一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
阅读说明：本技术 一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法 (Preparation method and detection method of freeze-dried Newcastle disease virus nucleic acid standard substance ) 是由 冯小宇 高晓龙 梅力 王英超 韦海涛 宋彦军 沈光年 王林 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法,包括如下步骤：S1、新城疫病毒液的制备；S2、将制备的新城疫病毒液热灭活,得到灭活的病毒液；S3、取步骤S2得到的灭活病毒液加入保护剂,冻干,得到新城疫病毒核酸标准物质。其检测方法以推进新城疫病毒核酸分子检测标准化及新城疫病毒体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化。新城疫病毒核酸标准物质不仅可为兽医实验室开展量值溯源、能力验证、质量控制、方法评价、试剂选择等工作提供技术支撑,还能提高全国不同类型兽医检测实验室的检测能力和技术水平,更为动物疫病净化和畜产品质量安全评价、身份验证、国内监管、进出口检验、企业自控和国际贸易互认提供有力保障。(The invention provides a preparation method and a detection method of a freeze-dried Newcastle disease virus nucleic acid standard substance, which comprises the following steps: s1, preparing Newcastle disease virus liquid; s2, performing heat inactivation on the prepared Newcastle disease virus liquid to obtain an inactivated virus liquid; s3, adding a protective agent into the inactivated virus liquid obtained in the step S2, and freeze-drying to obtain the Newcastle disease virus nucleic acid standard substance. The detection method promotes the standardization of the detection of the newcastle disease virus nucleic acid molecules and the quantity value traceability and detection result consistency of the newcastle disease virus in-vitro diagnostic reagent. The Newcastle disease virus nucleic acid standard substance can provide technical support for veterinary laboratories to carry out work such as quantity value traceability, capability verification, quality control, method evaluation, reagent selection and the like, can also improve the detection capability and technical level of veterinary detection laboratories of different types nationwide, and provides powerful guarantee for animal epidemic disease purification and animal product quality safety evaluation, identity verification, domestic supervision, import and export inspection, enterprise automatic control and international trade mutual recognition.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法。
