阅读说明：本技术 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用 (African swine fever virus four-gene deletion low virulent strain and application thereof ) 是由 陈鸿军 朱鸿飞 扈荣良 钱莺娟 郭晓宇 李金祥 孙怀昌 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株,该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株,其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因(MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L)编码产物。本发明还公开了上述非洲猪瘟病毒弱毒株在制备预防或治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。本发明的非洲猪瘟病毒弱毒株,能对ASFV亲本毒株的攻击提供完全的免疫保护作用,且安全性高,适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。(The invention discloses an African swine fever virus four-gene deletion low virulent strain, which is a four-gene deletion low virulent strain of an SY18 isolate strain of the African swine fever virus, and functional proteins of the following genes are deleted: the CD2v gene encodes a product and three polygene family genes (MGF360-12L, MGF360-13L, MGF360-14L) encode a product. The invention also discloses application of the African swine fever virus low virulent strain in preparation of a vaccine for preventing or treating African swine fever. The African swine fever virus low virulent strain can provide complete immune protection effect on the attack of ASFV parent virulent strain, has high safety, and is suitable for serving as a vaccine candidate strain for preventing African swine fever.)

非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的猪的一种以发热和全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，家猪病死率可高达100％。该病于1921年首先在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行，逐渐演变成24个基因型。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2018年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，已造成全国20％以上减产率，损失超过百亿元，目前该病防控形势异常严峻复杂。

ASFV是一种大型的胞质内复制的病毒，病毒粒子二十面体对称，直径200nm，呈同心圆状结构。非洲猪瘟病毒基因组为末端共价闭合的单分子线性双链DNA，基因组全长为170～190kb，不同毒株的基因组长度不一致。ASFV整个基因组含有超过160个开放阅读框，可以编码150～200种蛋白质。基因组中部为中央保守区(C区)，长度约125kb，C区两侧各有一个可变区，右侧可变区(VR)长度13-22kb，含有5个多基因家族(MGF)。该区域与病毒抗原变异、逃避宿主防御系统等机制有关。

疫苗是预防和控制传染病最有效、最经济的手段，自ASF传入欧洲后，ASF有效疫苗的研发受到了多个国家尤其是欧洲研究机构的高度重视，取得了重要进展，如发现ASFV灭活疫苗不能诱导有效中和抗体，必需同时考虑体液免疫和细胞免疫作用；亚单位疫苗较减毒活疫苗更加安全，从现阶段进展来看，通过病毒载体联合表达不同的抗原组合提高ASFV基因工程亚单位疫苗免疫效力是可行思路；通过敲除毒力基因的减毒活疫苗的保护效果最好，最具开发前景，但是存在不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分引起的免疫副反应及田间散毒，以及多基因缺失造成的过度致弱会使致弱毒株失去保护作用等问题，需要在研究中兼顾安全性(副作用、持续感染、田间散毒等生物安全风险)和保护性的平衡。

由于ASFV致病机制复杂，病毒感染和免疫机理不清，迄今为止，仍无有效疫苗防控该病。尽管针对ASF疫苗的研究起始于20世纪60年代末，近年来报道也很多，但尚未成功应用于实际。迄今，国际上采用基因工程手段获得了多个ASFV基因缺失疫苗候选株，以及通过细胞传代致弱和从自然界分离弱毒株的方法获得了弱毒疫苗候选株，其中一些疫苗候选株在研究报道中针对同源病毒株攻击有50％～100％保护率，但对异源病毒的攻击保护效果不甚理想。此外，无论是人工基因缺失弱毒株还是自然缺失弱毒株，猪免疫后出现剂量依赖性副反应，免疫猪出现精神沉郁，食欲降低，发热、病毒血症、高丙球蛋白血症、肺炎、关节肿胀、跛行、慢性病变和僵猪等，降低了疫苗的实际使用价值。目前人们普遍关心的是非洲猪瘟基因缺失株和自然弱毒株作为疫苗的安全性问题。我国由于种种原因针对非洲猪瘟疫苗研究和储备严重滞后，非洲猪瘟疫情发生后，非洲猪瘟疫苗的研究再次提上日程。

目前我国对非洲猪瘟(ASF)的防控形势异常严峻，急需开发安全高效的ASF疫苗。

发明内容

本发明要解决目前国内缺乏安全有效的非洲猪瘟疫苗的技术问题，提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失弱毒株，该基因缺失弱毒株能对ASFV亲本毒株的攻击提供完全的免疫保护作用，且安全性高，适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种非洲猪瘟病毒弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：

CD2v基因和三个多基因家族基因MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L。

优选的，所述缺失的基因序列包括：编码SEQ ID NO.1所示CD2v蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，编码SEQ ID NO.2所示MGF360-12L蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，编码SEQ IDNO.3所示MGF360-13L蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，编码SEQ ID NO.4所示MGF360-14L蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。

更优选的，所述缺失的基因序列包括：SEQ ID NO.5所示CD2v基因核苷酸序列，SEQID NO.6所示MGF360-12L基因核苷酸序列，SEQ ID NO.7所示MGF360-13L基因核苷酸序列，SEQ ID NO.8所示MGF360-14L基因核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种重组病毒，该重组病毒为非洲猪瘟病毒SY18分离株中的CD2v基因发生缺失的重组病毒。

