阅读说明：本技术 一种聚酮化合物pyoluteorin及制备方法与用途 (Polyketide pyoluteorin and preparation method and application thereof ) 是由 张卫东 沈云亨 丁婷 李慧梁 徐希科 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种聚酮化合物pyoluteorin,化学结构如式I所示：<Image he="354" wi="454" file="DDA0002218639490000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>所述聚酮化合物pyoluteorin是从湿地土壤来源的黑曲霉中分离制备得到。本发明的聚酮化合物pyoluteorin对人肺腺癌细胞、人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、人三阴性乳腺癌细胞和人三阳性乳腺癌细胞具有较好的细胞毒活性,其中对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞毒活性尤其显著,且对正常乳腺上皮细胞MCF-10A毒性较小,故可用于制备抗肿瘤药物。(The invention discloses a polyketide pyoluteorin, the chemical structure of which is shown as formula I: the polyketide pyoluteorin is obtained by separating and preparing from aspergillus niger derived from wetland soil. The polyketide pyoluteorin has good cytotoxic activity on human lung adenocarcinoma cells, human colon cancer cells, human breast cancer cells, human triple-negative breast cancer cells and human triple-positive breast cancer cells, wherein the polyketide pyoluteorin has good cytotoxic activity on human triple-negative breast cancer cells MDA-MBThe-231 has particularly remarkable cytotoxic activity and has small toxicity to normal mammary epithelial cells MCF-10A, so that the derivative can be used for preparing antitumor drugs.)

一种聚酮化合物pyoluteorin及制备方法与用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种从黑曲霉(Aspergillus niger)中分离得到的聚酮化合物pyoluteorin及其制备方法，以及该化合物在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

毛霉科曲霉属真菌在全世界范围内有超过180个种，现已从该属真菌中分离得到大量结构新颖且活性较好的次生代谢产物，化合物类型多为生物碱、萜类、细胞松弛素和木脂素类(Happi G M,Kouam S F,Talontsi F M,et al.ChemInform Abstract:A NewDimeric Naphtho-γ-pyrone from an Endophytic Fungus Aspergillus niger AKRNAssociated with the Roots of Entandrophragma congoense Collected in Cameroon[J].Cheminform,2015,70(9):625-630.)。黑曲霉是曲霉属真菌中较引人注目的一个种，其生产的次生代谢产物具有较好的化学多样性和生物活性。从黑曲霉中分离得到的萘并-γ-吡喃酮、asperazines和fumonisins类化合物抗菌和抗肿瘤活性显著(Pan-Pan Z,ShuangS,Jia-Jia L,et al.A new diphenolic metabolite isolated from the marine-derived fungus Aspergillus niger.02[J].Journal of Asian Natural ProductsResearch,2018:1-7.)。例如，从Aspergillus niger 2HL-M-8中分离得到的萘并-γ-吡喃酮化合物fonsecinones C对人肺腺癌细胞A549、白血病细胞HL-60和胃癌细胞MGC-803具有较好的细胞毒性，IC₅₀值分别为2.8、0.8和2.2μM(Li D H,Han T,Guan L P,et al.Newnaphthopyrones from marine-derived fungus Aspergillus niger 2HL-M-8and theirin vitro antiproliferative activity.[J].Natural Product Research,2016,30(10):1116.)。从Aspergillus niger BRF074中分离得到的一个新型呋喃酯型衍生物能显著抑制结肠癌细胞HCT-116的增殖(Uchoa P K S,Pimenta AT A,Braz-Filho R,et al.Newcytotoxic furan from the marine sediment-derived fungi,Aspergillus niger[J].Natural Product Research,2017:1-5.)。前人的研究表明黑曲霉次生代谢产物在开发新型抗肿瘤药物上具有较大的应用前景。

鉴于黑曲霉次生代谢产物抗肿瘤活性显著，且现有技术对土壤来源的黑曲霉化合物研究较少，所以亟需对湿地土壤来源的黑曲霉进行系统化学成分研究，以期从中分离得到有较好抗肿瘤活性的化合物。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种从湿地土壤来源的黑曲霉中分离得到活性显著的次生代谢产物聚酮化合物pyoluteorin。

