一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法
阅读说明：本技术 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus European strain nucleic acid standard substance and preparation method thereof ) 是由 原霖 王传彬 杨林 宋晓晖 董浩 徐波 汪葆玥 毕一鸣 李晓霞 王睿男 刘洋 于 2018-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法。该方法包括如下步骤：制备猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液,灭活,得到灭活的病毒液；然后将灭活的病毒液和保护剂混合,冻干或真空干燥；保护剂中含有甘露醇、BSA、海藻糖、蔗糖和甘氨酸；最后通过均匀性评估、稳定性评估和定值,得到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质。猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质不仅可用于评价检测试剂和控制检测质量,还为检测研究、医药研究、应用研究提供了核酸标准物质的需求,同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。本发明具有重大的应用价值。(The invention discloses a porcine reproductive and respiratory syndrome virus European strain nucleic acid standard substance and a preparation method thereof. The method comprises the following steps: preparing virus liquid of European strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, and inactivating to obtain inactivated virus liquid; then mixing the inactivated virus solution and a protective agent, and freeze-drying or vacuum-drying; the protective agent contains mannitol, BSA, trehalose, sucrose and glycine; and finally, obtaining the European strain nucleic acid standard substance of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus through uniformity evaluation, stability evaluation and definite value. The nucleic acid standard substance of the European strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus can be used for evaluating a detection reagent and controlling the detection quality, provides the requirements of the nucleic acid standard substance for detection research, medical research and application research, and provides technical support for technical guidance of inspection and quarantine organizations and service export enterprises. The invention has great application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质即猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准样品。
背景技术
WHO于1997年发布了丙型肝炎核酸国际标准物质，到目前为止已发布同类标准物质16种。我国核酸标准物质研制起步较晚，在国家标准物质资源共享平台可查询到的核酸标准物质仅有5种，涉及微生物及转基因植物。近年来，研制动物病原核酸标准物质也有报道，主要为禽流感、新城疫和亚洲I型***病毒核酸等。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。PRRSV分为欧洲型和美洲型两种基因型，美洲型又分为经典美洲株和高致病性美洲株两种基因亚型，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的是美洲型毒株，欧洲型毒株也偶有发现。PRRS在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成养殖业巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。我国农业部发布“一二三类动物疫病病种名录”将PRRS-EU列为二类动物疫病。猪繁殖与呼吸综合征诊断方法(GB/T 18090-2008)中规定采用RT-PCR方法对PRRSV-EU进行检测，但目前尚无相应的核酸标准物质可用，无法评价检测试剂和控制检测质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质。
本发明首先提供了一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的方法，可包括如下步骤：
(1)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液；
(2)取步骤(1)制备的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活的病毒液，保存，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质。
所述步骤(1)依次可包括如下步骤：
(1-1)培养Marc-145细胞或PAM细胞；
(1-2)接种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株，培养；
(1-3)反复冻融；
(1-4)离心，收集上清液；