优选的，所述重组病毒还缺失以下三个多基因家族基因：MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L。

在本发明的另一方面，还提供了上述非洲猪瘟病毒弱毒株在制备预防或治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述非洲猪瘟病毒弱毒株的疫苗。

所述疫苗优选适于口服、或肌注接种。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述非洲猪瘟病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，包含：针对非洲猪瘟病毒SY18分离株的CD2v、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L四个基因中至少一个基因设计的引物对。利用设计合成的引物对，通过PCR扩增反应，能区分鉴别出本发明的非洲猪瘟病毒弱毒株与野毒株。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述非洲猪瘟病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，包含：非洲猪瘟病毒SY18分离株的CD2v、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L四个基因中至少一个基因表达的蛋白的抗体。通过检测感染猪体的CD2v、MGF360-12L、MGF360-13L、和/或MGF360-14L蛋白抗体，能够区分鉴别出本发明的非洲猪瘟病毒弱毒株与野毒株的感染。

本发明的非洲猪瘟病毒基因缺失弱毒株，接种仔猪免疫28天后，以ASFV亲本毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护，在观察期内检测体温均在正常范围内，未见任何异常临床表现，安全可靠，能作为良好的预防非洲猪瘟的疫苗候选株。

附图说明

下面结合附图和

具体实施方式

对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的ASFV重组缺失基因位置及***标记基因表达盒示意图；

图2是本发明实施例1的ASFV SY18ΔC重组病毒构建第一代(*10)在荧光显微镜下的观察图；

图3是本发明实施例1的ASFV SY18ΔC重组病毒P2代重组病毒生长情况(*10)观察图；

图4是本发明实施例1的ASFV SY18ΔC重组病毒P7代PCR检测结果(1～23代表不同克隆子)图；

图5是本发明实施例1的ASFV SY18ΔC重组病毒P8代PCR检测结果(1～23代表不同克隆子)图；

图6是本发明实施例1的ASFV SY18ΔC重组病毒P9-P11代PCR检测结果图；

图7是本发明实施例1的ASFV SY18ΔMC4重组病毒P2代荧光检测结果(*10)图；

图8是本发明实施例1的ASFV SY18ΔMC4重组病毒P3代PCR检测结果(1～23代表不同克隆子)图；

图9是本发明实施例1的ASFV SY18ΔMC4重组病毒P5代PCR检测结果(1～23代表不同克隆子)图；

图10是本发明实施例1的ASFV SY18ΔMC4重组病毒P6-P8代PCR检测结果图；

图11是本发明实施例1的ASFV SY18ΔMC4重组病毒P8代重组病毒荧光检测结果(24hpi)(*20)图；

图12是本发明实施例2的病毒生长曲线图；

图13是本发明实施例3的重组病毒死亡曲线图。

具体实施方式

本发明实施例结果显示：CD2v基因单缺失对中国毒株的毒力影响有限，而前期结果也显示，构建的另一种MGF多基因家族6基因(含6个MGF多基因家族，包括MGF360-12L、13L和14L)缺失毒株免疫猪只后，尽管猪只体温会引起较长时间升高现象(不超过41.3℃)，但不影响精神状态和采食量。

本发明进一步通过对中国毒株SY-18株全基因组中所有可能的MGF多基因家族成员基因进行了克隆优化表达，通过对干扰素报告基因转录水平的抑制活性对比，筛选确定了MGF360-12L、MGF360-13L和MGF360-14L对病毒毒力和免疫抑制作用尤其关键。基于以上前期结果，本发明采用基因工程方法进一步构建了缺失ASFV CD2v和MGF360关键毒力基因的疫苗候选株，而在MGF360-12L、MGF360-13L和MGF360-14L三基因缺失的基础上进一步缺失CD2v基因后，病毒接种引起的长时间发热现象基本消除，这说明尽管CD2v单基因缺失株毒力很强，但CD2v基因缺失能够进一步降低MGF缺失株的毒力。从免疫效力和安全性实验初步结果可评价该四基因缺失毒株对ASFV亲本毒株的攻击具有完全的保护作用，这说明其可作为良好的非洲猪瘟疫苗候选株。

实施例1重组病毒SY18ΔC和SY18ΔMC4的构建及纯化鉴定

1.材料和方法

1.1生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可

军事兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经军事兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、军事医学研究院生物安全委员会、全军实验动物伦理委员会、军事科学院生物安全委员会逐级上报，获得军委后勤保障部卫生局关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

1.2细胞和病毒

原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2～4月龄健康SPF巴马小型猪(购自江苏省农业科学院)，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO₂培养箱中诱导，每2～3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经3～7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。ASFV SY18分离株为本团队报道的国内第一例病毒分离株，属于基因II型，病毒效价为5×10⁷TCID₅₀/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，分装保存于-80℃备用。ASFV SY18分离株的Genbank登录号为MH766894.1，其完整基因组全序列由Genbank登录号MH766894.1提供。