本发明的第二个目的是提供一种所述聚酮化合物pyoluteorin的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种所述聚酮化合物pyoluteorin在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明对一株来自于湿地土壤的黑曲霉的次生代谢产物进行了系统研究，从中发现了一个聚酮化合物pyoluteorin。经体外细胞毒活性筛选发现，该化合物对人肺腺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7，HCC1954)、人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468)和人三阳性乳腺癌细胞(BT474)具有较好的细胞毒活性，其中对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞毒活性尤其显著，且对正常乳腺上皮细胞MCF-10A毒性较小。以MDA-MB-231细胞为模型进行作用机制研究，研究表明pyoluteorin可通过诱导细胞G2/M期周期阻滞和细胞凋亡来抑制细胞的生长，且细胞凋亡与线粒体膜电位(MMP)下降以及细胞内活性氧ROS含量的增加有关。因此，本发明中的聚酮化合物pyoluteorin具有成为抗肿瘤药物的巨大潜力。

本发明的第一方面提供了一种聚酮化合物pyoluteorin，其化学结构如式I所示：

所述聚酮化合物pyoluteorin是从湿地土壤来源的黑曲霉(Aspergillus niger)中分离制备得到。

本发明的第二方面提供了一种所述聚酮化合物pyoluteorin的制备方法，包括以下步骤：

将黑曲霉发酵液过滤除去菌丝，加入乙酸乙酯进行液-液萃取，经浓缩后得到乙酸乙酯部位；萃取后的发酵液过大孔树脂，以甲醇进行洗脱，得到大极性部位；合并乙酸乙酯部位和大极性部位，分离并纯化得到目标化合物聚酮化合物pyoluteorin。

所述黑曲霉发酵液的制备方法包括以下步骤：

将纯化的黑曲霉菌株接种于改良马丁固体培养基中，在温度为28℃的条件下培养7天，培养结束后，将含有菌株的琼脂平板切割成小块，接种于2L的锥形瓶中，每个锥形瓶均加入已灭菌的1L改良马丁液体培养基，在温度为28℃的条件下发酵28天，获得黑曲霉发酵液。

所述黑曲霉菌株的制备方法包括以下步骤：

将新鲜湿地土壤加入蒸馏水以1:100倍比例稀释混合均匀，取100μL土壤稀释液涂布于分离培养基上，在温度为28℃的条件下培养4天，待菌株长出后挑取纯化，获得黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。

所述分离培养基的成分如下：改良马丁固体培养基(5.0g/L蛋白胨，1.0g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，2.0g/L酵母浸出粉，20.0g/L葡萄糖，14.0g/L琼脂等)，在上述改良马丁固体培养基中加入重铬酸钾(50mg/L)和萘啶酮酸(20mg/L)作为抑菌剂。

所述分离并纯化包括以下步骤：

经中低压反相柱色谱，以ODS和Sephadex LH-20作为固定相，以MeOH-H₂O 10％-100％按洗脱梯度的不同得到32个组分：E1-E16 10％-50％；E17-E28 50％-100％；E29-E32100％；组分E21经Sephadex LH-20以MeOH-H₂O 70％等度洗脱收集得到13个组分E21-1—E21-13；其中，组分E21-13为目标化合物pyoluteorin。

本发明的第三方面提供了一种所述聚酮化合物pyoluteorin在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤为乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺腺癌、结肠癌等，尤其是三阴性乳腺癌。

所述抗肿瘤药物是以本发明的聚酮化合物pyoluteorin作为活性成分组成的药物或者药用组合物，包括与药用载体组合，用于制备抗肿瘤相关的药物；可通过口服、非肠道、脑内直接给药、鼻腔脑靶向给药、基因工程法、受体介导转运法给药或其它局部途径给药；给药剂型可以是片剂(分散片、含片、口崩片、缓释片)、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、乳剂、溶液、悬浮液、注射剂、滴注剂、粉针剂或气雾剂等药学上可接受的剂型。