背景技术
新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、热性、败血性、高度接触性传染病，以消化道、呼吸道、中枢神经系统细胞损伤为主，主要临床症状为黏膜及浆膜出血、下痢、呼吸高度困难、神经紊乱，该病发病率和死亡率可达到100％，给养禽业造成了严重的威胁和巨大的经济损失。1926年，印度尼西亚的爪哇岛首次暴发该病，同年英国新城暴发，随后在中东等亚洲地区出现。世界动物卫生组织(office international des epizooties，OIE)将ND列为A类动物疫病，一旦发生需要向OIE报告，我国也将其列为一类动物疫病。NDV主要感染鸡、野鸡、火鸡等禽类，水禽也可带毒，但水禽一般不会将病毒传播给家禽。人类偶尔亦可感染，如果工作人员长期接触大量NDV，会导致结膜炎的出现。
NDV只有1个血清型，因此不同毒株之间有一定的交叉保护作用。根据新城疫病毒基因组长度、F基因序列，NDV可分为ClassI类和ClassⅡ类。Class I类NDV可进一步分为10个基因型(1-10)，绝大部分为弱毒株，主要感染野生水禽并逐步传播至陆生禽类。ClassⅡ类NDV流行时间较长，家禽是其主要感染宿主，至少可分为18个基因型，除基因I和Ⅱ型为弱毒外，其余大部分基因型为强毒。ClassⅡ类是NDV流行的优势毒株，其中目前主要流行的是基因Ⅵ和Ⅶ型。
目前常用的NDV活疫苗主要有I系(中等毒力)、Ⅱ系、Ⅲ系(毒力较弱)、Ⅳ系(LaSota株)和V4株等几种，其中LaSota弱毒活疫苗已广泛应用且公认免疫效果较好。
目前，国内外尚无针对新城疫病毒血清或核酸等检测方法的标准物质，各级检测机构缺少阳性血清、抗原、核酸等相应的标准物质。国内外也尚无任何机构或公司生产NDV相关的标准物质，由于各级兽医检测实验室软硬件条件相差巨大，诊断试剂种类繁多，标准物质的缺失导致在NDV检测方面缺乏一致性和可比性，制约了对ND的有效防控。因此研制ND检测相关标准物质，不仅可以提高全国不同类型兽医检测实验室的检测能力和技术水平，更为动物疫病净化和畜产品质量安全提供了有力保障。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法，以推进新城疫病毒核酸分子检测标准化及新城疫病毒体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法，包括如下步骤：
S1、新城疫病毒液的制备；
S2、将步骤S1制备的新城疫病毒液热灭活，得到灭活的病毒液；
S3、取步骤S2得到的灭活病毒液加入保护剂，冻干，得到新城疫病毒核酸标准物质。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，所述新城疫病毒液的制备包括如下步骤：
S101、SPF鸡胚选择和接种位置标记；
S102、接种新城疫病毒LaSota株，培养；
S103、收获尿囊液；即为新城疫病毒液。
进一步地，所述培养的条件为37℃，相对湿度55％，培养时间为48h-72h。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述热灭活为65℃处理2h。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述保护剂含有明胶和蔗糖。
进一步，所述保护剂为含有质量分数为5％的明胶和25％的蔗糖的水溶液，使用前需高温高压灭菌(116℃)20min。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述灭活病毒液与所述保护剂按体积比为1：0.5-1.5进行添加。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述冻干的条件为-10℃－-40℃冷冻干燥4h－10h。
如上所述的制备方法，优选地，其还包括按如上所述制备方法获得的冻干型新城疫病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验，
和/或支原体检验；
和/或其他病毒检验。
其中，所述病毒灭活检验可使用鸡胚感染实验检验；
所述支原体检验使用支原体培养方式检验；
所述其他病毒检验可使用荧光定量PCR方法检验，其他病毒检测包括对H9N2亚型禽流感病毒(H9N2)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、禽传染性喉气管炎病毒(AILTV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)的检测。
如上所述的制备方法，还包括对新城疫病毒核酸标准物质进行均匀性评估和/或稳定性评估。
进一步地，所述均匀性评估的步骤为：将所述新城疫病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，结果进行均匀性评估。