1.3原代细胞和病毒种毒外源病原体检测

上述细胞取小样进行外源病毒DNA、细菌、霉菌和猪肺炎支原体检测。常规病毒检测病原体包括：ASFV、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、***病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、H3N2亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、塞内卡病毒(SVV)、猪血清4型腺病毒(PAdV-4)、猪巨细胞病毒(PCMV)等。塞内卡病毒(SVV)的检测采用RT-PCR，扩增VP2基因，上游引物VP2F：5'-CGGGAT CCATGGATCACAATACCGAAGAAA-3'(SEQ ID NO.9)；下游引物VP2R：5'-CGGAATC TGCTCCTCGTCCGTCCCGGTC-3'(SEQ ID NO.10)；猪血清4型腺病毒(PAdV-4)检测利用自行设计引物进行PCR，上游引物PAdV4-F为：CCTCATGCCGGCTTTCTAT(SEQ IDNO.11)，下游引物PAdV4-R为：AGGGTATCTTGGTCTTTCATT(SEQ ID NO.12)；猪巨细胞病毒(PCMV)检测利用自行设计引物进行PCR，上游引物PCMVF1为：CCTATGTTGGCACTGATACTTGAC(SEQ ID NO.13)，下游引物PCMVR1为：CCCTGAAAATCACCGTCTGAGAGA(SEQ ID NO.14)。

1.4CRISPR/Cas9载体构建

因非洲猪瘟病毒主要在细胞质病毒工厂内复制，因此在构建pCRISPR/Cas9载体时，首先将pX335进行优化。即通过ClonExpress II一步法克隆法去除其Cas9酶两端的核定位信号(NLS)，命名为pX335ΔN。随后，设计针对ASFV EP402R(CD2v)、MGF360-12L、MGF360-14L三个基因靶向gRNAs，共计设计4对寡核苷酸，名称和序列分别为：CD2v-gRNA-LF：CACCGCTAGCTACATGTGGAAAAGC(SEQ ID NO.15)；CD2v-gRNA-LR：AAACGCTTTT CCACATGTAGCTAGC(SEQ ID NO.16)；CD2v-gRNA-RF：CACCGTTGGGTAGTAGCGG GATACT(SEQ ID NO.17)；CD2v-gRNA-RR：AAACAG TATCCCGCTACTACCCAAC(SEQ ID NO.18)；MGF36012L-gRNA-LF:CACCGCTAATACCAAGGTCACATC A(SEQ ID NO.19)；MGF36012L-gRNA-LR：AAACTGATGTGACCTTGGTATTAGC(SEQ ID NO.20)；MGF36014L-gRNA-RF：CACCGGGATGATCTTTGTCTCGAAG(SEQ IDNO.21)；MGF36014L-gRNA-RR：AAACCTTCGAGACA AAG ATCATCCC(SEQ ID NO.22)。通过ZhangF等推荐的克隆方法，将寡核苷酸配对***pX335-ΔN载体中，提取质粒DNA，经测序正确后，分别将阳性克隆质粒命名为：pX335ΔN-CD2vL、pX335ΔN-CD2vR、pX335ΔN-12LL、pX335ΔN-14LR。用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。

1.5筛选表达盒构建

为了便于筛选，共构建两套筛选标记基因的表达盒:1)EGFP筛选表达盒构建：通过PCR扩增p72启动子，即从-199nt到ATG起始密码子之前序列；同时，以pEGFP-N1载体为模板，扩增绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因。将两个基因通过融合PCR的方法连接，获得EGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-EGFP-SV40polyA，该表达盒序列含SV40polyA终止序列；2)mCherry筛选表达盒构建：以pcDNA3-mCherry载体为模板，扩增红色荧光蛋白(mCherry)基因，同时人工合成的胭脂碱合酶(Nopaline synthase,NOS)终止序列(Genbank登录号为AB697057.1)，即1870-2192nt，将其作为p72启动子的转录终止序列，命名为NOSpolyA序列，将p72启动子、mCherry基因序列、NOSpolyA序列通过融合PCR连接，获得mCherry筛选表达盒基因片段，命名为p72-mCherry-NOSpolyA。

1.6同源重组转移载体的构建

利用pUC19载体作为骨架载体，分别构建EP402R(CD2v)及MGF360-12L～MGF360-14L基因簇敲除用同源重组转移载体。具体步骤为：设计CD2v基因上下游序列各1.2kb及MGF360-12L～MGF360-14L基因簇两侧各1.5kb作为同源重组臂，分别克隆入pUC19载体中，在CD2v的重组转移载体的左、右臂基因序列中间***p72-EGFP-SV40polyA筛选标记基因表达盒基因片段。经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pCD2vLR-EGFP；在MGF360-12L～MGF360-14L基因簇的重组转移载体的左右臂序列中间***p72-mCherry-NOSpolyA基因片段，作为筛选标记基因表达盒。经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pMGF3LR-mCherry。用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。重组策略所选择的缺失位置见图1。如图1所示，缺失的CD2v基因(即EP402R基因)是全基因序列中位于73369-74451的核酸序列(SEQ ID NO.5)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，缺失的三个多基因家族基因MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L，其中MGF360-12L基因是全基因序列中位于29382-30434的核酸序列(SEQ ID NO.6)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2，MGF360-13L基因是位于30595-31656的核酸序列(SEQ ID NO.7)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3，MGF360-14L基因是位于31840-32913的核酸序列(SEQ ID NO.8)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。