步骤(1-4)中收集的上清液即为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液。
步骤(1-1)中，所述Marc-145细胞具体可为ATCC的产品。
步骤(1-1)中，所述培养具体可为37℃、5％CO2培养。
步骤(1-1)中，所述培养的培养体系细胞初始浓度可为2×104-2×106CELLS/mL(如2×104-2×105CELLS/mL、2×105-2×106CELLS/mL、2×104CELLS/mL、2×105CELLS/mL或2×106CELLS/mL)。
步骤(1-1)中，所述培养的培养体系细胞初始浓度具体可为2×105CELLS/mL。
步骤(1-2)中，所述培养的时间可为24h-72h(如24h-48h、48h-72h、24h、48h或72h)。
步骤(1-2)中，所述接种的初始浓度为105TCID50/mL。
步骤(1-2)中，所述培养直至CPE达到70％-80％(如70％-75％、75％-80％、70％、75％或80％)。
步骤(1-3)中，所述反复冻融的次数可为2-4次(如2次、3次或4次)。
步骤(1-3)中，所述反复冻融的次数具体可为3次。
步骤(1-4)中，所述离心具体可为1000r/min离心。
所述步骤(2)中，所述灭活可为热灭活或化学灭活。
所述热灭活的条件可为50-60℃(如50-56℃、56-60℃、50℃、56℃或60℃)处理0.5-4h(如0.5-2h、2-4h、0.5h、2h或4h)。
所述热灭活的条件具体可为56℃处理4h。
所述步骤(3)中，所述保存的方式可为A1)或A2)：
A1)将灭活的病毒液和保护剂混合，然后冻干或真空干燥；所述保护剂中含有甘露醇、BSA、海藻糖、蔗糖和甘氨酸；
A2)将灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA混合。
所述保护剂中可含有15-25％(15-25mg/100mL)(如15-20mg/100mL、20-25mg/100mL、15mg/100mL、20mg/100mL或25mg/100mL)甘露醇、4-6％(4-6mg/100mL)(如4-5mg/100mL、5-6mg/100mL、4mg/100mL、5mg/100mL或6mg/100mL)BSA、1-3％(1-3mg/100mL)(如1-2mg/100mL、2-3mg/100mL、1mg/100mL、2mg/100mL或3mg/100mL)海藻糖、3-5％(3-5mg/100mL)(如3-4mg/100mL、4-5mg/100mL、3mg/100mL、4mg/100mL或5mg/100mL)蔗糖和1-3％(1-3mg/100mL)(如1-2mg/100mL、2-3mg/100mL、1mg/100mL、2mg/100mL或3mg/100mL)甘氨酸。
所述保护剂可为含15-25％(15-25mg/100mL)(如15-20mg/100mL、20-25mg/100mL、15mg/100mL、20mg/100mL或25mg/100mL)甘露醇、4-6％(4-6mg/100mL)BSA、1-3％(1-3mg/100mL)(如1-2mg/100mL、2-3mg/100mL、1mg/100mL、2mg/100mL或3mg/100mL)海藻糖、3-5％(3-5mg/100mL)(如3-4mg/100mL、4-5mg/100mL、3mg/100mL、4mg/100mL或5mg/100mL)蔗糖和1-3％(1-3mg/100mL)(如1-2mg/100mL、2-3mg/100mL、1mg/100mL、2mg/100mL或3mg/100mL)甘氨酸的水溶液。
所述保护剂具体可为含20％(20mg/100mL)甘露醇、5％(5mg/100mL)BSA、2％(2mg/100mL)海藻糖、4％(4mg/100mL)蔗糖和2％(2mg/100mL)甘氨酸的水溶液。
所述TE缓冲液可为含0.5-1.5mM(如0.5-1.0mM、1.0-1.5mM、0.5mM、1.0mM或1.5mM)EDTA的pH7.5-8.5(如pH7.5-8.0、pH8.0-8.5、pH7.5、pH8.0或pH8.5)、8-12mM(如8-10mM、10-12mM、8mM、10mM或12mM)的Tris-HCl缓冲液。
所述TE缓冲液具体可为含1mM EDTA的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液。
所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”可为1体积份灭活的病毒液和0.5-1.5体积份(如0.5-1.0体积份、1.0体积份、0.5体积份、1.0体积份或1.5体积份)保护剂混合。
所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”具体可为1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合。
所述冻干的参数可为：-20℃－-40℃(如-20℃－-30℃、-30℃－-40℃、-20℃、-30℃或-40℃)冷冻4h－10h(如4h－8h、8h－10h、4h、8h或10h)。
所述真空干燥的参数可为：0.025mbar－0.1mbar(如0.025mbar－0.05mbar、0.05mbar－0.1mbar、0.025mbar、0.05mbar或0.1mbar)条件下，4℃－20℃(如4℃－10℃、10℃－20℃、4℃、10℃或20℃)干燥2h－6h(如2h－4h、4h－6h、2h、4h或6h)。
所述冻干的参数具体可为a1)或a2)或a3)：a1)-40℃冷冻10h；a2)-30℃冷冻8h；a3)-20℃冷冻4h。
所述真空干燥的参数具体可为b1)或b2)：b1)0.025mbar条件下，4℃干燥6h；b2)0.1mbar条件下，20℃干燥2h。
所述A2)中，灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA的配比可为1mL灭活的病毒液、150-250U(如150-200U、200-250U、150U、200U或250U)RNA酶抑制剂、0.5-1.5mL(如0.5-1.0mL、1.0-1.5mL、0.5mL、1.0mL或1.5mL)TE缓冲液和0.03-0.07g(如0.03-0.05g、0.05-0.07g、0.03g、0.05g或0.07g)BSA。
所述A2)中，灭活的病毒液、RNA酶抑制剂、TE缓冲液和BSA的配比具体可为1mL灭活的病毒液、200URNA酶抑制剂、1mL TE缓冲液和0.05g BSA。
上述任一所述的方法还可包括步骤(4)：将步骤(3)得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行病毒灭活检验和支原体检验和病毒检验。
所述病毒灭活检验可使用细胞病变检验。
所述支原体检验可使用支原体检测试剂盒。
所述病毒检验可使用荧光PCR检测试剂盒。