优选地，所述抽样为抽取10-30个(如15个)新城疫病毒核酸标准物质；每个样品检测次数具体可为3次。
优选地，所述数字PCR方法采用的引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.3所示，扩增体系采用的引物对浓度各900nmol/L，探针250nmol/；扩增程序为45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃45s，40个循环；98℃10min；12℃60min。
优选地，所述均匀性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法进行均匀性评估。
如上所述的制备方法，优选地，所述稳定性评估短期稳定性评估和长期稳定性评估，所述短期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在4℃、25℃或60℃保存1周，2周或4周，每种条件下随机抽取3瓶的新城疫病毒核酸标准物质，每个样品检测次数具体可为3次；
所述长期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在-20℃保存N1个月、N2个月、N3个月、N4个月或N5个月(N1-N5均为自然数且0≤N1-N5≤14)，抽取3瓶的新城疫病毒核酸标准物质，每个样品检测次数具体可为3次。
所述稳定性评估根据抽样方法和检测次数，使用回归或T检验进行稳定性评估。
如上所述的制备方法，优选地，该制备方法还包括将新城疫病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±不确定度；由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的新城疫病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；
使用统计学方法计算不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。
多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。
本发明采用的新城疫病毒具体为新城疫病毒LaSota株。目前，国内动物病原微生物检测标准物质的研究尚处于起步阶段，仅有针对少数几种病原的标准血清、标准抗原和菌毒种标准物质。采用本发明提供的方法制备的新城疫病毒核酸标准物质进行检测，一方面可用于评价检测试剂和实验室质量控制，另一方面可大幅提升疫病监测和诊断的效率，对于提升动物及动物产品的质量安全检测能力，确保消费者健康与安全、促进畜牧业健康发展、提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。可见本发明具有重大的应用价值。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种新城疫病毒核酸标准物质。标准物质是验证检测方法、检测试剂是否可靠的关键，也是实验室质量认证体系的重要因素，它的使用可为动物疫病检测实验室带来可靠的检测保证，从而获得准确的数据，为精准化疫病防控提供技术保障。
本发明使用新城疫病毒LaSota株，通过病毒液的制备、灭活和冻干等系列试验，最终获得了易于保存和运输的新城疫病毒核酸标准物质，为提高全国不同类型兽医检测实验室的检测能力和技术水平，验证检测方法、检测试剂的可靠性提供了一种关键的标准试剂。
附图说明
图1为发明新城疫病毒RT-qPCR方法扩增曲线。
图2为本发明新城疫病毒RT-qPCR方法扩增标准曲线。
图3为本发明新城疫病毒数字PCR方法退火温度优化结果。
图4为本发明NDV RT-ddPCR方法线性关系图谱。
具体实施方式
本发明建立了一种冻干方法，将混有冻干保护剂的新城疫病毒核酸标准物质预先冷冻，再放入冻干机中进行冻干至少10小时以上。冻干结束后取出冻干瓶，压好胶塞并盖紧外盖，放入-20℃冰箱保存。通过摸索冻干工艺有效保证了新城疫病毒核酸标准物质的最佳性状，有利于标准物质的保存与运输。
本发明在城疫病毒核酸标准物质研制过程中的定量检测，均利用了微滴式数字PCR平台，与传统的荧光定量PCR技术相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。本发明通过新城疫病毒微滴式数字PCR反应的优化，包括反转录条件的优化、核酸提取试剂盒的选择与性能评估、反应条件优化(引物探针浓度、退火温度)、方法的线性及最低检测限测定，可以更加准确、灵敏地对新城疫病毒核酸标准物质的均匀性和稳定性进行评估与考察，大大提高了实验结果的可信度。