1.7细胞转染和重组病毒筛选

整个细胞转染和重组病毒筛选分两步完成。

第一步为CD2v基因敲除病毒的构建。即将同源重组转移质粒pCD2vLR-EGFP(2μg)、pX335ΔN-CD2vL(1μg)和pX335ΔN-CD2vR(1μg)与12μL-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至猪BMDM细胞(细胞数约为10⁶个/孔)，转染6h后，直接感染SY18纯化病毒株(按1moi感染量)，不换液，至感染48h时，在荧光显微镜下观察荧光细胞数，消化细胞并挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取单个荧光细胞，收集后反复冻融3次，在PAM细胞单层上经10轮有限稀释，扩大培养，纯净性检验、目的基因PCR、标记基因表达和***序列测定，以确定获得纯化的ASFV CD2v基因敲除病毒，检测引物为CD2v-check-F:TGATATAAATGGA GTATCATGGA(SEQ ID NO.23)，CD2v-check-R:AGGACATGGTTTAGGTGGAGGAC(SEQ ID NO.24)。将第一步获得重组病毒命名为SY18ΔC。

第二步为MGF360家族3基因敲除病毒的构建。即将同源重组转移质粒pMGF3LR-mCherry(2μg)、pX335ΔN-12LL(1μg)、pX335ΔN-14LR(1μg)与12μL-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至猪BMDM细胞(细胞数约为10⁶个/孔)，在转染后6h，接种SY18ΔC病毒(1moi)。感染后48h观察对应绿色荧光细胞内重组病毒的特异性红色荧光表达情况。2mM EDTA溶液消化细胞并挑取所有单孔中的荧光细胞，反复冻融3次，在PAM细胞单层上经10轮有限稀释，扩大培养，纯净性检验、目的基因PCR、标记基因表达和***序列测定，以确定获得纯化的4基因敲除种毒，检测引物分别为：MGF360-12L-check-F:TAACCGCCACGTATTCAGGTGTG(SEQ ID NO.25)；MGF360-14L-check-R:CAGCTCAGATGCTTCCTTGCCAC(SEQ ID NO.26)。将第二步获得的重组病毒命名为SY18ΔMC4。

2.实验结果

2.1CD2v单基因敲除过程及纯化鉴定结果

将pX335ΔN-CD2vL、pX335ΔN-CD2vR及pCD2vLR-EGFP质粒混匀，共转染BMDM细胞，在转染6h后，换完全培养液，按1moi接种SY-18毒株感染BMDM细胞，感染后不换液，培养至48h，在荧光显微镜下拍摄，可见有零星荧光，即视为可疑重组病毒感染的细胞(图2A)。对照可见光(图2B)，挑取转染孔中所有单个荧光细胞，反复冻融后，接种预先铺好的96孔板PAM细胞中，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔，标记后，继续观察至72h，结果可见，部分孔中荧光细胞数量比例可达100％。这说明重组病毒构建基本成功(图3)。

随后对该全阳性孔进行4次有限稀释扩大培养，挑取第6代重组病毒孔消化成单个细胞，小心吸取23个荧光细胞，分别接种于预先铺好的96孔板PAM细胞中，继续生长72h，挑取荧光细胞孔的部分细胞，提取基因组DNA，利用CD2v-check-F/R引物对进行PCR鉴定，结果表明：所有23个单细胞接种的细胞孔中，有11孔仍含有野毒，而12个孔已经检测不到CD2v基因(图4)。消化第7号孔中细胞，挑取23个单细胞，分别再接种到96孔PAM细胞中，感染72h后，观察荧光阳性的细胞孔，经PCR鉴定显示：所有孔中均为CD2v基因缺失的GFP重组病毒(图5)。这表明重组毒已纯化。挑取P8代病毒孔中的第7孔，连续在6孔板PAM细胞中传3代，即P9、P10、P11代，分别通过PCR鉴定，结果证明：该CD2v缺失重组病毒已纯净(图6)。图6中，1：P9代病毒；2：P10代病毒；3：P11代病毒；4：阴性对照；5：SY18基因组DNA。

