一种短肽exp及基于该短肽的药物递送系统和细胞外囊泡回收试剂盒
阅读说明：本技术 一种短肽exp及基于该短肽的药物递送系统和细胞外囊泡回收试剂盒 (Short peptide EXP, drug delivery system based on short peptide and extracellular vesicle recovery kit ) 是由 尹海芳 冉宁 林曹瑞 高先军 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明“一种短肽EXP及其相关药物递送系统和细胞外囊泡回收试剂盒”,属于生物医药工程技术领域。短肽EXP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。基于所述短肽EXP,本发明还提供一种药物递送系统、靶向给药系统、增强型药物运输载体、运输增强型药物、靶向药、细胞外囊泡回收试剂盒、疾病诊断试剂盒、纯化细胞外囊泡的方法；以及短肽EXP在制药和制备诊断试剂领域的用途。(The invention discloses a short peptide EXP and a related drug delivery system and an extracellular vesicle recovery kit thereof, belonging to the technical field of biomedical engineering. The amino acid sequence of the short peptide EXP is shown in SEQ ID NO. 1. Based on the short peptide EXP, the invention also provides a drug delivery system, a targeted drug delivery system, an enhanced drug delivery carrier, an enhanced drug delivery, a targeted drug, an extracellular vesicle recovery kit, a disease diagnosis kit and a method for purifying extracellular vesicles; and the application of the short peptide EXP in the fields of pharmacy and preparation of diagnostic reagents.)
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种短肽EXP及其相关药物递送系统和细胞外囊泡回收试剂盒。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由多种细胞分泌的释放到细胞外间隙中的具有脂质双分子层结构的囊泡，其主要分为外泌体(exosome)及微囊泡(Mocrovesicles,MV)两种。细胞外囊泡在细胞与细胞之间的信息传递、物质交换等生物学过程中起到非常重要的作用。
Exosome，又称“外泌体”，是一种由细胞分泌的直径为30-150nm的生物囊泡，其广泛存在于在细胞上清、血液、尿液及其他来源等。Exosome在形成过程中能够携带内源性蛋白、mRNA、miRNA和noncoding RNA等介导细胞与细胞之间的物质交换、信号传递以及抗原呈递等生物学过程。同时，exosome作为细胞分泌的纳米级脂质囊泡，与其它纳米脂质体相比，具有组织相容性高和免疫原性低等优点。因此其可以作为一种天然的生物纳米载体，在药物运输方面具有广阔的应用前景。有研究将Exosome作为内源性蛋白、核酸等生物分子的载体，进行疾病诊断及治疗。但是对exosome表面功能化的研究报道较少，已有的研究均为利用重组质粒将目的蛋白与exosome表面的膜蛋白源细胞上进行融合表达，通过收集源细胞分泌的exosome，达到对exosome的表面修饰。但是，由于该方法存在质粒转染效率低、靶向短肽融合表达构象不清以及exosome回收效率低等缺点，严重影响到exosome作为天然生物纳米载体的应用前景。因此，研发一种新型的exosome表面功能化的方法，提高exosome作为药物运输载体的多负载效率，对于exosome的临床转化具有重要的意义。而细胞外微囊泡是由细胞分泌，主要是由细胞膜脱落形成的膜泡结构，其直径在150-1000nm之间，其在形成过程中亦能够携带源细胞来源的蛋白和RNA等物质而进行细胞与细胞之间物质交换及信息传递。与此同时，脂膜状结构决定了其能够与exosome一样作为物质运输的载体进行药物运输。因此，研发一种能够对exosome及microvesicle进行表面修饰，提高其药物运输负载效率的方法尤为重要。