本发明利用单因素方差分析方法对新城疫核酸标准物质进行评估。新城疫核酸标准物质定值过程中采用狄克逊法和格拉布斯法对实验室内数据可疑值进行检验；采用科克伦法检验实验室间数据是否等精度；根据均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度以及定值过程带来的不确定度计算制备的新城疫核酸标准物质的扩展不确定度，其中定值过程带来的不确定度对天平称量、移液器和数字PCR仪等多个环节进行计算。采用生物统计学方法对制备的新城疫核酸标准物质进行评估和定值，使制备的标准物质定值更准确。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1新城疫病毒的病毒液制备
(1).SPF鸡胚选择和接种位置标记
选择9日龄的活胚(血管分枝明显，呈鲜红色，鸡胚可以正常活动)，标记出气室、胚胎及主要血管位置，并在胚胎对侧距气室边界上约5mm处避开血管标记接种位置。
(2).新城疫病毒接种
将本实验室分离、保存的新城疫病毒(LaSota株)(本发明中选用LaSota疫苗株，因LaSota疫苗株F基因与目前的NDV流行株核苷酸同源性高达80％以上，因此选用LaSota疫苗株制备NDV核酸检测标准物质。)取出，融化后用PBS稀释1000倍，震荡混匀。用1mL注射器按每枚0.2mL经尿囊腔接种20枚鸡胚。
(3).新城疫病毒液培养和收获
新城疫病毒接种鸡胚后，置于37℃温箱中孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况，72h后无菌采集血凝效价大于5的鸡胚尿囊液。将病毒培养液4℃、4500rpm/min离心5min后用0.22μm滤膜进行过滤。病毒液置-80℃下保存。
实施例2新城疫病毒核酸标准物质的制备
1.新城疫病毒灭活
取实施例1制备的新城疫病毒的病毒液，65℃水浴2h，得到灭活的病毒液。
2.新城疫病毒灭活验证
取1mL步骤1制备的新城疫病毒液接种至SPF鸡胚，经培养后所接种接胚尿囊液无血凝特性且经PCR定量检测(检测方法具体可见实施例3)新城疫病毒核酸阴性，可认为新城疫病毒已灭活。
3.新城疫病毒液的冻干
1)冻干前准备
吸取新城疫病毒LaSota株原液500mL，吸取冻干保护剂500mL，病毒液与保护剂比例为1：1充分混匀，盖好瓶盖，放入超低温冰箱内预冻24小时，保证预冻为固体状态，取出准备冻干。其中，冻干保护剂为将50克明胶，250克蔗糖溶于1L纯净水中，高温高压灭菌(116℃)20min，2～8℃冰箱保存备用。
本发明人通过大量实验对牛奶蔗糖、明胶蔗糖保护剂冻干效果的比较发现，使用明胶蔗糖冻干保护剂冻干后的新城疫病毒核酸标准物质呈干粉状，物理状态良好，外观较为饱满，偶有裂隙。明胶和蔗糖含量对冻干效果比较试验表明冻干保护剂含质量分数为5％的明胶(g/mL)和25％的蔗糖(g/mL)对新城疫病毒核酸含量基本无影响，因此选择含5％明胶和25％蔗糖的冻干保护剂。
2)冻干程序
打开EYELA FDU-1200冻干机主开关，将“AUTO”指示灯熄灭，按下制冷控制按钮“Refrigerator RUN/STOP”，制冷启动，“Refrigerator RUN/STOP”指示灯点亮，当温度指示“TRAP TEMP”为-40℃时，将预先冷冻好的样品迅速放入干燥仓内并罩好干燥仓外罩，按下“VAC PUMP”按钮，“VAC PUMP”按钮指示灯点亮，真空泵启动，开始抽真空，当真空度指示“VACCUM GUARGE”为20Pa以下后进入正常工作状态开始冻干，冻干10小时。冻干结束后取出冻干瓶，压好胶塞并盖紧外盖，放入4℃冰箱保存。
实施例3新城疫病毒核酸标准物质数字PCR方法的建立
1.新城疫病毒引物、探针的设计
根据NDV F基因保守区，设计引物探针序列。
NDV上游引物(SEQ ID NO.1)：5’-AACAGCTGCACARATAACAGC-3’；
NDV下游引物(SEQ ID NO.2)：5’-TAACAAACTGCTGCATCTTCCC-3’；
NDV探针(SEQ ID NO.3)：5′-FAM-ATCCTCCGRCTTAAGGAGAGCATTGC–BHQ-3’。
扩增产物长度170bp，扩增目标序列(SEQ ID NO.4)如下：
AACTGCCGCACAAATAACAGCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAACATCCTCC GACTTAAAGAGAGCATTGCCGCAACCAATGAGGCTGTGCATGAGGTCACTGACGGATTATCGCAACTAGCAGTGGCGGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTA，其中下划线“-”为引物位置，“＝”为探针位置。
2.新城疫病毒RT-qPCR方法验证引物和探针
采用设计好的引物和探针建立RT-qPCR方法，RT-qPCR的反应体系为2×
3.新城疫病毒数字PCR方法条件的优化
1)引物和探针浓度的优化