2.2MGF360-12L～14L三基因敲除过程及纯化鉴定结果

利用纯净的ASFV SY18ΔC作为亲本株病毒，在此基础上继续缺失MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L连续三个多基因家族成员，步骤方法与CD2v缺失相同，即在BMDM细胞中转染pX335ΔN-12LL、pX335ΔN-14LR和pMGF3LR-mCherry三种质粒，感染SY18ΔC P10代病毒纯化子，挑取P1代中既具有红色荧光又发绿色荧光的单细胞，接种于96孔板中PAM细胞中，感染72h后检测。结果显示：部分孔能达到几乎100％阳性(图7)，图7中，A：EGFP荧光检测结果；B：红色荧光检测结果。挑取P2代中其中一个孔的23个单细胞，接种新的预铺在96孔板中的PAM细胞上，利用MGF360-12L-check-F、MGF360-14L-check-R引物对PCR检测。结果证明：其中16个PCR阴性，7个孔的细胞PCR阳性(图8)。随后，在P3代病毒感染的第5孔中挑23个单细胞，消化后接种于新的96孔板PAM细胞中，通过CD2v及MGF检测引物PCR检测结果，证明该P4代次重组缺失病毒中，尚有2个孔存在野毒。随即从P4代第7孔中再次挑23个单细胞，接种于新的96孔板PAM细胞中，PCR检测后发现：仅有一个孔感染细胞PCR检测为阳性(图9)。将该P5代次感染细胞在6孔板PAM细胞中扩大培养，连续扩大3代，分别标记为P6、P7、P8代次，分别利用PCR检测，结果均为阴性(图10)。这证明SY18ΔMC4基因缺失病毒已经纯化获得。图10中，1:P6代病毒；2:P7代病毒；3:P8代病毒；4：阴性对照；5：SY18基因组DNA对照。ASFVSY18ΔMC4P8代重组病毒的荧光检测结果(24hpi)(*20)如图11所示，图11中，A.EGFP荧光检测结果；B.mCherry荧光检测结果；C.EGFP和mCherry叠加结果。

实施例2重组病毒SY18ΔC和SY18ΔMC4在PAM细胞中的生长特性测定

1.病毒生长曲线测定

将猪原代PAM细胞铺入6孔板中，长成单层后，分别接种0.1moi病毒液，37℃孵育2h，分别于感染后0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、48h收获扩增病毒，反复冻融3次，高速离心分装，分别测定病毒效价，绘制野生病毒和基因敲除病毒的生长曲线。

2.病毒效价滴定

将上述重组病毒液按照10倍梯度进行稀释，感染已铺在96孔板中形成单层的猪原代PAM细胞，于感染后72h利用4％多聚甲醛溶液固定感染细胞，加入适当浓度稀释的P30单克隆抗体1E10，利用荧光标记的二抗进行染色；基因缺失的两个病毒种毒可直接利用荧光显微镜观察，按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID₅₀/mL为单位。

结果：

SY18、SY18ΔC、SY18ΔMC4三种病毒以相同的病毒量接种PAM细胞单层，分别于感染后0h、6h、12h、24h、48h收获培养上清和细胞混合物，反复冻融3次，在PAM细胞中测定病毒效价。结果显示：两株敲除病毒的平均滴度均略低于SY18野毒。在感染后48h时，SY18ΔC基因缺失病毒的平均滴度为1.679×10⁷TCID₅₀/mL，SY18ΔMC4基因缺失病毒的平均滴度为8.472×10⁶TCID₅₀/mL，而SY18亲本毒平均滴度为4.295×10⁷TCID₅₀/mL(图12)。

实施例3重组病毒SY18ΔC和SY18ΔMC4的安全性评价实验

为了检测上述两种基因敲除病毒是否已经完全没有致病力，本实验首先对经肌肉注射途径按不同感染剂量(10³、10⁴、10⁵TCID₅₀)的重组病毒对仔猪的安全性进行评价。本实验用30头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康大三元仔猪，共分为6组，免疫接种后测定每天采食量、体重和体温变化情况，每5天采集1次外周血和唾液，通过荧光定量PCR方法测定ASFV病毒血液含量，观察至60天终止。实验方案如表1所示。

表1安全性评价

结果：

通过安全性评价发现，SY18ΔC毒株经肌肉注射接种10³TCID₅₀病毒量，所有仔猪均在3天内发生高热，高达42℃以上，精神沉郁，4-6天左右开始死亡，并在10天内全部死亡。经口服接种10³TCID₅₀病毒量，所有仔猪在10天后产生高热，精神沉郁，20-30天左右全部死亡。剖检可见***、脾脏、肾脏等部位严重出血，病毒血症一直持续到猪只死亡，唾液排毒阳性。这显示出该毒株与SY18亲本野毒无显著致病性差异。

而SY18ΔMC4接种后，无论是低剂量(10³TCID₅₀)、中剂量(10⁴TCID₅₀)还是高剂量(10⁵TCID₅₀)仅在接种后第2-3天出现短暂的体温升高，均未超过41.3℃，随后转为正常体温，后期未见体温异常，观察期内精神状态正常，采食量未见异常，体重增加明显。剖检无任何病理表现。这说明该四基因缺失毒株对仔猪显示出良好的安全性(图13)。

实施例4仔猪免疫效力评价实验

为明确缺失病毒株是否可作为疫苗候选株，本实验开展重组病毒免疫效力的初步研究。共用30只ASFV、PRRSV、PRV、CSFV、PPV、PCV-2抗原抗体检测阴性的健康大三元仔猪，均分为3组：1)免疫组为肌肉注射接种ASFV四基因敲除病毒SY18ΔMC4，免疫28天后，通过口服接种10³TCID₅₀剂量SY18病毒，继续观察35天。测定每天采食量、体重和体温变化情况。最终麻醉安乐死所有猪只，观察各脏器病变情况并打分。利用荧光定量PCR方法检测各脏器病毒拷贝数。2)攻毒组为接种PBS组，28天后，通过口服接种10³TCID₅₀剂量SY18病毒，继续观察35天。3)为正常接种PBS对照组。

