阅读说明：本技术 猪圆环病毒ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法 (Preparation method of porcine circovirus type II-porcine Seneca valley virus bivalent inactivated vaccine antigen ) 是由 崔龙萍 江兴华 徐丽云 陈丽萍 包松英 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法,1)将培养至单层的BHK-21细胞用胰酶消化,然后加入MEM营养液终止消化,细胞计数后稀释为密度为2×10<Sup>4</Sup>个/mL的BHK-21细胞悬液；2)将猪圆环病毒Ⅱ型接种BHK-21细胞悬液中,培养48h后更换细胞维持液并同时接种猪塞尼卡谷病毒,继续培养；3)接种两种病毒抗原的BHK-21细胞培养24h左右,根据细胞病变情况收获细胞,收获细胞后的病毒液反复冻融后置于-40℃以下环境中储存。本发明将猪圆环病毒Ⅱ型和猪塞尼卡谷两种病毒先后都接种于同一种细胞中进行培养,根据细胞病变程度决定抗原收获时间,生产猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活苗抗原,提高了生产效率,节约了生产成本,提升了产品质量。(The invention discloses a preparation method of a porcine circovirus type II-porcine Seneca valley virus bivalent inactivated vaccine antigen, 1) a BHK-21 cell cultured to a single layer is digested by pancreatin, then MEM nutrient solution is added to stop the digestion, and the cell is diluted to the density of 2 multiplied by 10 after counting 4 BHK-21 cell suspension per mL; 2) inoculating porcine circovirus type II into BHK-21 cell suspension, culturing for 48h, changing cell maintenance liquid, inoculating porcine Saikaca valley virus, and culturing; 3) BHK-21 cells inoculated with two virus antigens are cultured for about 24h, the cells are harvested according to the cytopathic condition, and virus liquid after harvesting the cells is repeatedly frozen and thawed and then stored in an environment below 40 ℃. The invention inoculates two viruses of porcine circovirus type II and porcine seneca valley in sequence in the same cell for culture, determines the antigen harvesting time according to the cytopathic degree, and produces the porcine circovirus type II-porcine seneca valley virus IIThe combined inactivation vaccine antigen improves the production efficiency, saves the production cost and improves the product quality.)

猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备 方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒Ⅱ型是猪圆环病毒病的致病抗原，该病的临床症状较复杂，主要表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、间质性肺炎、繁殖障碍、先天性震颤等，具有较高的发病率和死亡率，一直是我国各大猪场重点防控疾病之一。接种猪圆环病毒Ⅱ型疫苗可以有效防控该病，也是我国目前防控该病最有效的措施。

猪塞尼卡谷病毒亦称猪塞尼卡病毒，是近几年才被发现并进行分类的一种可引起猪感染和发病的小核糖 RNA 病毒。临床上，塞尼卡谷病毒主要引起猪的水泡样病变，感染猪的鼻吻部、蹄部冠状带等出现明显水泡，与***、猪水泡性口炎、猪水疱病、猪水泡性疹等疾病的病变十分相似，肉眼难以区分。该病毒是外来病原，于2015年传入中国，先后在福建、广东、广西、河南、河北、山东、辽宁等省迅速扩散开来，引起大量猪场发病，尤其对新生仔猪影响更大，其致死率可达30%-70%。到目前为止，我国仍然没有商品化的塞尼卡谷疫苗可用，猪场一旦发病将处于失控状态，防控形势严峻，研发该病毒疫苗迫在眉睫。

上述两种病毒都给我国养猪业带来了非常巨大的经济损失，严重制约我国养猪业的发展。猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗的研发具有重要意义。传统二联灭活疫苗抗原的制备方法是将两种病毒分别在各自敏感细胞上繁殖后分别收获两种病毒抗原，然后两种抗原分别进行灭活，最后再将两种灭活后抗原混合在一起进行乳化。该方法存在以下不足：1．猪圆环病毒Ⅱ型单独进行细胞培养时，不产生细胞病变，不利于病毒收获时间的确定。2．两种抗原分开培养需要消耗更多的人力、物力。3．两种抗原灭活后再混合乳化易出现局部抗原混合不均匀的现象，同时工序较繁锁，效率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，改变了传统二联灭活疫苗抗原的制备方法，提高了生产效率，节约了生产成本，提升了产品质量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，包括以下步骤：

1） BHK-21细胞的制备：

将培养至单层的BHK-21细胞用胰酶按常规消化法消化，然后加入含8-8.5%胎牛血清的MEM营养液终止消化，细胞计数后，将其稀释为密度为2×10⁴个/mL的BHK-21细胞悬液；

2）猪圆环病毒Ⅱ型与猪塞尼卡谷病毒接种：

将猪圆环病毒Ⅱ型接种于上述BHK-21细胞悬液中，接种量为细胞悬液体积的5-5.5%，于37℃二氧化碳培养箱中培养48h，然后更换细胞维持液并同时接种猪塞尼卡谷病毒，接种量为细胞维持液的0.1-0.12%，然后再于37℃二氧化碳培养箱中培养；