用磁珠法自动提取试剂提取新城疫灭活病毒液核酸，梯度稀释5-4为体系摸索优化的模板，ddPCR实验体系的配制见表1，其中第一组引物和探针浓度分别为600nmol/L、150nmol/L；第二组引物和探针浓度分别为900nmol/Lol/L、250nmol/L；第三组引物和探针浓度分别为1200nmol/L、350nmol/L。
表1.ddPCR实验体系的配制
反应程序：45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃45s，40个循环；98℃10min；12℃60min。升降温速率2℃/s。结果见表2：三组的RSD值均小于5％，但是第一组，第三组，拷贝数明显低于第二组，因此，引物浓度定为第二组900nmol/L，探针浓度250nmol/L。
表2.不同引物和探针浓度扩增拷贝数分析
2)退火温度的优化
退火温度选择55℃，57℃，60℃，62℃；反应体系：Supermix 5.0μL，Reversetranscriptase 2.0μL，300mM DTT 1μL，10μM引物对1.8μL，10μM探针0.5μL，水7.7μL，模板2.0μL。反应程序：45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃45s，40个循环。升降温速率2℃/s。
退火温度优化结果见附图3。退火温度在60℃时，信号强度有所下降，拷贝数降低。因此，将退火温度定为55℃。
4.新城疫病毒数字PCR方法的线性关系及最低检测限测定
将10倍倍比稀释的已制备好的含有NDV病毒核酸梯度稀释10-0，10-1，10-2，10-3，10-4，每个浓度做3个重复检测。
反应体系：Supermix 5.0μL，Reverse transcriptase 2.0μL，300mM DTT 1μL，10μM引物对1.8μL，10μM探针0.5μL，水7.7μL，模板2.0μL。
反应程序：45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃45s，40个循环。升降温速率2℃/s。
NDV核酸倍比稀释检测结果见表3，当检测浓度低到10拷贝以下时，检测结果CV值为4.97％，小于5％，表明该方法能够稳定检出浓度为1.8copies/μL的样品，因此该方法最低检测下限为1.8copies/μL。
表3.倍比稀释(10倍)NDV核酸检测结果
通过NDV核酸梯度稀释后检测其拷贝数，并绘制线性图谱，如附图4所示，R2＝0.9989>0.99，线性关系良好。
5新城疫病毒数字PCR方法特异性试验
提取H9N2亚型禽流感病毒(H9N2)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、禽传染性喉气管炎病毒(AILTV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)等病毒核酸，稀释到近似103copies/μL，按步骤3和步骤4确定的反应体系和程序进行RT-ddPCR检测，验证本方法特异性。结果见表4，除NDV特异性扩增外其他检测均为阴性，表明该方法特异性较好。
表4.NDV数字PCR方法特异性试验
6.新城疫病毒数字PCR方法重复性验证试验
取1份NDV核酸，按步骤3和步骤4确定的反应体系和程序进行RT-ddPCR重复测定10次。结果见表5，变异系数为2.4％，说明本方法方法重复性好，检测结果稳定、可靠。
表5.NDV重复性检测
实施例4新城疫病毒核酸标准物质分装
在一万级工作区内的Ⅱ级生物安全柜内进行。分装瓶为棕色10mL玻璃瓶，经过高压灭菌，分装前填充氮气，分装量每管500mg/瓶。将实施例2制备的冻干粉分装完毕后加橡胶软盖密封，最后加铝盖加固密封。最后置于(-20±2)℃环境中保存。
取样送检。合格后方可进入下道工序。在十万级车间内进行。成品按照说明书进行组装，完毕后(-20±2)℃环境中保存，避免反复冻融。
实施例5新城疫病毒核酸标准物质的检验
1.新城疫病毒核酸标准物质物理性状检验
新城疫病毒核酸标准物质呈白色均一粉末状。
2.新城疫病毒核酸标准物质灭活检验
取新城疫病毒核酸标准物质使用无核酸酶水溶解，取0.2mL该核酸标准物质接种5枚9日龄SPF鸡胚，37℃孵育120h，48h-120h内无死亡胚且接种鸡胚收获的尿囊液血凝效价为0，认为病毒灭活完全。检测结果表明新城疫病毒灭活完全。
3.新城疫病毒核酸标准物质支原体检验
利用支原体培养方式检测是否存在支原体污染。检测结果记录如表6，支原体检验为阴性。
表6.支原体检测结果记录
4.新城疫病毒核酸标准物质中其他病毒检验试验