本发明的聚酮化合物pyoluteorin对人肺腺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7，HCC1954)、人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468)和人三阳性乳腺癌细胞(BT474)具有较好的细胞毒活性，其中对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞毒活性尤其显著，且对正常乳腺上皮细胞MCF-10A毒性较小，故可用于制备抗肿瘤药物。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的聚酮化合物pyoluteorin来自于微生物黑曲霉，微生物的大批量发酵分离相较于植物提取来说更具环境友好性和资源可再生性。从化学角度而言，聚酮化合物pyoluteorin已具有较成熟的合成条件，故化合物的来源多样，且资源丰富。第二方面，该聚酮化合物pyoluteorin对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞具有非常显著的细胞毒活性，且对正常乳腺上皮细胞MCF-10A毒性较小，有望开发为治疗三阴性乳腺癌的药物。

附图说明

图1为聚酮化合物pyoluteorin对MDA-MB-231细胞生长抑制作用曲线图，浓度为0.032uM、0.16uM、0.8uM、4uM、20uM、100uM的聚酮化合物pyoluteorin作用24、48、72h后对MDA-MB-231细胞的抑制率。

图2为聚酮化合物pyoluteorin能够诱导细胞G₂/M期阻滞作用的示意图。实验数据均以平均数±标准误表示，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)，Tukey test检验，P<0.05为差异显著(*,P<0.05；**,P<0.01vs.Vehicle)。

图3为不同剂量的聚酮化合物pyoluteorin诱导MDA-MB-231细胞凋亡的示意图。

图4为不同剂量的聚酮化合物pyoluteorin诱导MDA-MB-231细胞凋亡的趋势统计示意图。实验数据均以平均数±标准误表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan test检验，P<0.05为差异显著(*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001vs.Vehicle)。

图5中，A是不同浓度聚酮化合物pyoluteorin作用后，MDA-MB-231细胞的线粒体膜电位激光共聚焦荧光图像示意图(a.空白对照；b.0.1μM pyoluteorin；c.0.3μMpyoluteorin；d.1μM pyoluteorin；e.3μM pyoluteorin；f.10μM pyoluteorin)；B是JC-1单体荧光强度与JC-1聚合物荧光强度的比值与不同浓度聚酮化合物pyoluteorin的示意图。

图6为不同浓度聚酮化合物pyoluteorin作用后，MDA-MB-231细胞内活性氧ROS的含量示意图；其中A为流式细胞仪检测DCFH-DA荧光强度示意图；B为MDA-MB-231细胞内活性氧ROS含量示意图。实验数据均以平均数±标准误表示，采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，Duncan test检验，P<0.05为差异显著(*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001vs.Vehicle)。

图7为不同浓度聚酮化合物pyoluteorin作用后，MDA-MB-231细胞内活性氧ROS的激光共聚焦检测图像示意图；A空白对照；B为0.1μM pyoluteorin；C为0.3μM pyoluteorin；D为1μM pyoluteorin；E为3μM pyoluteorin；F为10μM pyoluteorin。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：聚酮化合物pyoluteorin的制备

1.样品来源

来自上海共青国家森林公园湿地土壤。

2.菌株发酵，提取分离与纯化方法

将取回的新鲜湿地土壤加入蒸馏水以1:100倍比例稀释混合均匀，取100μL土壤稀释液涂布于分离培养基(分离培养基：改良马丁固体培养基(5.0g/L蛋白胨，1.0g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，2.0g/L酵母浸出粉，20.0g/L葡萄糖，14.0g/L琼脂等)，在上述改良马丁固体培养基中加入重铬酸钾(50mg/L)和萘啶酮酸(20mg/L)作为抑菌剂。)上，在温度为28℃的条件下培养4天，待菌株长出后挑取纯化，获得黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。