所述支原体检测试剂盒和所述荧光PCR检测试剂盒均可为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的产品。
上述任一所述的方法还可包括步骤(5)：将步骤(3)得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行均匀性评估和稳定性评估。
所述进行均匀性评估的步骤可为：将步骤(3)得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，结果进行均匀性评估。
进行均匀性评估的抽样方法可为抽取10-30个(如30个)猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质。每个样品检测次数具体可为3次。
所述均匀性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法进行均匀性评估。
所述进行稳定性评估的步骤可为：将步骤(3)得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，计算平均值，进行稳定性评估。
所述稳定性评估可为长期稳定性评估或短期稳定性评估。
进行长期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在-20℃保存N1个月、N2个月、N3个月、N4个月或N5个月(N1-N5均为自然数且0≤N1-N5≤14)，抽取不少于2瓶的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，每个样品检测次数具体可为1次。
进行短期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在4℃、25℃或37℃保存2个月、7天或1天，抽取不少于2瓶的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，每个样品检测次数具体可为1次。
所述稳定性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用回归或T检验进行稳定性评估。
上述任一所述提取核酸可采用全自动核酸提取仪进行。
上述任一所述的方法还可包括步骤(6)：将均匀性高且稳定的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度；
由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；
使用统计学方法计算扩展不确定度，包括均匀性评估中引入的不确定度、稳定性评估中引入的不确定度和定值中引入的不确定度。
多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个。统计处理时，需有4-6次独立重复的测量数据。
本发明所提供了一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的方法，具体可包括如下步骤：
(1)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液；
(2)取步骤(1)制备的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活的病毒液，加保护剂保存，进行病毒灭活检验和支原体检验和病毒检验，进行均匀性评估和稳定性评估，进行标准物质定值测定、计算扩展不确定度，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质。
上述任一所述方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质也属于本发明的保护范围。
本发明还保护上述任一所述保护剂。
上述任一所述保护剂在保存猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株具体可为猪繁殖与呼吸综合征病毒LV株。
采用本发明提供的方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，不仅可用于评价检测试剂和实验室质量控制，还为科学研究、疫苗研究、应用研究提供了核酸标准物质的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。本发明具有重大的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的制备
一、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液制备
1、将50mL含2×105CELLS/mL的Marc-145细胞(ATCC的产品)的培养液置于培养箱，37℃、5％CO2静置培养24h。
2、完成步骤1后，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株LV株，得到培养体系。该培养体系中，猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株LV株的浓度为105TCID50/mL。
3、将步骤2得到的培养体系置于培养箱，37℃、5％CO2静置培养至CPE达到70％。
4、取完成步骤3的培养体系，反复冻融3次。
5、取完成步骤4的培养体系，1000r/min离心10min，收集上清液。
步骤5收集的上清液即为制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液。将上清液分装至无菌冻存管，-80℃下保存。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的制备
1、取步骤一制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的病毒液，56℃水浴4h，得到灭活的病毒液。
2、将1mL灭活的病毒液、200U RNA酶抑制剂、1mL TE缓冲液和0.05g BSA混合，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质甲(以下简称核酸标准物质甲)。核酸标准物质甲呈液体状态。
TE缓冲液为含1mM EDTA的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液。
3、将1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合，然后进行冻干(-40℃冷冻10h)或真空干燥(0.025mbar条件下，4℃干燥6h)，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质乙(以下简称核酸标准物质乙)。核酸标准物质乙呈干粉状态。
保护剂为含20％(20mg/100mL)甘露醇、5％(5mg/100mL)BSA、2％(2mg/100mL)海藻糖、4％(4mg/100mL)蔗糖和2％(2mg/100mL)甘氨酸的水溶液。