现有技术发明专利CN201510520565.7提供了一种和exosome表面的CD63具有特异性结合能力的短肽CP05，并将该锚定肽CP05与特定靶向肽、功能肽及核酸药物连接到exosome表面，达到对exosome的表面修饰，通过体内、体外功能测试，确认CP05作为锚定连接肽的可行性。然而，该CP05与exosome的结合效率比较有限，并且与不表达或低表达CD63的exosome不结合或结合效率极低。
发明内容
本发明基于本领域存在的上述缺陷和不足，开发获得一条新的短肽，命名为EXP(Extracellular vesicle binding Peptide)，与CP05相比，在相同条件下，EXP与exosome结合效率约为CP05的2倍；尤其是与血清来源的exosome结合效率显著高于CP05，而且与exosome的结合力更强。EXP可用于对血清中exosome的回收，且回收率约为CP05的2倍。为exosome的表面功能化及回收提供更高效的短肽。
本发明的技术方案如下：
一种短肽EXP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种药物递送系统，其特征在于，包括所述的短肽EXP和药物运输载体。
所述短肽EXP通过CD63和/或CD81蛋白与所述药物运输载体结合；
优选地，所述药物运输载体为可表达或带有CD63和/或CD81的载体；所述可表达或带有CD63和/或CD81的载体选自：exosome、微囊泡、表达或附带CD63和/或CD81蛋白的外泌体，微囊泡，脂质体，纳米粒子。
所述的药物递送系统还包括：药效活性分子；所述药效活性分子选自：可与EXP共价连接的多肽、核酸分子、小分子化合物；
优选地，所述可与EXP共价连接的多肽选自：肌肉靶向肽M12、肝癌靶向肽P47、脑神经靶向肽RVG和其他功能短肽，例如N1ND；
优选地，所述可与EXP共价连接的小分子化合物选自：磷酸二酰胺吗啉低聚物(Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer,PMO)；
优选地，所述可与EXP共价连接的核酸分子选自中性的，不带电荷的PMO或PNA。
所述可与EXP共价连接的多肽还可以是靶向不同组织的靶向肽，或者任何序列的功能多肽，由于多肽的合成是非常成熟的技术，EXP也是一种多肽，它可与其他任何多肽进行人工合成，任何多肽都可与EXP合成在一起，这也是EXP的优势所在，可以通过成熟的多肽人工合成技术将EXP与任何序列的多肽合成在一起。
一种靶向给药系统，其特征在于，包括所述的短肽EXP、药物运输载体和靶向肽。
所述短肽EXP通过CD63和/或CD81位点与所述药物运输载体结合；
优选地，所述药物运输载体为可表达或带有CD63和/或CD81的载体；所述可表达或带有CD63和/或CD81的载体选自：exosome、细胞外微囊泡、或附带CD63和/或CD81蛋白的外泌体，微囊泡，脂质体，纳米粒子。
所述的靶向给药系统还包括：药效活性分子；所述药效活性分子选自：可与EXP共价连接的多肽、核酸分子；
优选地，所述可与EXP共价连接的多肽选自：M12、P47、RVG或N1ND；
优选地，所述可与EXP共价连接的核酸分子选自：PMO。
一种增强型药物运输载体，其特征在于，为连接有或修饰有所述的短肽EXP的药物运输载体。
所述短肽EXP通过CD63和/或CD81位点与所述药物运输载体结合；
优选地，所述药物运输载体为可表达或带有CD63和/或CD81的载体；所述可表达或带有CD63和/或CD81蛋白的载体选自：exosome、细胞外微囊泡、可表达CD63和/或CD81的质粒。
一种运输增强型药物，其特征在于，所述药物的药效成分负载于所述的增强型药物运输载体上。