将上述纯化的黑曲霉菌株接种于改良马丁固体培养基(5.0g/L蛋白胨，1.0g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，2.0g/L酵母浸出粉，20.0g/L葡萄糖，14.0g/L琼脂等)中，在温度为28℃的条件下培养7天。培养结束后，将含有菌株的琼脂平板切割成小块，接种于2L的锥形瓶中(2L×32，每个锥形瓶均加入已灭菌的1L改良马丁液体培养基(5.0g/L蛋白胨，1.0g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，2.0g/L酵母浸出粉，20.0g/L葡萄糖等))，在温度为28℃的条件下发酵28天，获得黑曲霉发酵液。发酵结束后，将发酵液过滤除去菌丝，用乙酸乙酯(30L)进行液-液萃取5次，浓缩后得到乙酸乙酯部位(12g)。萃取后的发酵液过大孔树脂(日本三零DIAION HP-20)，并以100％甲醇进行洗脱，得到大极性部位(2g)。合并上述两个部位(乙酸乙酯部位12g+大极性部位2g)，经中低压反相柱色谱，并以ODS和Sephadex LH-20作为固定相，以甲醇和水的不同比例作为洗脱剂，以MeOH-H₂O 10％-100％按洗脱梯度的不同得到32个组分，E1-E16 10％-50％；E17-E28 50％-100％；E29-E32 100％；E1(532mg)，E2(2.5g)，E3(120mg)，E4(110mg)，E5(83mg)，E6(149mg)，E7(96mg)，E8(181mg)，E9(98mg)，E10(132mg)，E11(320mg)，E12(423mg)，E13(89mg)，E14(310mg)，E15(736mg)，E16(203mg)10％-50％；E17(76mg)，E18(134mg)，E19(234mg)，E20(260mg)，E21(478mg)，E22(135mg)，E23(229mg)，E24(112mg)，E25(180mg)，E26(419mg)，E27(256mg)，E28(146mg)50％-100％；E29(980mg)，E30(760mg)，E31(156mg)，E32(69mg)100％。

组分E21经Sephadex LH-20以MeOH-H₂O 70％等度洗脱收集得到13个组分E21-1—E21-13；其中，组分E21-13(7.5mg)为目标化合物聚酮化合物pyoluteorin。

3.聚酮化合物pyoluteorin的结构确定

利用¹H-NMR、¹³C-NMR、ESIMS得出化合物核磁和分子量信息，经碳谱和氢谱数据与已知化合物比对，确定化合物为如式I所示：

聚酮化合物pyoluteorin:棕色粉末；ESIMS(negative)m/z 269.7[M-H]^-；¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)δ:7.08(1H,t,J＝8.3Hz,H-10),6.56(1H,s,H-4),6.35(2H,d,J＝8.3Hz,H-9,H-11)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD)δ:185.9(C＝O),158.3(C×2，C-8,C-12),132.9(CH-10),132.5(C-5),122.0(C-2),119.4(CH-4),115.4(C-7),112.1(C-3),108.2(C×2,CH-9,CH-11).

实施例2：细胞毒活性测试

1.实验材料

人脑胶质瘤细胞(U87)、人肺腺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7，HCC1954)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231，MDA-MB-468)、人三阳性乳腺癌细胞(BT474)和人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)购买自ATCC。

聚酮化合物pyoluteorin是由实施例1制备得到。

2.细胞毒活性筛选和作用机制研究方法

(1)CTG法检测细胞毒活性

收集对数期生长的不同肿瘤细胞，细胞经计数后接种于96孔培养板，2000细胞/孔，每孔加入90μL DMEM培养液(4.5g/L D-葡萄糖，L-谷氨酸，110mg/L丙酮酸钠等，含血清)，37℃，5％CO₂条件下培养(MDA-MB-231细胞培养不需要CO₂)，待细胞贴壁后加入10μL不同浓度的待测聚酮化合物pyoluteorin继续培养72h。培养终止后，每孔加入CTG溶液100μL，室温静置10min。静置后在酶标仪上测定各孔的化学发光值。