结果：

根据安全性实验结果，免疫SY18ΔMC4弱毒株，免疫途径为肌注，剂量分别为10³TCID₅₀/头(组1)，在免疫28天后，以SY18亲本毒进行攻毒试验，攻毒方式为口服，剂量为10³TCID₅₀/头，继续观察35天。结果显示；免疫猪群均获得完全保护，在观察期内检测体温均在正常范围内，未见任何异常临床表现，无病毒血症发生，粪便、唾液、泪腺等部位无排毒。剖检可见所有免疫保护猪只未发现明显病理变化。而攻毒对照组的5只猪全部发病，10天左右体温开始升高，持续9～11天后，开始死亡，至25天后，全部死亡；正常对照组(组3)的5只猪表现正常。以上结果说明：SY18ΔMC4肌肉注射具有良好的攻毒保护效果，可作为良好的ASF预防疫苗候选株。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序 列 表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 1

Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile

1 5 10 15

Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

35 40 45

Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

50 55 60

Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

85 90 95

Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

130 135 140

Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

145 150 155 160

Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Tyr Ile

195 200 205

Pro Leu Ser Ile Ile Ile Gly Ile Thr Ile Ser Ile Leu Leu Ile Ser

210 215 220

Ile Ile Thr Phe Leu Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys His Val Glu Glu

225 230 235 240

Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln His

245 250 255

Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu Leu

260 265 270

Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Asn Thr Pro Ile Tyr Tyr Met

275 280 285

Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro Cys

290 295 300

Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys

305 310 315 320

Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro Ser

325 330 335

Ile Pro Leu Leu Pro Asn Ile Pro Pro Leu Ser Thr Gln Asn Ile Ser

340 345 350

Leu Ile His Val Asp Arg Ile Ile

355 360

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 2

Met Leu Pro Ser Leu Gln Ser Leu Thr Lys Lys Val Leu Ala Gly Gln

1 5 10 15

Cys Val Pro Thr Asn Gln His Tyr Leu Leu Lys Cys Tyr Asp Leu Trp

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Trp His Asp Ala Pro Ile Thr Phe Asp His Asn Leu Arg Leu Ile Lys

35 40 45

Ser Ala Gly Ile Lys Glu Gly Leu Asn Leu Asn Thr Ala Leu Val Lys

50 55 60

Ala Val Arg Glu Asn Asn Tyr Asn Leu Ile Lys Leu Phe Ala Glu Trp

65 70 75 80

Gly Ala Asp Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ser Val Asn Thr Glu His Thr

85 90 95

Trp Asp Leu Cys Arg Glu Leu Gly Ala Lys Glu Thr Leu Asn Glu Glu

100 105 110

Glu Ile Leu Gln Ile Phe Ile Asp Leu Lys Phe His Lys Thr Ser Ser

115 120 125

Asn Ile Ile Leu Cys His Glu Val Phe Ser Asn Asn Pro Ile Leu Gln

130 135 140

Lys Val Asn Asn Ile Lys Met Arg Ile Glu Ile Phe Trp Glu Leu Arg

145 150 155 160

Glu Leu Ile Val Lys Thr Asp Leu Leu Asn Asn Glu Phe Ser Leu Ser

165 170 175

Thr Leu Leu Leu Lys Tyr Trp Tyr Ala Ile Ala Ile Arg Tyr Asn Leu

180 185 190

Lys Glu Ala Ile Gln Tyr Phe Tyr Gln Lys Tyr Thr His Leu Asn Thr

195 200 205

Trp Arg Leu Thr Cys Ala Leu Cys Phe Asn Asn Val Phe Asp Leu His

210 215 220

Glu Ala Tyr Glu Lys Asp Lys Ile His Met Asp Ile Glu Glu Met Met

225 230 235 240

Arg Ile Ala Cys Ile Lys Asp His Asn Leu Ser Thr Met Tyr Tyr Cys

245 250 255

Tyr Val Leu Gly Ala Asn Ile Asn Gln Ala Met Leu Ser Ser Ile Gln

260 265 270

Tyr Tyr Asn Ile Glu Asn Met Phe Phe Cys Ile Asp Leu Gly Ala Asp

275 280 285

Val Phe Glu Glu Gly Thr Thr Ala Leu Gly Glu Gly Tyr Glu Leu Ile

290 295 300

Lys Asn Ile Leu Ser Leu Lys Ile Tyr Ser Pro Ala Thr Thr Pro Leu

305 310 315 320

Pro Lys Ser Thr Asp Pro Glu Ile Ile Asp His Ala Leu Lys Asn Tyr

325 330 335

Val Ser Lys Asn Met Met Ile Phe Leu Thr Tyr Asp Leu Arg

340 345 350

<210> 3

<211> 353

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 3

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1 5 10 15

Ser Gln Cys Leu Ser Ile Asp Glu His Cys Ile Leu Lys Tyr Cys Gly

20 25 30

Leu Trp Trp His Asp Ala Pro Leu Lys Leu Cys Met Asp Arg Gly Arg

35 40 45

Ile Gln Ile Lys Ser Gly Phe Leu Gly Glu Asp Ile Asp Leu Arg Val

50 55 60

Ala Leu Ile Ile Ala Val Lys Glu Asn Asn Tyr Ser Leu Ile Lys Leu

65 70 75 80

Phe Thr Glu Trp Gly Ala Asn Ile Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Thr Lys His Ile Arg Glu Leu Cys Arg Gln Leu Gly Ala Lys Glu Thr