将NDV标准物质100mg用1mL无核酸酶水溶解后，取200μL进行核酸提取，并采用荧光定量PCR方法进行H9N2亚型禽流感病毒(H9N2)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、禽传染性喉气管炎病毒(AILTV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)核酸；其中H9N2、IBV、AILTV采用商品化试剂盒，EDSV、IBDV、FAdV-4荧光定量PCR检测方法参考已公开发表的文献进行检测。结果见表7，以上病毒均不产生“S”型扩增曲线，表明新城疫病毒核酸标准物质中无其他病毒。
表7.NDV核酸标准物质其他病毒检验
实施例6新城疫病毒核酸标准物质的评估
1.均匀性评估
1)先将实施例2制备的样品顺序编码，采用随机数表决定抽取15瓶样品的号码，作3次重复测定。
重复测定1：
13-38-48-90-3-61-15-91-69-11-70-43-54-59-36
重复测定2：
90-54-15-3-70-59-13-38-91-61-43-69-36-11-48
重复测定3：
36-54-13-11-38-3-15-43-59-48-90-70-61-69-91
2)每次每瓶样品取100mg，1 mL无核酸酶水溶解后，使用全自动核酸提取仪提取样品核酸。
3)使用实施例3建立的新城疫病毒RT-ddPCR方法进行检测。
4)计算15瓶新城疫核酸标准物质检测3次的结果均值，采用单因素方差分析法(F检验)对新城疫核酸标准物质进行均匀性检验。
上述步骤4)中所述使用单因素方差分析方法即：
设：
组间差方和：
组内差方和：
组间自由度：v1＝m-1
组内自由度：v2＝N-m
组间方差为：
组内方差为：
作统计量F：
由此可见，该统计量是自由度(v1,v2)的F分布变量。
5)根据自由度(v1,v2)及给定的显著性水平α，可由F表查的临界的Fα值。若按公式算得的F值满足F<Fα，则认为数据组间无明显差异。样品是均匀的，若F≥Fα，则怀疑各组件有系统差异，即样品之间存在差异。
式中：
Q1------------------组间差方和
Q2-----------------组内差方和
v1-------------------组间自由度
v2-------------------组内自由度
s1 2-------------------组间方差
s2 2-------------------组内方差
瓶间均匀性标准偏差sbb可以用公式计算：
在这种情况下，sbb等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量ubb
ubb＝sbb
式中：
sbb--------------瓶间标准偏差
n----------------组内测量次数
ubb--------------瓶间不均匀性导致的不确定度分量
如果均匀性评估的测量方法重复性较差，有可能导致
式中：
根据新城疫病毒核酸标准物质均匀性评估测量数值(表8)及所测样品的平均值、方差和测量次数(表9)进行单因素方差分析(表10)。
表8.NDV的标准物质均匀性评估的测量值
表9.样品的平均值、差方和测量次数
表10.方差分析
根据自由度(v_1,v_2)及给定的显著性水平α，可由表8查临界值的F值算得F<Fα(F(0.05,14,30)＝2.04)，说明组内与组间无统计学差异，因此本发明制得的新城疫病毒核酸标准物质是均匀的。
2.稳定性评估
1)短期稳定性评估(即样品运输过程中的稳定性)
随机抽取3瓶的新城疫病毒核酸标准物质，分别置于4℃，25℃或60℃保存1周，2周或4周，如表11安排实验计划。使用全自动核酸提取仪提取样品核酸。使用实施例3建立的新城疫病毒RT-ddPCR方法进行检测，每瓶样品做3个重复检测。根据抽样方法和检测次数，使用T检验对新城疫病毒核酸标准物质进行短期稳定性评估。
表11.实验计划表
注：4℃同步稳定性考察，即将样品定期(满足稳定性考察取样数量)保存在-80℃环境下，最后将所有取出的样本在重复性条件下完成测试。样品放置数量应足够检测至实验计划表时间或更长时间。25℃、60℃稳定性实验采用定时间检测观测结果。
1-1)4℃短期稳定性考察结果
4℃短期稳定性检测结果见表12。
T(0.95,2)*s(β_1)＝4.3*5.43E+01＝1.54E+03
结果与分析：对NDV标准物质的4℃贮存条件下稳定性结果进行分析，结果β_1小于T(0.95,2)*s(β_1)，故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。可认为本标准物质在4℃环境下可稳定4周。
表12.NDV标准物质4℃条件下拷贝数
1-2)25℃短期稳定性考察结果
NDV标准物质在25℃环境下存放1-2周与存放在-80℃环境中的检测结果(表13)分别进行了T检验统计分析(表14)，其中，存放7天时P值大于>0.05，因此认为NDV标准物质在25℃环境下存放1周的检测值与对照组标准物质的检测值不存在显著性差异，可认为本标准物质在25℃环境下可稳定1周。另外存放14天时P值小于0.05，因此认为NDV标准物质在25℃环境下存放2周的检测值与对照组标准物质的检测值存在显著性差异，可认为本标准物质在25℃环境下不能稳定2周。