例如，某种具体的多肽类药物HMGN1，其可将其对应的核酸序列与短肽EXP的核酸序列装载至基因表达载体(比如，慢病毒表达载体pCDH-CMVpuro-insulin-HMGN1载体)中，通过该基因表达载体表达出所述多肽+EXP的肽序列，再通过EXP与药物运输载体上的CD63/CD81结合，形成多肽+EXP+药物运输载体的结构，即获得多肽类的运输增强型药物。
对于短的小肽(小于60氨基酸)，不需要任何基因表达系统；大于60氨基酸的多肽或蛋白，需要基因表达载体表达。
在另一些实施例中，核酸类药物PMO，可将其通过共价连接与EXP连接，得到核酸药物PMO+EXP的复合结构，再通过EXP与药物运输载体上的CD63/CD81结合，形成核酸+EXP+药物运输载体的结构，即获得核酸类的运输增强型药物。
一种靶向药，其特征在于，所述靶向药的药物成分包含于所述的靶向给药系统。
例如，与EXP共价连接的PMO可应用于DMD治疗。
一种细胞外囊泡回收试剂盒，其特征在于，包括所述的短肽EXP。
所述的细胞外囊泡回收试剂盒还包括，用于回收和纯化细胞外囊泡的常规试剂；
优选地，所述用于回收和纯化细胞外囊泡的常规试剂包括：；
更优选地，所述短肽EXP包被于镍珠，或磁珠，或利用成熟化学加工以共价键链接微珠或纳米珠。
所述细胞外囊泡选自exosome和/或微囊泡。
一种疾病诊断试剂盒，其特征在于，所述疾病诊断的标志物为exosome表面蛋白分子及疾病相关的特异性蛋白分子例如肝癌特异性抗原AFP；所述试剂盒包括所述的短肽EXP。
例如，肿瘤病人或肌肉病人；可像现有技术的CP05一样，通过将短肽EXP附着在磁珠上，来结合游离的exosome，通过检测结合到的exosome浓度，来诊断是否患病。
所述的疾病诊断试剂盒还包括，用于回收和纯化exosome的常规试剂；
优选地，所述用于纯化exosome的常规试剂包括：包被短肽EXP的镍珠；结合液(50mM咪唑,500mM氯化钠,20mM磷酸氢二钠,pH7.4)；冲洗液(75mM咪唑,500mM氯化钠,20mM磷酸氢二钠,pH7.4)；洗脱液(500mM咪唑,500mM氯化钠,20mM磷酸氢二钠,pH7.4)；上述试剂均可商购获得。
优选地，所述exosome选自：人血清来源的exosome，和/或，人尿液来源的exosome，和/或，其他来源的游离exosome，和/或，细胞培养上清中的exosome。
一种纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括：用所述的短肽EXP结合或捕获所述细胞外囊泡。
所述的一种纯化微囊泡的方法，还包括：
步骤一，将分别将His标记的EXP及CP05(100μg)与40μl镍珠在200μl结合液中结合，4℃旋转孵育1h。
步骤二，向已经包被His-EXP及His-CP05的镍珠中加入1ml预离心好的血清(4400g，离心20min，13000g，离心5min)，4℃旋转孵育30min.；
步骤三，弃掉血清，冲洗液洗掉非特异结合，10min/次，洗3次。
步骤四，洗脱液100μl洗脱回收细胞外囊泡。
所述细胞外囊泡选自：exosome和/或微囊泡。
所述的短肽EXP在制药领域的用途。
所述的用途包括：将所述短肽EXP与药物运输载体连接获得基于短肽EXP-载体复合物的增强型药物运输载体。
所述用途还包括：将药物分子与所述短肽EXP-载体复合物连接获得基于药物分子-短肽EXP-载体复合物的药物。
所述的用途还包括：将靶向肽与所述药物分子-短肽EXP-载体复合物连接获得靶向药物。
所述的短肽EXP在制备疾病诊断试剂方面的用途。
所述的用途包括，将所述短肽EXP与exosome连接。
所述人血清来源的exosome、人尿液来源的exosome或其他来源的exosome。
天然的exosome本身脂质双层结构能包裹药物分子，并且一些exosome本身就具备组织趋向性，从而实现药物靶向递送，而本发明的EXP能高效结合exosome，用EXP连接药物分子就可提高药物分子与exosome的结合效率，在本发明中，药物分子是通过EXP连接在exosome外部表面，可利用一些exosome本身的被动靶向性将药物分子递送至目标细胞。另一方面，如果exosome进一步连接靶向肽，靶向肽会改变exosome本身的被动靶向性，这时靶向肽起主要的靶向作用将药物分子递送至目标细胞。