100 105 110

Leu Glu Asp Asn Asp Ile Phe Arg Ile Phe Thr Arg Ile Met His Asn

115 120 125

Lys Thr Ser Gly Ser Ile Ile Leu Cys His Glu Ile Phe Met Asn Asn

130 135 140

Pro Ile Leu Glu Asn Lys Phe Val Ile Gln Leu Arg Gly Leu Ile Tyr

145 150 155 160

Lys Arg Leu Trp Gly Leu Ile Glu Ile Lys Glu Thr Asp Glu Leu Asn

165 170 175

Gly Leu Leu Val Lys Tyr Trp Tyr Ala Lys Ala Val Gln Tyr Asp Cys

180 185 190

Lys Asp Ala Ile Cys Phe Leu Asp Glu Lys Tyr Thr Asp Leu Asn Glu

195 200 205

Trp Arg Leu Lys Cys Leu Leu Tyr Tyr Asn Lys Ile Tyr Glu Leu His

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Glu Met Tyr His Lys Glu Asn Ile Gln Ile Asp Val His Asp Met Ile

225 230 235 240

Cys Leu Ala Ser Thr Lys Asp Asn Asn Pro Leu Thr Ile Tyr Tyr Cys

245 250 255

Tyr Ala Leu Gly Gly Asn Ile Asn Gln Ala Met Leu Thr Ser Val Gln

260 265 270

Tyr Tyr Asn Ile Gly Asn Ile Phe Phe Cys Ile Asp Leu Gly Gly Asn

275 280 285

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290 295 300

Leu Ser His Ser Leu Ala Leu Asp Ile Tyr Ser Ser Asp Ala Ser Leu

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Pro Leu Asn Leu Lys Asp Pro Glu Glu Ile Ser Ser Leu Leu Lys Asp

325 330 335

Tyr Lys Ser Lys Asn Leu Ser Ile Ile Trp Glu Tyr Ser His Asn Ile

340 345 350

Leu

<210> 4

<211> 357

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 4

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1 5 10 15

Leu Ser Ser Asp Tyr Asp Tyr Thr Leu Gln Arg Phe Gly Leu Trp Trp

20 25 30

Asp Leu Gly Pro Ile His Leu Cys Asn Asn Cys Lys Gln Val Phe Ser

35 40 45

Tyr Lys His Leu Gln Cys Phe Ser Glu Asp Asp Leu Cys Leu Glu Ala

50 55 60

Ala Leu Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asn Leu Glu Leu Ile Arg Leu

65 70 75 80

Phe Val Asp Trp Gly Ala Asn Pro Glu Tyr Gly Leu Ile Arg Val Pro

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Ala Val Tyr Leu Lys Arg Leu Cys Ala Glu Leu Gly Gly Leu Thr Pro

100 105 110

Val Ser Glu Pro Arg Leu Leu Glu Ile Leu Lys Glu Val Ala Arg Leu

115 120 125

Lys Ser Cys Ala Gly Val Leu Leu Gly Tyr Asp Met Phe Cys His Asn

130 135 140

Pro Leu Leu Glu Thr Val Thr Arg Thr Thr Leu Asp Thr Val Thr Tyr

145 150 155 160

Thr Cys Ser Asn Ile Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ala His His Leu Leu

165 170 175

Thr Lys Phe Trp Phe Ala Leu Ala Leu Arg His Asn Phe Thr Lys Ala

180 185 190

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Ala Cys Ser Leu Tyr Phe Asn Asn Ile Phe Asp Ile His Glu Leu Cys

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225 230 235 240

Cys Leu Arg Glu Lys Asn Tyr Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys His Arg Leu