(2)细胞抑制率时间-剂量依赖性检测

CTG法：将药物用DMEM培养液稀释成实验设计浓度(0.032，0.16，0.8，4，20，100μM)。按照实验分组，细胞经计数后接种于96孔培养板，2000细胞/100uL/孔，每孔加入90uLDMEM培养液(含血清)培养过夜。过夜后加入不同浓度的待测聚酮化合物pyoluteorin 10uL(0.032，0.16，0.8，4，20，100μM)作为实验组，空白对照组加入DMEM培养基10uL，并设置三个复孔，置于37℃培养箱内作用24h、48h、72h后，每孔加入CTG 100uL，室温避光孵育10min。孵育完成后利用酶标仪测定各孔的化学发光值。按照下列公式计算抑制率和IC₅₀：抑制率(％)＝(空白对照组化学发光值－实验组化学发光值)/空白对照组化学发光值值×100％。再以加入化合物的浓度为横坐标，抑制率(％)为纵坐标，采用直接图解法计算出IC₅₀。

(3)细胞周期检测

采用细胞周期检测试剂盒检测细胞周期的情况。

将待测聚酮化合物pyoluteorin用DMEM培养液稀释成实验设计浓度(0.1，0.3，1，3，10μM)。培养的MDA-MB-231细胞经过胰酶消化后接种于6孔板，每孔加入细胞悬液2mL，置于37℃培养箱培养。对于实验组，加入已经配好的不同浓度待测聚酮化合物pyoluteorin，对于空白对照组，加入等体积的DMEM培养液，置于37℃，培养箱内作用24h后，收集细胞置于离心管中，各组细胞分别以1500rpm离心5min，加入1mL70％甲醇，4℃孵育15min。孵育结束后，各组细胞再分别以1500rpm离心5min，加入500uL PI溶液(50ug/mL PI，100ug/mL RNaseA，0.05％Triton X-100)，37℃孵育40min。孵育结束后，各组细胞分别以1500rpm离心5min，加入1mL PBS，1500rpm离心5min，再以500uL PBS进行重悬后用流式细胞仪检测每个细胞周期的DNA含量。

(4)细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡的情况。

将待测聚酮化合物pyoluteorin用DMEM培养液稀释成实验设计浓度(0.1，0.3，1，3，10μM)。培养的MDA-MB-231细胞经过胰酶消化后接种于6孔板，每孔加入细胞悬液2mL，置于37℃培养箱培养24h。对于实验组，加入已经配好的不同浓度待测聚酮化合物pyoluteorin，对于空白对照组，加入等体积的DMEM培养液，置于37℃培养箱内作用24h。孵育完成后，收集各组细胞置于离心管中以1000rpm转速离心5min。用1×Annexin V BindingSolution调整细胞密度到1×10⁶/mL。取100uL细胞悬液，依次加入5uL的AnnexinV-FITC结合物和5μL PI solution后，置于室温避光15min。结束后，加入400uL 1×AnnexinVBinding Solution，在1h内上流式细胞仪检测。

(5)线粒体膜电位检测

采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位的情况。

将待测聚酮化合物pyoluteorin用DMEM培养液稀释成实验设计浓度(0.1，0.3，1，3，10μM)。培养的MDA-MB-231细胞经过胰酶消化后接种于6孔板，每孔加入细胞悬液2mL，置于37℃培养箱培养24h。对于实验组，加入已经配好的不同浓度待测聚酮化合物pyoluteorin，对于空白对照组，加入等体积的DMEM培养液，置于37℃培养箱内作用24h。按照试剂盒操作说明配制JC-1染色工作液。孵育完成后，收集各组细胞置于离心管中以1000rpm转速离心5min除去细胞培养液。以PBS漂洗一次后重悬于1mL细胞培养液中，加入1mL JC-1染色工作液，充分混匀，在37℃条件下孵育20min。结束后，离心吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤两次。重悬于2mL细胞培养液后在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。

(6)细胞内活性氧检测

采用活性氧ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的含量。

将待测聚酮化合物pyoluteorin用DMEM培养液稀释成实验设计浓度(0.1，0.3，1，3，10μM)。培养的MDA-MB-231细胞经过胰酶消化后接种于6孔板(10万/2mL/孔)，置于37℃培养箱培养24h。对于实验组，加入已经配好的不同浓度待测聚酮化合物pyoluteorin，对于空白对照组，加入等体积的DMEM培养液，置于37℃培养箱内作用24h。孵育完成后，去除细胞培养液，将细胞重悬于DMEM培养基(含10μM 2',7'二氯氢化荧光素乙二脂)中，置于37℃条件下孵育20min。用PBS洗涤2次后用流式细胞仪检测ROS的含量。