本发明提供一种短肽EXP及由该短肽连接形成的复合物。其中所述短肽EXP的氨基酸序列为CRHKMWTVKSRL，所得短肽EXP可通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白上。
该短肽EXP连接跨膜蛋白涉及exosome表面的跨膜蛋白CD63及其他跨膜蛋白包括CD81。所述短肽EXP可用于细胞外囊泡的表面功能化包括靶向修饰、药物负载及细胞外囊泡的捕获，用于临床疾病诊断。
本发明获得一条能够与细胞外囊泡结合效率更高的短肽EXP，其序列CRHKMWTVKSRL，该短肽能够与细胞外囊泡表面的跨膜蛋白CD63和CD81结合。相比现有技术提供的短肽CP05，该EXP短肽与exosome结合的效率更高，该EXP短肽可用于细胞外囊泡的高效捕获及与其它功能分子如靶向肽、核酸类药物等共价结合后，使功能分子连接于细胞外囊泡表面，实现细胞外囊泡功能化的目的。本发明提供的EXP短肽克服了传统exosome修饰过程中遇到的质粒转染效率低、exosome回收效率低等缺点，为exosome表面修饰提供一种高效、快捷的方法；同时，利用该修饰手段组成的递送组合物具有较高稳定性，展示出广阔的临床应用前景。
本发明通过实验证实EXP可用于药物在细胞外囊泡上的负载，并可提高药物的负载效率，其主要作用机理是因为EXP能与细胞外囊泡表面蛋白CD63和/或CD81结合，因此能将所连接的药物负载于细胞外囊泡e上。能回收血清中细胞外囊泡，且与不同来源的细胞外囊泡均可结合。综上，新型小肽EXP的发现为细胞外囊泡捕获和表面功能化提供一种高效的方法；且利用该短肽组成的递送组合物具有较高稳定性，将加速细胞外囊泡在临床的转化应用。
附图说明
图1锚定短肽与exosome结合能力检测结果。本发明设计三条不同序列的短肽，EXP(CRHKMWTVKSRL)、39880(CKHNQWTVTSRL)以及39881(SQCSVSTKL)，将FAM荧光标记的CP05、EXP、39880、39881四条短肽分别与分化的肌肉细胞C2C12(dC2C12)来源的exosome共孵育，利用流式检测比较不同短肽与exosome的结合效率。图中各标记分别代表下述序列的检测结果：EXO：exosome为分化肌肉细胞来源的外泌体；CP05：现有技术专利CN201510520565.7记载的CP05序列；EXP：本发明的EXP短肽序列(SEQ ID NO.1)；变体39880以及39881(A)流式检测不同短肽与exosome的结合能力，筛选与exosome结合能力强于CP05的短肽EXP，结果显示EXP与exosome结合效率最高，高达95.5％，结合力最强。(B)流式检测exosome介导不同短肽进入细胞的能力。等量FAM标记的短肽与dC2C12来源的exosome共孵育使其结合后，加入到C2C12细胞中，24h后检测exosome介导不同短肽进入细胞的能力，结果显示：EXOEXP有65.6％进入细胞，其能力最强。(C)Exosome介导不同短肽进入细胞的定量分析，结果显示，EXOEXP阳性C2C12细胞的比例最高，是EXOCP05的2倍左右，提示EXO介导EXP进入C2C12细胞的能力强于CP05及其它变体，间接说明EXO与EXP的结合能力强于CP05。(D)不同质量梯度的EXP及CP05与等量exosome结合效率检测。将不同质量梯度0.003μg,0.006μg和0.03μg的EXP及CP05与等量exosome(10μg)共孵育后，流式比较其结合效率，结果显示，不同质量梯度，EXP与exosome的结合效率均高于CP05与exosome的结合，且在低剂量下展示出较强的结合优势。
图2为CP05及EXP与exosome结合稳定性检测结果。共聚焦检测比较不同时间点CP05及EXP在细胞内与exosome的共定位情况。将FAM标记的两条短肽CP05及EXP分别与DiI标记的exosome孵育连接后，加入到C2C12细胞中，观察不通过时间点短肽与exosome的共定位情况，利用FRET(荧光能量共振转移)技术检测不同时间点(6小时、12小时、24小时、48小时)细胞内短肽与exosome的结合能力。图中各标记含义列示如下：DAPI为细胞核DAPI染色结果，Peptide(488，520)为FAM标记CP05及EXP的激发和发射波长；EXO(Dil)(540，620)为DiI标记exosome的激发和发射波长；Merge为前三者染色结果的叠加显示结果，FRET为荧光共振能量转移技术，光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移。