀粉纳米粒子。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种具有两亲性淀粉纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)短直链淀粉和蛋白分散液的制备

将淀粉原料用醋酸-醋酸钠缓冲溶液配成干基质量分数为5～15％的淀粉浆液，并调节 pH至4.5～6.5，沸水浴糊化后，冷却至酶适温度，加入脱支酶，持续搅拌，再沸水浴加热，然后离心分层，上清液即为短直链淀粉分散液；

将蛋白溶解于乙醇水溶液中，持续搅拌使其充分溶解，制得蛋白分散液；

(2)将蛋白溶液逐滴滴加到短直链淀粉分散液中，充分混合后持续搅拌，离心分层，将所得上清液进行重结晶，真空浓缩或离心，干燥后即得到具有两亲性的淀粉纳米粒子。

优选地，步骤(1)中，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的摩尔浓度为0.05～0.2mol/L；所述淀粉原料为蜡质玉米淀粉、普通玉米淀粉或木薯淀粉。

优选地，步骤(1)中，所述沸水浴糊化时间为0.5～2h，冷却温度至45～65℃；脱支酶添加量为35～55U/g，基于干基淀粉质量计。

优选地，步骤(1)短直链淀粉分散液的制备中，所述搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，搅拌时间为12～24h；所述沸水浴加热时间为1～2h；所述离心力为5000～10000g，离心时间为10～20min。

优选地，步骤(1)中，所述蛋白为玉米醇溶蛋白、大豆分离蛋白或花生蛋白；所述乙醇水溶液的体积分数为60～80％。

优选地，步骤(1)蛋白溶液的制备中，所述蛋白为5～20质量份溶解于100体积份的乙醇水溶液；所述搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，搅拌时间为1～2h。

优选地，步骤(2)中，所述短直链淀粉分散液为1～4体积份，蛋白溶液为1～2体积份；所述搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，搅拌时间为2～4h；所述离心力为3000～5000g，离心时间为5～15min。

优选地，步骤(2)中，所述重结晶温度为4～25℃，重结晶时间为12-24h；所述干燥方式为冷冻干燥或鼓风干燥，干燥时间为24～48h。

上述方法制备的具有两亲性的淀粉纳米粒子呈现纳米级球形，粒径范围在200～500nm，接触角为72～81°。

本发明是先将淀粉原料在沸水浴中充分糊化后，在酶适条件下加入脱支酶进行酶解，沸水浴加热，中速离心分层，沉淀为长直链淀粉和失活脱支酶，上清液即为短直链淀粉分散液。通过逐滴滴加蛋白乙醇分散液到短直链淀粉分散液中，充分混合后持续搅拌，低速离心分层，沉淀为未复合上的较长链的短直链淀粉和蛋白聚集体，上清液为短直链淀粉与蛋白复合溶液。最后将短直链淀粉与蛋白复合溶液在一定条件下进行自组装重结晶，真空浓缩或离心，干燥后即可得到具有两亲性的淀粉纳米粒子。

本发明与现有技术相比，其优点在于：

1)本发明方法基于淀粉酶解脱支和蛋白复合诱导重结晶的原理，通过滴加蛋白乙醇水分散液到短直链淀粉分散液中，充分混合后持续搅拌，低速离心分层，沉淀为未复合上的较长链的短直链淀粉和蛋白聚集体，上清液中短直链淀粉与蛋白复合溶液进行自组装重结晶，从而达到制备具有两亲性淀粉纳米粒子的目的。该方法区别于传统疏水改性的化学方法和淀粉纳米粒子的制备方法(酸水解法、沉淀法、机械法和微乳液法)，改性过程中不引入有机试剂和其他物理方式或酶制剂预处理，改性程度随着蛋白复合率的增加而增加且不受FDA限量限制，该方法制备简单、对仪器设备要求较低、生产成本低、安全环保，是一种新型两亲性淀粉纳米粒子的制备方法。

2)本发明所得淀粉纳米粒子呈现纳米级球形，粒径范围在200～500nm，接触角为72～81°，是一种两亲性淀粉纳米粒子，可用作食品级微胶囊壁材、乳化剂和药物递送载体，应用于食品、化妆品和医药等领域。

3)本发明以不同来源的淀粉和蛋白为原料，通过淀粉酶解脱支和蛋白复合诱导重结晶的方法，工艺简单、原料来源丰富、绿色环保，是一种兼具两亲性淀粉纳米粒子的制备方法。

附图说明

图1为对比实施例条件下制备的普通淀粉纳米粒子的扫描电子显微镜图(a)、粒径分布图(b)和接触角图(c)。

图2为实施例1条件下制备的具有两亲性淀粉纳米粒子的扫描电子显微镜图(a)、粒径分布图(b)和接触角图(c)。

图3为实施例2条件下制备的具有两亲性淀粉纳米粒子的扫描电子显微镜图(a)、粒径分布图(b)和接触角图(c)。

图4为实施例3条件下制备的具有两亲性淀粉纳米粒子的扫描电子显微镜图(a)、粒径分布图(b)和接触角图(c)。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不仅仅局限于实施例表述的范围。实施例中有关测试方法说明如下：