采用激光共聚焦显微镜观察细胞内ROS产生聚集图像。将待测聚酮化合物pyoluteorin用DMEM培养液稀释成实验设计浓度(0.1，0.3，1，3，10μM)。培养的MDA-MB-231细胞经过胰酶消化后接种于6孔板(10万/2mL/孔)，置于37℃培养箱培养24h。对于实验组，加入已经配好的不同浓度待测聚酮化合物pyoluteorin，对于空白对照组，加入等体积的DMEM培养液，置于37℃培养箱内作用24h。孵育完成后，去除细胞培养液，将细胞重悬于DMEM培养基(含10μM 2',7'二氯氢化荧光素乙二脂)中，置于37℃条件下孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。滴加DAPI避光孵育5min对标本进行染核。用无血清细胞培养液轻轻漂洗4次洗去多余的DAPI后，在激光共聚焦显微镜下观察采集ROS产生聚集图像。

3.实验结果

采用CTG法测试了待测聚酮化合物pyoluteorin对不同肿瘤细胞的细胞毒活性，结果如表1所示，表1为聚酮化合物pyoluteorin对不同肿瘤细胞(U87、A549、HCT116、MCF-7、K562)的细胞毒活性筛选结果(阿霉素为阳性对照，IC₅₀＝平均数±标准误，n＝3)。

表1

由表1中数据可知，聚酮化合物pyoluteorin对人肺腺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7，)具有较好的细胞毒活性，且对人乳腺癌细胞活性突出。故研究了聚酮化合物pyoluteorin对其他乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT474、HCC1954)的细胞毒活性，如表2所示，表2为聚酮化合物pyoluteorin对不同乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞的细胞毒活性筛选结果(IC₅₀＝平均数±标准误，n＝3)。

表2

由表2中数据可知，聚酮化合物pyoluteorin对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231表现出显著的抑制作用(IC₅₀＝0.975μM)，且对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A的毒副作用较小(IC₅₀>50μM)，表明该化合物有较好的选择细胞毒性。

药物时间剂量依赖性实验结果如图1所示，图1为聚酮化合物pyoluteorin对MDA-MB-231细胞生长抑制作用曲线图，浓度为0.032uM、0.16uM、0.8uM、4uM、20uM、100uM的聚酮化合物pyoluteorin作用24、48、72h后对MDA-MB-231细胞的抑制率。结果表明，聚酮化合物pyoluteorin对MDA-MB-231细胞的抑制作用具有浓度–时间依赖性。不同剂量0.032，0.16，0.8，4，20，100μM的聚酮化合物pyoluteorin作用于MDA-MB-231细胞24h后，MDA-MB-231细胞的存活率明显下降，且作用时间为72h时，效果最好，结果表明聚酮化合物pyoluteorin能够剂量时间依赖性的抑制肿瘤细胞生长。

继续采用MDA-MB-231细胞为模型来研究聚酮化合物pyoluteorin抑制人三阴性乳腺癌细胞生长的作用机制。PI染色后，用流式细胞仪检测了聚酮化合物pyoluteorin对细胞生长周期的影响。如图2所示，图2为聚酮化合物pyoluteorin能够诱导细胞G₂/M期阻滞作用的示意图。实验数据均以平均数±标准误表示，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)，Tukey test检验，P<0.05为差异显著(*,P<0.05；**,P<0.01vs.Vehicle)。用不同浓度的聚酮化合物pyoluteorin处理MDA-MB-231细胞24h后，流式结果表明聚酮化合物pyoluteorin能够剂量依赖性的诱导G₂期细胞比例的增长和S期细胞比例的减少。以上实验结果表明聚酮化合物pyoluteorin能够诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞在G₂/M期。