三、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的检验
猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质为核酸标准物质甲或核酸标准物质乙。
1、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，进行物理性状检验。
实验结果表明，核酸标准物质甲呈无色均一液体，无絮状沉淀物或大块沉淀；核酸标准物质乙为乳白色饼状。
2、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，进行病毒灭活检验。
病毒灭活检验使用细胞病变进行检验。
检测结果：核酸标准物质甲和核酸标准物质乙均无病变。
3、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，进行支原体检验。
支原体检验使用支原体检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的产品)进行检测。
检测结果：核酸标准物质甲和核酸标准物质乙均无条带；无支原体感染。
4、取猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，进行其它病毒检验。
其它病毒检验使用荧光PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的产品)进行检测。
检测结果：猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株产生“S”型扩增曲线，其它病毒均不产生“S”型扩增曲线；无其它病毒感染。
四、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的评估
猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质为核酸标准物质甲或核酸标准物质乙。
1、均匀性评估
(1)抽取30个猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质。
(2)采用全自动核酸提取仪提取样品的核酸。
(3)使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测3次，计算平均值。
(4)根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行均匀性评估。
2、长期稳定性评估(即在规定贮存条件下的稳定性)
(1)抽取不少于2瓶的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，在-20℃保存0-14个月。
(2)采用全自动核酸提取仪提取样品的核酸。
(3)使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测2次，计算平均值。
(4)根据抽样方法和检测次数，使用回归对猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行长期稳定性评估。
3、短期稳定性评估(即在运输过程中的稳定性)
(1)抽取不少于2瓶的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，分别在4℃、25℃或37℃保存2个月、7天或1天。
(2)采用全自动核酸提取仪提取样品的核酸。
(3)使用数字PCR方法进行检测，每个样品检测1次。
(4)根据抽样方法和检测次数，使用回归对猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行短期稳定性评估。
五、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的定值
将步骤四中均匀性高且稳定的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度。
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的标准值
取步骤四中均匀性高且稳定的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质，由多个独立实验室使用数字PCR方法提供一系列核酸标准物质的特征值，对数据进行统计处理，合作确定标准值。
多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个。
所述核酸标准物质的特征值，是指对于5个核酸标准物质，每个物质重复2次，提供10个特征值。
组内可疑值检验：对每组独立测量结果，用适当的统计学方法，如格拉布斯法、狄克逊法、t检验法等，结合技术上的判断，剔除可疑值。
组间数据等精度检验：对各组数据的标准偏差用科克伦法或F检验法进行等精度检验，对有显著性差异的数据组在进行技术审查后再决定是否予以剔除。
当各组数据等精度时，检验各组数据平均值是否有显著性差异。如平均值无显著性差异，先合并数据再用适当的方法检验数据分布的正态性，在符合正态分布的情况下，可将两个或多个平均值再次计算平均值，求出总平均值，即为标准值。
2、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的扩展不确定度
使用统计学方法计算猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质的扩展不确定度，包括步骤四中1均匀性评估中引入的不确定度、步骤四中2或3稳定性评估中引入的不确定度和定值过程中引入的不确定度。
(1)均匀性评估引入的不确定度的评定
均匀性评估引入的不确定度包括试剂盒的精密度、仪器的精密度和人员操作所引入的不确定度，为A类不确定度。其中由核酸标准物质均匀性产生的标准偏差sbb为：
所以均匀性评估引入的不确定度为：ubb＝sbb
(2)稳定性评估引入的不确定度的评定
稳定性评估引入的不确定度也涵盖了储存温度的变动性对核酸标准物质的影响、试剂盒稳定性引入的不确定度和人员操作引入的不确定度，为A类不确定度。
在产品进行稳定性评估时，对保存在(-20±5)℃环境中的样本，每个月检测一次。每次检测结束后，对数据进行处理，计算其斜率、截距和不确定度。暂定产品有效期为12个月，则有效期t＝12个月的稳定性不确定度贡献为：
us＝s(β1)·X
(3)定值过程引入的不确定度的评定
不确定度A类评定通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计学计算方法进行。由定值测量重复性引入的不确定度u(A)由测量的相对标准偏差计算：
(4)标准值的不确定度的评定
合成上述核酸标准物质的不确定度分量，取扩展因子k＝2，计算扩展不确定度。核酸标准物质合成标准不确定度计算公式如下：
标准值的扩展不确定度：UCRM＝k×uCRM。