245 250 255

Gly Ala Ser Leu Asp Tyr Gly Met Asn Leu Ser Ile Tyr Asn Asn Asn

260 265 270

Thr Leu Asn Met Phe Phe Cys Ile Asp Leu Gly Ala Ala Asp Phe Asp

275 280 285

Arg Ala Gln Leu Ile Ala His Lys Ala Tyr Met Tyr Asn Leu Ser Asn

290 295 300

Ile Phe Leu Val Lys Gln Leu Phe Ser Arg Asp Val Thr Leu Val Leu

305 310 315 320

Asp Val Thr Glu Pro Gln Glu Ile Tyr Asp Met Leu Lys Thr Tyr Thr

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 5

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120

ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180

ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240

agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300

caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360

aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420

ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480

aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540

tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660

cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720

atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780

tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840

tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900

cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960

ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020

cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080

taa 1083

<210> 6

<211> 1053

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 6

atgttgcctt ccctgcaatc tctgaccaaa aaggtgttgg ctggacaatg cgtgcccacg 60

aaccaacatt atcttttaaa gtgttatgac ctatggtggc atgatgctcc gatcacgttt 120

gatcataacc taaggctcat aaaatcagca ggtattaaag agggcttaaa cctaaatacg 180

gcgttagtga aggctgtaag ggaaaacaac tacaacctta taaaactgtt tgcagagtgg 240

ggggcggaca tcaactacgg gctggtatct gtcaacacgg agcacacctg ggacctctgt 300

cgagagctag gtgccaagga aaccttgaat gaagaagaaa ttttacaaat ttttatagat 360

ctaaagtttc ataaaactag tagtaacatt attttatgcc atgaggtgtt ttccaacaat 420

ccgatattac aaaaagtaaa taatataaaa atgaggatag aaattttctg ggagttaagg 480

gagttaatag taaaaaccga tctgctaaat aatgagtttt cgctcagtac attactactc 540

aaatactggt acgctatagc catacgctat aacctgaaag aggccataca gtatttttac 600

caaaaatata cacacctgaa tacgtggcgg ttaacatgtg ctctttgttt taataatgtg 660

tttgaccttc atgaggcgta tgaaaaggac aagatccata tggacataga agagatgatg 720

cggatcgcct gcatcaaaga ccacaacctt tcaaccatgt actactgcta tgtcctgggc 780

gccaacatca atcaagccat gcttagctca atacagtact ataatataga aaacatgttc 840

ttttgtatag atctgggggc tgatgttttc gaagagggta ctacagcttt aggggaaggg 900

tatgagctta taaagaacat tttatcccta aagatttata gtccggccac caccccgttg 960

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atgatgatct tccttaccta tgatttaaga tga 1053

<210> 7

<211> 1062

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 7

atgtcgttgc cgctctctct gcagaccctc gtcaaaaaga cgatagccag ccagtgtttg 60

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tttatgaata atcctatttt agaaaacaaa tttgttatac aattaagggg cttaatttat 480

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gagaaatata cggatcttaa tgaatggcga ttaaaatgtc tcctgtatta taacaaaata 660

tatgagcttc atgagatgta ccacaaggaa aacatccaaa tagacgtcca tgacatgata 720

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ggcaacatca accaagctat gcttacttca gtacaatatt ataacatcgg taatatattt 840

ttctgtatag atttgggtgg taatgccttt gaagagggtc gtgccatagc ggaacaaaaa 900

ggttataatt ttctgagcca tagtttggct ttggatattt acagctcaga tgcttccttg 960

ccactaaact taaaggaccc cgaagaaata agcagtttat taaaagatta taaatcaaaa 1020

aacttatcca tcatttggga atattctcat aatatactat ag 1062

<210> 8

<211> 1074

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 8

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aacaattgta agcaagtttt ttcgtataaa catttacagt gtttttctga ggatgatctt 180

tgtctcgaag cggcgctagt aaaggccgtg aagagcgata atcttgaact tatacgttta 240

tttgtggatt ggggcgcaaa tcctgaatat gggcttatac gtgttcctgc cgtgtatcta 300

aagcggctgt gtgcggaact gggaggctta acgcctgtat ccgaaccccg tcttctggaa 360

attttaaaag aagtggccag gctaaaatcc tgtgcaggag ttctgctggg ttatgacatg 420

ttttgtcata atccactctt ggaaaccgta actagaacca ctttagacac agttacgtac 480

acctgttcaa acattccgtt gacgggggat acggcgcacc acctattaac aaagttttgg 540

tttgccctgg cattacgaca taattttaca aaggctattc actatttcta taaaaggcat 600

aaaaatcacc tctattggcg ggtagcttgt agcctttatt ttaataacat ttttgacata 660

cacgagttgt gtcgtgaaaa agagatttgc atcagcccta atctgatgat gaaatttgct 720

tgcttgcggg aaaaaaatta cgcggccatt tattactgtc ataggttggg ggctagtctc 780

gattatggca tgaatctttc tatctataac aataatactt taaacatgtt tttctgtatt 840

gatttggggg ctgccgattt tgatagggca caactcattg cgcacaaagc ttatatgtat 900

aacttgagca acattttctt agtaaagcag cttttcagcc gtgatgtgac cttggtatta 960

gatgtaaccg aaccccagga aatatatgat atgctaaaga catatacttc aaaaaatctg 1020

aaacgagccg aagagtatct tacagcccat ccagaaatta tagttataga ctaa 1074

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 9

cgggatccat ggatcacaat accgaagaaa 30

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 10

cggaatctgc tcctcgtccg tcccggtc 28

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 11

caccgctagc tacatgtgga aaagc 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 12

aaacgctttt ccacatgtag ctagc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 13

caccgttggg tagtagcggg atact 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 14

aaacagtatc ccgctactac ccaac 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 15

caccgctaat accaaggtca catca 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 16

aaactgatgt gaccttggta ttagc 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 17

caccgggatg atctttgtct cgaag 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 18

aaaccttcga gacaaagatc atccc 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 19

tgatataaat ggagtatcat gga 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 20

aggacatggt ttaggtggag gac 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 21

taaccgccac gtattcaggt gtg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 22

cagctcagat gcttccttgc cac 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 23

tgatataaat ggagtatcat gga 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 24

aggacatggt ttaggtggag gac 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 25

taaccgccac gtattcaggt gtg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 26

cagctcagat gcttccttgc cac 23