1-3)60℃短期稳定性考察结果
新城疫病毒核酸标准物质在60℃环境下存放7天与存放在-80℃环境中的检测结果(表15)进行T检验统计分析(表16)，其中P值均小于0.05，因此认为新城疫病毒核酸标准物质在60℃环境下存放1周的检测值与对照组标准物质的检测值存在显著性差异，可认为本标准物质不能置于60℃环境下。
表13.NDV标准物质25℃条件下拷贝数
表14.NDV标准物质25℃短期稳定性配对T检验结果
表15.NDV标准物质60℃条件下拷贝数
表16.NDV标准物质60℃短期稳定性配对T检验结果
2)长期稳定性评估(即特定贮存条件下的稳定性)
随机抽取3瓶的新城疫病毒核酸标准物质，分别置于-20℃保存1，2，4，6个月。使用全自动核酸提取仪提取样品核酸，使用实施例3建立的新城疫病毒RT-ddPCR方法进行检测，每瓶样品做3个重复检测，根据抽样方法和检测次数，使用T检验对新城疫病毒核酸标准物质进行长期稳定性评估。结果见表17。
T(0.95,3)查表得：3.18。
T(0.95,3)*s(β1)＝3.18*4.79E+02＝1.52E+03
通过计算得出果β1小于T(0.95,3)*s(β1)，(应该是大于)故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。可认为本标准物质在-20℃环境下可稳定6个月。
表17.NDV-20℃标准物质的拷贝数表
实施例7新城疫病毒核酸标准物质的定值
将实施例4中得到的均匀性高且稳定的新城疫病毒核酸标准物质进行定值，定值表示为标准值±扩展不确定度。选择具有一定技术权威性，在测定标准物质特性量方面具有必备条件以及同等的技术能力和经验的8家实验室各自独立使用数字PCR方法对标准物质的特性值进行测量。
1.新城疫病毒核酸标准物质的标准值
1)标准物质特征值测量
选择具备资质的8家实验室，编号依次为：A—H，8家实验室各自独立使用数字PCR方法对实施例4制备的4瓶均匀性高且稳定的新城疫病毒核酸标准物质进行测量，每瓶物质重复2次，提供8个特征值。测量特征值见表18。
2)实验室内数据可疑值检验
用狄克逊法和格拉布斯法分别检验8家实验室的8组数据的可疑值，结合技术上的判断，剔除可疑值。
表18.NDV核酸标准物质合作定值试验数据汇总(copies/mg)
续表18.NDV核酸标准物质合作定值试验数据汇总(copies/mg)
其中狄克逊法：将测定数据按从小到大的顺序排列，分别计算r1值和rn值，r1＝(X(2)-X(1))/(X(n)-X(1))，rn＝(X(n)-X(n-1))/(X(n)-X(1))。若r1>rn，且r1>f(a,n)，则判定X(1)为异常值；若r1<rn且rn>f(a,n)，则判定X(n)为异常值；若r1和rn值均小于f(a,n)，则所有数据保留，结果见表19。
表19.狄克逊法对每个操作者的数据处理及结论
格拉布斯法中，残差
表20.格拉布斯法对每个操作者的数据处理及结论
3)组间数据等精度检验
对各组数据的标准偏差用科克伦法进行等精度检验，对有显著性差异的数据组在进行技术审查后再决定是否予以剔除。
采用科克伦法检验平均值间是否等精度，先计算m组数据的各组n个数据的方差，再计算其中的最大方差与m个方差和之比：
4)整体数据正态分布检验
本次数据为64个，适合用达戈斯提诺(D’Agostoon)法检验数据的正态性。
根据数据计算Y值为-0.48，当n＝64，置信概率为95％时，Y值落入区间(-2.64～1.19)范围内，接受数据为正态分布。
5)新城疫病毒核酸标准物质标准值计算
根据步骤表18中得到的8个平均值再次计算平均值，得到的总平均值即为新城疫病毒核酸标准物质标准值。
E+05copies/mg2.新城疫病毒核酸标准物质的扩展不确定度
新城疫病毒核酸标准物质定值结果的不确定度由均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度以及定值过程带来的不确定度。
1)均匀性引入的不确定度的评定
均匀性引入的不确定度由实施例6步骤1中计算得出均匀性引入的不确定度ubb＝sbb＝1.05E+03copies/mg，相对标准不确定度urel(bb)为0.0065。
2)稳定性引入的不确定度的评定
对保存在(-20±2)℃环境中的标准物质，每个月检测一次。每次检测结束后，对数据进行处理，计算其斜率、截距和不确定度。暂定产品有效期为6个月，则有效期t＝6个月的稳定性不确定度贡献为：
us＝s(β1)·X
而其量值为前6个月稳定性试验检测的均值，计算结果：
s(β1)＝480copies/mg
us＝2.9E+03copies/mg
相对标准不确定度urel(s)＝0.018
3)定值过程引入的不确定度的评定
定值过程引入的不确定度包括不确定度的A类评定u(A)和不确定度的B类评定u(B)。