3）抗原收获：

接种两种病毒抗原的BHK-21细胞在37℃二氧化碳培养箱中培养22-26h，根据细胞病变情况收获细胞，收获细胞后的病毒液反复冻融三次后，即得到猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原，置于-40℃以下环境中储存。

步骤1）所述胰酶的质量浓度为0.23-0.27%。

步骤2）所述猪圆环病毒Ⅱ型为DBN-SX07毒株，效价为10^7.5TCID₅₀/mL。

步骤2）所述猪塞尼卡谷病毒为SD02毒株，效价为10^9.4TCID₅₀/mL。

步骤2）所述细胞维持液为添加1%胎牛血清的MEM营养液。

步骤3）中，细胞病变达80%时，收获细胞。

本发明采用以上技术方案，将猪圆环病毒Ⅱ型和猪塞尼卡谷两种病毒先后都接种于同一种细胞中进行培养，同时繁殖两种病毒，收获一种细胞培养液，同时获得两种病毒抗原液，根据细胞病变程度决定抗原收获时间，生产猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活苗抗原。

本发明的有益效果在于；

1、可根据细胞病变情况确定抗原收获时间

猪圆环病毒Ⅱ型感染细胞后不产生细胞病变，故临床上收获病毒抗原多以固定时间收获方式，本发明中BHK-21细胞在接种猪圆环病毒Ⅱ型后再接种猪塞尼卡谷病毒则会出现明显的细胞病变，则可根据细胞病变进行病毒抗原收获。

2、提升工作效率，节约生产成本

采用本发明方法可将原来需分开培养收获的两种抗原改成同时培养收获，采用同一批细胞先后接种两种病毒共同繁殖后再一起收获，减少操作工序，提升了工作效率（原先培养一批抗原需要5天，本发明只需3天），同时可大大减少细胞、转瓶、血清和营养液的使用，节约生产成本。

3、两种抗原的分布更均匀

传统方法是将分开培养收获的两种抗原进行混合制备二联苗，每一种抗原都会存在含病毒颗粒的细胞碎片或细胞团块，往往细胞团块大小不一，导致两种抗原混合后病毒含量不均匀。本发明培养的抗原中含有两种毒病，而且每个含毒细胞中都含有两种病毒抗原，不需要再人工进行混匀。

具体实施方式

实施例1

猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，包括以下步骤：

1） BHK-21细胞的制备：

将培养至单层的BHK-21细胞用质量浓度为0.25%的胰酶按常规消化法消化，然后加入含8%胎牛血清的MEM营养液终止消化，细胞计数后，将其稀释为密度为2×10⁴个/mL的BHK-21细胞悬液；

2）猪圆环病毒Ⅱ型与猪塞尼卡谷病毒接种：

将猪圆环病毒Ⅱ型（DBN-SX07毒株，效价为10^7.5TCID₅₀/mL）接种于上述BHK-21细胞悬液中，接种量为细胞悬液体积的5%，于37℃二氧化碳培养箱中培养48h，然后更换细胞维持液（添加1%胎牛血清的MEM营养液）并同时接种猪塞尼卡谷病毒（SD02毒株，效价为10^9.4TCID₅₀/mL），接种量为细胞维持液的0.1%，然后再于37℃二氧化碳培养箱中培养；

3）抗原收获：

接种两种病毒抗原的BHK-21细胞在37℃二氧化碳培养箱中培养24h左右，根据细胞病变情况收获细胞（细胞病变达80%以上时收获），收获细胞后的病毒液反复冻融三次后置于-40℃以下环境中储存。

收获的病毒液中两种病毒的效价测定如下：

（1）猪圆环病毒Ⅱ型效价测定：

用5% MEM PK-15细胞悬液以10倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^{-4 .0}～10 ^{-6 .0})的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度6孔，每孔100µL，37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h后换2%MEM细胞维持液，细胞板放入37℃、5％ CO₂培养箱中再培养48h后用80%的丙酮固定0.5h,然后37℃先后孵育一、二抗各一小时，最后用荧光显微镜观察病毒感染情况。用Reed-Muench氏计算法测得收获的病毒悬液中猪圆环病毒Ⅱ型效价为10^7.0TCID₅₀/mL。

（2）塞尼卡谷病毒效价测定

将BHK-21细胞铺于96孔板中，于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，待细胞单层长到80％时备用。用含2%胎牛血清的MEM细胞维持液以10倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^{-7 .0}～10^{-9 .0})的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度6孔，每孔100µL，每孔再另外加入100µL维持液，放入37℃、5％ CO₂培养箱中培养4天，并观察病变，记录第4天的细胞病变结果。用Reed-Muench氏计算法算得收获病毒悬液中猪塞尼卡谷病毒效价为10^9.0TCID₅₀/mL。