图中FAM-Peptidede供体荧光分子，DiI-EXO为受体荧光分子，FRET(488，620)表示FAM-Peptide的激发及DiI-EXO的吸收波长。在EXOCP05为现有技术专利CN201510520565.7记载的CP05序列与exosome结合的染色结果，EXOEXP为本发明的EXP短肽与exosome结合的染色结果；结果显示：不同时间点CP05及EXP与exosome在细胞内均具有共定位，CP05与EXO在细胞内的共定位在12小时时达到高峰，24小时后减少，到48小时时CP05大部分降解，二者之间共定位明显减少。而EXP在48小时时仍可以检测到其与EXO在细胞内共定位，提示EXP与EXO的结合稳定性明显增强。
图3为CP05与EXP竞争性结合exosome能力检测结果。将AF750(APC-Cy7)标记的CP05分别与FAM标记的CP05或EXP以1:1或1:5的比例与exosome共孵育，流式检测不同比例下CP05及EXP与exosome的结合效率，结果EXP与CP05同时与exosome孵育时，EXP能够竞争CP05与exosome结合，从而使CP05与exosome的结合效率降低。(A)流式检测CP05及EXP与exosome竞争性结合能力。EXO表示流式检测阴性对照，EXOCP05表示单独不同荧光标记的CP05(FAM,AF750)与exosome的结合效率，EXOEXP表示FAM标记的EXP与exosome的结合效率。1:1，1:5，1:10表示AF750与FAM-EXP/FAM-CP05的质量比分别为1:1，1:5，1:10。流式结果显示，单独CP05与EXO的结合效率在70％左右，而EXP与exosome的结合效率为91.5％(流式图：第一行)。而将CP05与EXP共孵育与exosome结合，检测其结合效率发现(流式图：中间一行)：当EXP质量增加到CP05的5倍和10倍之后，EXOCP05(AF750)的结合效率降低。而同时对比不同荧光CP05分子发现(流式图：第三行)，增加FAM-CP05的质量比例，EXO CP05(AF750)的结合效率不变。提示EXP能够竞争性结合CP05与exosome的结合位点，使其结合效率一定程度下降。(B)对短肽与exosome结合效率的定量分析，不同荧光标记的CP05(APC-Cy7,FAM)与exosome共孵育后，流式检测其结合效率，CP05(AF750)表示其中exosome与CP05(AF750)的结合效率。CP05(FAM)表示其中exosome与CP05(FAM)的结合效率，EXP(FAM)表示exosome与EXP(FAM)的结合效率。结果显示(如表格第一行所示)：exosome与CP05(AF750)及CP05(FAM)共孵育后，当FAM-CP05剂量增加，CP05(AF750)与exosome的结合效率基本保持稳定(57％到63.1％)。而当exosome与CP05(AF750)及EXP(FAM)共孵育后(表格第二行)，随着FAM-EXP剂量增加，CP05(AF750)的集合效率降低(由66.9％到48.4％)。
图4为EXP靶点检测。(A)银染及WB检测免疫共沉淀所获得目的蛋白条带。将Flag标记的CP05及EXP与Flag珠子共孵育，洗掉与珠子未结合的短肽后，与细胞蛋白裂解液进行孵育，利用短肽钓取细胞蛋白裂解液中特异性富集的蛋白，然后用银染染色检测钓取条带大小分布，利用WB检测钓取条带中不同Tetraspanin家族蛋白表达情况。结果显示：与对照组比较，EXP组在45kD及25kD左右有差异条带。经WB检测确认，该差异条带为CD63及CD81。(B)利用免疫共沉淀钓取EXP的靶点，结果同上。
图5为EXP与不同来源exosome结合能力检测的结果，流式检测CP05及EXP与不同来源的exosome的结合效率。将FAM标记的CP05及EXP分别与分化的成肌细胞来源的exosome(EXOmyotube)、CDC细胞来源的exosome(EXOCDC)及人血清来源的exosome(EXOserum)共孵育后，流式检测其与exosome的结合效率。结果显示：CP05与不同来源的exosome结合效率均在70％左右，而等量EXP与对应来源exosome的结合效率在90％左右，与不同来源的exosome共孵育，EXP均具有更高的结合效率。