颗粒微观结构分析：将测试样品均匀分散于样品台的双面导电胶上，喷金仪器进行喷金后，在Carl Zeiss EVO 18型扫描电子显微镜中观察测试样品的微观结构。

颗粒粒径分布测定：将测试样品配制成0.01％的水分散液，超声分散1min后，置于英国Malvern公司MPT-2型激光纳米粒度仪中进行粒径分析。淀粉颗粒的折射率和吸收率分别设置为1.52和0.01，分散剂水的折射率设置为1.33。

颗粒两亲性分析：固体颗粒的两亲性通过测定其在油水界面的三相接触角θ来表征。当θ小于90°时，颗粒具有亲水性；当θ接近90°时，固体颗粒具有两亲性，在油水界面的吸附能最大，乳化效果最佳；当θ大于90°时，颗粒呈现出疏水性。

测试步骤如下：将测试样品用压片机制成片状(2mm厚和13mm直径)，后将其浸没于OCA 20装置的大豆油样品台中，使用高精度注射器系统将2μL水滴滴加在片剂表面，通过安装在OCA 20上的高速摄像机以10帧/秒的速度记录水滴形状的演变过程，将液滴的轮廓数据自动拟合到LaPlace-Young方程中以测定颗粒的接触角。

对比实施例

普通淀粉纳米粒子的制备，包括如下步骤：

(1)将蜡质玉米淀粉用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液配成干基质量分数为15％的淀粉浆液，并调节pH至5，沸水浴糊化1h后，冷却至55℃，根据干基淀粉质量加入40U/g 的脱支酶，持续搅拌24h后，沸水浴加热1h后，8000g离心20min分层，上清液即为短直链淀粉分散液；

(2)直接往2份步骤(1)所得的短直链淀粉分散液中逐滴滴加1份70％的乙醇水溶液，充分混合，持续搅拌2h后，4000g离心10min分层，置于25℃下重结晶24h，真空浓缩，冷冻干燥后即可得到普通淀粉纳米粒子。

经测试，上述步骤所得普通淀粉纳米粒子呈现纳米级球形，但纳米粒子之间团聚现象较为严重(图1a)，这可能与其较强的亲水性从而氢键相互吸引导致的。普通淀粉纳米粒子的粒径分布分别在200-500nm和700-1100nm处出现双峰(图1b)，也能说明其颗粒团聚现象；其接触角为46°(图1c)，说明其较强的亲水性。

实施例1

具有两亲性淀粉纳米粒子的制备，包括如下步骤：

(1)将蜡质玉米淀粉用0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液配成干基质量分数为15％的淀粉浆液，并调节pH至5，沸水浴糊化1h后，冷却至55℃，根据干基淀粉质量加入45U/g 的脱支酶，持续搅拌24h后，沸水浴加热1h后，6000g离心20min分层，上清液即为短直链淀粉分散液；

将5份玉米醇溶蛋白溶解于100份体积分数为70％的乙醇水溶液中，持续搅拌1h使其充分溶解；

(2)将1体积份(1)所得的玉米醇溶蛋白溶液逐滴滴加到2体积份步骤(1)所得的短直链淀粉分散液中，充分混合，持续搅拌2h后，3000g离心15min分层，置于25℃下重结晶24h，真空浓缩，冷冻干燥后即可得到两亲性淀粉纳米粒子。

经测试，所得淀粉纳米粒子呈现纳米级球形，平均粒径为256nm，接触角为81°，是一种具有两亲性的淀粉纳米粒子，如图2所示。

实施例2

具有两亲性淀粉纳米粒子的制备，包括如下步骤：

(1)将普通玉米淀粉用0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液配成干基质量分数为10％的淀粉浆液，并调节pH至5，沸水浴糊化2h后，冷却至55℃，根据干基淀粉质量加入55U/g 的脱支酶，持续搅拌24h后，沸水浴加热2h后，10000g离心10min分层，上清液即为短直链淀粉分散液；

将5份大豆分离蛋白溶解于100份体积分数为70％的乙醇水溶液中，持续搅拌2h使其充分溶解；

(2)将1份(1)所得的大豆分离蛋白溶液逐滴滴加到2份步骤(1)所得的短直链淀粉分散液中，充分混合，持续搅拌2h后，5000g离心5min分层，置于25℃下重结晶24h，真空浓缩，鼓风干燥后即可得到两亲性淀粉纳米粒子。

经测试，所得淀粉纳米粒子呈现纳米级球形，平均粒径为295nm，接触角为77°，是一种具有两亲性的淀粉纳米粒子，如图3所示。

实施例3

具有两亲性淀粉纳米粒子的制备，包括如下步骤：

(1)将木薯淀粉用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液配成干基质量分数为15％的淀粉浆液，并调节pH至5，沸水浴糊化1h后，冷却至55℃，根据干基淀粉质量加入35U/g的脱支酶，持续搅拌24h后，沸水浴加热1h后，8000g离心20min分层，上清液即为短直链淀粉分散液；

将10份花生蛋白溶解于100份体积分数为70％的乙醇水溶液中，持续搅拌2h使其充分溶解；

(2)将1份(1)所得的花生蛋白溶液逐滴滴加到3份步骤(1)所得的短直链淀粉分散液中，充分混合，持续搅拌4h后，4000g离心10min分层，置于4℃下重结晶24h，真空浓缩，冷冻干燥后即可得到两亲性淀粉纳米粒子。

经测试，所得淀粉纳米粒子呈现纳米级球形，平均粒径为270nm，接触角为72°，是一种具有两亲性的淀粉纳米粒子，如图4所示。