实施例2

猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，包括以下步骤：

1） BHK-21细胞的制备：

将培养至单层的BHK-21细胞用质量浓度为0.23%的胰酶按常规消化法消化，然后加入含8.5%胎牛血清的MEM营养液终止消化，细胞计数后，将其稀释为密度为2×10⁴个/mL的BHK-21细胞悬液；

2）猪圆环病毒Ⅱ型与猪塞尼卡谷病毒接种：

将猪圆环病毒Ⅱ型（DBN-SX07毒株，效价为10^7.5TCID₅₀/mL）接种于上述BHK-21细胞悬液中，接种量为细胞悬液体积的5.5%，于37℃二氧化碳培养箱中培养48h，然后更换细胞维持液（添加1%胎牛血清的MEM营养液）并同时接种猪塞尼卡谷病毒（SD02毒株，效价为10^9.4TCID₅₀/mL），接种量为细胞维持液的0.12%，然后再于37℃二氧化碳培养箱中培养；

3）抗原收获：

接种两种病毒抗原的BHK-21细胞在37℃二氧化碳培养箱中培养24h左右，根据细胞病变情况收获细胞（细胞病变达80%以上时收获），收获细胞后的病毒液反复冻融三次后置于-40℃以下环境中储存。

收获的病毒液中两种病毒的效价测定如下：

（1）猪圆环病毒Ⅱ型效价测定：

用5% MEM PK-15细胞悬液以10倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^{-4 .0}～10 ^{-6 .0})的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度6孔，每孔100µL，37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h后换2%MEM细胞维持液，细胞板放入37℃、5％ CO₂培养箱中再培养48h后用80%的丙酮固定0.5h,然后37℃先后孵育一、二抗各一小时，最后用荧光显微镜观察病毒感染情况。用Reed-Muench氏计算法测得收获的病毒悬液中猪圆环病毒Ⅱ型效价为10^7.1TCID₅₀/mL。

（2）塞尼卡谷病毒效价测定

将BHK-21细胞铺于96孔板中，于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，待细胞单层长到90％时备用。用含2%胎牛血清的MEM细胞维持液以10倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^{-7 .0}～10^{-9 .0})的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度6孔，每孔100µL，每孔再另外加入100µL维持液，放入37℃、5％ CO₂培养箱中培养4天，并观察病变，记录第4天的细胞病变结果。用Reed-Muench氏计算法算得收获病毒悬液中猪塞尼卡谷病毒效价为10^9..05TCID₅₀/mL。

实施例3

猪圆环病毒Ⅱ型-猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，包括以下步骤：

1） BHK-21细胞的制备：

将培养至单层的BHK-21细胞用质量浓度为0.27%的胰酶按常规消化法消化，然后加入含8%胎牛血清的MEM营养液终止消化，细胞计数后，将其稀释为密度为2×10⁴个/mL的BHK-21细胞悬液；

2）猪圆环病毒Ⅱ型与猪塞尼卡谷病毒接种：

将猪圆环病毒Ⅱ型（DBN-SX07毒株，效价为10^7.5TCID₅₀/mL）接种于上述BHK-21细胞悬液中，接种量为细胞悬液体积的5.2%，于37℃二氧化碳培养箱中培养48h，然后更换细胞维持液（添加1%胎牛血清的MEM营养液）并同时接种猪塞尼卡谷病毒（SD02毒株，效价为10^9.4TCID₅₀/mL），接种量为细胞维持液的0.11%，然后再于37℃二氧化碳培养箱中培养；

3）抗原收获：

接种两种病毒抗原的BHK-21细胞在37℃二氧化碳培养箱中培养24h左右，根据细胞病变情况收获细胞（细胞病变达80%时收获），收获细胞后的病毒液反复冻融三次后置于-40℃以下环境中储存。

收获的病毒液中两种病毒的效价测定如下：

（1）猪圆环病毒Ⅱ型效价测定：

用5% MEM PK-15细胞悬液以10倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^{-4 .0}～10 ^{-6 .0})的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度6孔，每孔100µL，37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h后换2%MEM细胞维持液，细胞板放入37℃、5％ CO₂培养箱中再培养48h后用80%的丙酮固定0.5h,然后37℃先后孵育一、二抗各一小时，最后用荧光显微镜观察病毒感染情况。用Reed-Muench氏计算法测得收获的病毒悬液中猪圆环病毒Ⅱ型效价为10^6.9TCID₅₀/mL。

（2）塞尼卡谷病毒效价测定

将BHK-21细胞铺于96孔板中，于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，待细胞单层长到85％时备用。用含2%胎牛血清的MEM细胞维持液以10倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^{-7 .0}～10^{-9 .0})的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度6孔，每孔100µL，每孔再另外加入100µL维持液，放入37℃、5％ CO₂培养箱中培养4天，并观察病变，记录第4天的细胞病变结果。用Reed-Muench氏计算法算得收获病毒悬液中猪塞尼卡谷病毒效价为10^9.1TCID₅₀/mL。