图6为EXP捕获血清中外泌体形态鉴定及其应用能力检测。(A)Nanosight检测短肽CP05及EXP捕获血清中exosome的粒径，结果显示：EXP捕获exosome粒径在50nm左右，且其均一度高于超离回收的exosome的粒径均一度。(B)CP05、EXP捕获的方法及超离等量血清中外泌体数目比较；(C)透射电镜检测CP05及EXP捕获exosome的形态大小。结果显示：EXP捕获的exosome具有典型的双层膜结构，大小较超离回收exosome的粒径小。(D)Western Blot检测捕获exosome标志蛋白检测。结果显示：EXP捕获exosome表达标志蛋白CD63、CD81和HSC70。(E)CP05捕获血清中exosome与CP05及EXP结合效率检测。结果显示：EXP回收的exosome能够与CP05及EXP结合，其中EXP与回收exosome的结合效率高达95.9％，远高于CP05(76.8％)。(F)EXP捕获血清中exosome与CP05及EXP结合效率检测，结果显示：EXP对血清中的exosome捕获效率高达93.5％，高于CP05的83.3％。
图7为EXP介导exosome作为运输载体的功能测试。将反义寡核苷酸药物PMO分别与CP05及EXP偶联形成肽-PMO偶合物CP05PMO及EXPPMO，并与exosome共孵育形成EXOCP05PMO及EXOEXPPMO组合物，以此介导mdx小鼠TA肌中dystrophin蛋白恢复表达。其中PMO表示胫前肌局部注射2μg PMO，CP05PMO表示胫前肌局部注射2μg CP05PMO，EXPPMO表示胫前肌局部注射2μg EXPPMO，EXOCP05PMO表示2μg CP05PMO与2μg exosome共孵育后局部注射到胫前肌中，EXOEXPPMO表示2μg EXPPMO与2μg exosome共孵育后局部注射到胫前肌中。(A)利用免疫组化检测肌纤维组织中dystrophin蛋白阳性纤维分布情况。(B)mdx小鼠TA组织注射不同复合物后dystrophin阳性肌纤维数目统计结果。结果显示：EXOEXPPMO组dystrophin肌纤维恢复高于EXOCP05PMO，提示EXP能够介导高效的PMO运输。(C)WB检测比较EXOCP05PMO及EXOEXPPMO治疗后dystrophin蛋白恢复水平。其中C57表示野生型鼠TA组织蛋白，mdx表示未经治疗的dystrophin蛋白缺失的TA组织蛋白。(D)EXOCP05PMO及EXOEXPPMO治疗后dystrophin蛋白恢复水平定量分析，结果与免疫组化染色结果一致，EXOEXPPMO治疗组dystrophin蛋白恢复表达高于EXOCP05PMO组。
图8为EXP介导MV(microvesicles,微囊泡)作为药物运输载体的功能测试。(A)WB鉴定比较MV与exosome的标志蛋白表达。结果显示：MV具有CD81、CD9和CD63等Tetraspanin家族蛋白表达，而不表达线粒体标志蛋白Cytochrome C。(B)Nanosight检测不同来源的MV粒径分布，MVmyot表示分化肌肉细胞来源的微囊泡，MVurine表示尿液来源的微囊泡。(C)流式检测MVmyot与EXP及CP05的结合效率。结果显示：MVmyot与EXP的结合效率明显高于其与CP05的结合效率，达到将近5倍。(D)EXP介导MV运输PMO药物在mdx胫前肌的局部测试，免疫组织化学染色检测dystrophin阳性肌纤维恢复情况。(E)WB检测MVEXPPMO治疗后dystrophin蛋白恢复表达情况。(F)MVEXPPMO治疗后dystrophin蛋白恢复表达定量。
图9为EXP介导脑靶向肽RVG对exosome的靶向运输。TA为胫前肌；Q为股四头肌；G为腓肠肌；T为肱三头肌；H为心脏；S为脾脏；K为肾脏；Lu为肺；Li为肝脏；Br为脑；In为小肠。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体的实施例对本发明作进一步描述，但并不以此限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明实施例和实验例中所采用的试剂均可收购获得，具体的实验操作均为本领域常规操作。