通过Annexin V-FITC/PI双染色法检测了聚酮化合物pyoluteorin是否能够诱导细胞凋亡。如图3和图4所示，图3为不同剂量的聚酮化合物pyoluteorin诱导MDA-MB-231细胞凋亡的示意图，图4为不同剂量的聚酮化合物pyoluteorin诱导MDA-MB-231细胞凋亡的趋势统计示意图。实验数据均以平均数±标准误表示，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，Duncan test检验，P<0.05为差异显著(*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001vs.Vehicle)。当用不同浓度的聚酮化合物pyoluteorin处理MDA-MB-231细胞24h后，细胞均出现了不同程度的凋亡现象，且随着聚酮化合物pyoluteorin浓度的增加，细胞凋亡率从5.57％上升到了40.84％。以上结果说明聚酮化合物pyoluteorin能有效诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡，且凋亡方式呈剂量依赖性。

采用JC-1荧光探针染色，通过激光共聚焦显微镜检测分析了聚酮化合物pyoluteorin对于MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的影响。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光。当线粒体膜电位降低后，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体形式存在，可以产生绿色荧光。如图5所示，图5中，A是不同浓度聚酮化合物pyoluteorin作用后，MDA-MB-231细胞的线粒体膜电位激光共聚焦荧光图像示意图(a.空白对照；b.0.1μM pyoluteorin；c.0.3μM pyoluteorin；d.1μMpyoluteorin；e.3μM pyoluteorin；f.10μM pyoluteorin)；B是JC-1单体荧光强度与JC-1聚合物荧光强度的比值与不同浓度聚酮化合物pyoluteorin的示意图。用不同浓度的聚酮化合物pyoluteorin处理MDA-MB-231细胞24h后，JC-1聚合物所产生的荧光逐渐减弱而JC-1单体所产生的荧光逐渐增强，这说明细胞内线粒体膜电位在不断降低。此外，JC-1单体荧光强度与JC-1聚合物荧光强度的比值可以直观表示线粒体膜电位的变化。由实验可知该比值随化合物浓度的增加而增加，表明线粒体膜电位产生了去极化现象。以上实验结果表明聚酮化合物pyoluteorin可能通过诱导细胞内线粒体膜电位去极化来诱导细胞凋亡。

最后，试验了聚酮化合物pyoluteorin是否会影响细胞内活性氧ROS的含量。将MDA-MB-231细胞用不同浓度的聚酮化合物pyoluteorin处理24h后，加入DCFH-DA进行染色，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有绿色荧光的DCF。通过流式细胞仪检测DCF荧光强度，如图6所示，图6为不同浓度聚酮化合物pyoluteorin作用后，MDA-MB-231细胞内活性氧ROS的含量示意图；其中A为流式细胞仪检测DCFH-DA荧光强度示意图；B为MDA-MB-231细胞内活性氧ROS含量示意图。实验数据均以平均数±标准误表示，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan test检验，P<0.05为差异显著(*,P<0.05；**,P<0.01,***,P<0.001vs.Vehicle)，聚酮化合物pyoluteorin能够使MDA-MB-231细胞内的活性氧ROS含量增加。且通过激光共聚焦检测结果可知(如图7所示，图7为不同浓度聚酮化合物pyoluteorin作用后，MDA-MB-231细胞内活性氧ROS的激光共聚焦检测图像示意图；A空白对照；B为0.1μMpyoluteorin；C为0.3μM pyoluteorin；D为1μM pyoluteorin；E为3μM pyoluteorin；F为10μM pyoluteorin。)，在药物浓度增加后，胞内的荧光强度在不断增加，即细胞内ROS的含量在不断增加。以上两实验结果均表明聚酮化合物pyoluteorin诱导MDA-MB-231细胞凋亡可能与ROS通路有关。

体外细胞实验结果均表明，聚酮化合物pyoluteorin可通过诱导细胞G₂/M期周期阻滞和凋亡来抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长。进一步机制研究发现，细胞凋亡与线粒体膜电位(MMP)下降以及细胞内活性氧ROS含量的增加有关。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。