由定值测量重复性引入的不确定度u(A)可由测量的相对标准偏差计算。
u(A)＝s(A)＝5.4E+02copies/mg
相对标准不确定度urel(A)＝0.0071
B类评定包含两部分：一部分是天平称量引入的不确定度，一部分是检测仪器引入的不确定度。其中检测仪器包括移液器和数字PCR。
3-1)天平不确定度的评定
天平不确定度是参考本次所用的电子天平，型号为：ML104/02，制造厂：METTLER，其校准证书编号为：JA18J-AD000347。其计量性能要求，MPE：±0.5mg；试验载荷：0.0100g；其不确定度U＝0.5(mg)。需称量的重量为100mg，计算其
不确定度
3-2)移液器不确定度的评定
在联合定值过程中，所用的100mg标准物质的总含量为1.7×107copies，第一步用100-1000μL的移液器取200μL的洗脱液将核酸洗脱到离心管中(移液器相对不确定度2％)并使RNA溶液混合均匀。第二步稀释是用10-100μL的移液器取100μL的RNA溶液到离心管中(移液器相对不确定度2％)，然后用100-1000μL的移液器吸取900μLddH2O(移液器相对不确定度1％)与RNA溶液混合均匀，将溶液体积定到1000μL，实现10倍的稀释。计算梯度稀释RNA标准溶液引入的不确定度，稀释标准溶液的合成相对标准不确定度uc(C)为：
式中：
vr(V1)-吸取的核酸洗脱液体积200μL的相对不确定度
vr(V2)-吸取的核酸样品溶液体积100μL的相对不确定度
vr(V3)-吸取的ddH2O体积的相对不确定度(900μL，进行10倍稀释)
用100-1000μL移液器移取200μL溶液的相对不确定度：
V1的相对标准不确定度：
式中：2％是用移液器移取200μL水的相对不确定度；Δv代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
用10-100μL移液器移取100μL溶液的相对不确定度：
V2的相对标准不确定度：
式中：2％是用移液器移取100μL原液的相对不确定度；Δv代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
用10-1000μL移液器移取900μL水的相对不确定度：
式中：1％是用移液器移取900μL水的相对不确定度；Δv代表不同温度下溶液体积的变化，0.0008为不同温度下溶液体积的补正值。
因此，合成相对不确定度：
梯度稀释RNA标准溶液引入的不确定度为：
3-3)数字PCR仪不确定度的评定
本试验中使用了QX100、QX200和QuantStudio 3D三种型号的数字PCR仪，由于后两种仪器为最新型号仪器，故尚无不确定度方面的相关资料报道，故本试验中统一使用QX100的相对不确定度为本试验的B类相对不确定度。
根据数字PCR仪器测量过程中产生的相对不确定度由两部分组成：精确性引入的相对标准不确定度为1.6％和微滴体积引入的相对标准不确定度为0.8％。因此，由数字PCR仪引起B类相对不确定度为：
合成B类不确定度：
标准物质定值过程中引入的相对不确定度：
3.新城疫病毒核酸标准物质的量值和扩展不确定度
新城疫病毒核酸标准物质的量值和扩展不确定度计算结果见表21。
表21.新城疫病毒核酸标准物质量值和扩展不确定度
4.新城疫病毒核酸标准物质量值结果
新城疫病毒核酸标准物质的认定值为1.7×105copies/mg，扩展不确定度为0.2×105copies/mg(见表22)。
表22.NDV标准物质量值结果
序列表
<110> 北京市动物疫病预防控制中心
<120> 一种冻干型新城疫病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacagctgca carataacag c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taacaaactg ctgcatcttc cc 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcctccgrc ttaaggagag cattgc 26
<210> 4
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aactgccgca caaataacag cggccgcagc tctgatacaa gccaaacaaa atgctgccaa 60
catcctccga cttaaagaga gcattgccgc aaccaatgag gctgtgcatg aggtcactga 120
cggattatcg caactagcag tggcggttgg gaagatgcag cagtttgtta 170
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