下述实施例中涉及的主要仪器设备说明：
仪器设备名称
选购公司/国别
分析型流式细胞仪
BD FACS ArialⅡ/美国
超净工作台
AIRTECH/中国
台式高速冷冻离心机
Eppendorf公司/德国
电热恒温培养箱
天津中环实验电炉有限公司/中国
高压蒸汽灭菌器
SANYO公司/日本
正置荧光显微镜
Olympus BX51/日本
倒置荧光显微镜
Olympus IX71/日本
共聚焦荧光显微镜
Olympus公司/日本
全自动酶标仪
Bio-Tek Synergy HT/美国
-80℃低温冰箱
SANYO公司/日本
-20℃低温冰箱
海尔公司/中国
制冰机
GRANT公司/美国
微量核酸测定仪
NanoDrop 2000c/美国
垂直电泳槽
Bio-Rad/美国
第1组实施例、本发明的短肽EXP
本组实施例提供一种短肽EXP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第2组实施例、本发明的药物递送系统
本组实施例提供一种药物递送系统，其特征在于，包括第1组实施例任一所述的短肽EXP和药物运输载体。
在一些实施例中，所述短肽EXP通过CD63和/或CD81蛋白与所述药物运输载体结合。
优选地，所述药物运输载体为可表达或带有CD63和/或CD81的载体；所述可表达或带有CD63和/或CD81的载体选自：exosome、微囊泡、表达或附带CD63和/或CD81蛋白的外泌体，微囊泡，脂质体，纳米粒子。
在另一些实施例中，所述的药物递送系统还包括：药效活性分子；所述药效活性分子选自：可与EXP共价连接的多肽、核酸分子、小分子化合物；
优选地，所述可与EXP共价连接的多肽选自：肌肉靶向肽M12、肝癌靶向肽P47、脑神经靶向肽RVG和其他功能短肽，例如N1ND；
优选地，所述可与EXP共价连接的小分子化合物选自：磷酸二酰胺吗啉低聚物(Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer,PMO)；
优选地，所述可与EXP共价连接的核酸分子选自中性的，不带电荷的PMO或PNA。
所述可与EXP共价连接的多肽还可以是靶向不同组织的靶向肽，或者任何序列的功能多肽，由于多肽的合成是非常成熟的技术，EXP也是一种多肽，它可与其他任何多肽进行人工合成，任何多肽都可与EXP合成在一起，这也是EXP的优势所在，可以通过成熟的多肽人工合成技术将EXP与任何序列的多肽合成在一起。
第3组实施例、本发明的靶向给药系统
本组实施例提供一种靶向给药系统，其特征在于，包括第1组实施例任一所述的短肽EXP、药物运输载体和靶向肽。
在一些实施例中，所述短肽EXP通过CD63和/或CD81位点与所述药物运输载体结合；
优选地，所述药物运输载体为可表达或带有CD63和/或CD81的载体；所述可表达或带有CD63和/或CD81的载体选自：exosome、细胞外微囊泡、或附带CD63和/或CD81蛋白的外泌体，微囊泡，脂质体，纳米粒子。
在进一步的实施例中，所述的靶向给药系统还包括：药效活性分子；所述药效活性分子选自：可与EXP共价连接的多肽、核酸分子；
优选地，所述可与EXP共价连接的多肽选自：M12、P47、RVG或N1ND；
优选地，所述可与EXP共价连接的核酸分子选自：PMO。
第4组实施例、本发明的增强型药物运输载体
本组实施例提供一种增强型药物运输载体，其特征在于，为连接有或修饰有第1组实施例任一所述的短肽EXP的药物运输载体。
在一些实施例中，所述短肽EXP通过CD63和/或CD81位点与所述药物运输载体结合；
优选地，所述药物运输载体为可表达或带有CD63和/或CD81的载体；所述可表达或带有CD63和/或CD81蛋白的载体选自：exosome、细胞外微囊泡、可表达CD63和/或CD81的质粒。
第5组实施例、本发明的运输增强型药物
本组实施例提供一种运输增强型药物，其特征在于，所述药物的药效成分负载于第4组实施例任一所述的增强型药物运输载体上。
例如，某种具体的多肽类药物HMGN1，其可将其对应的核酸序列与短肽EXP的核酸序列装载至基因表达载体(比如，慢病毒表达载体pCDH-CMVpuro-insulin-HMGN1载体)中，通过该基因表达载体表达出所述多肽+EXP的肽序列，再通过EXP与药物运输载体上的CD63/CD81结合，形成多肽+EXP+药物运输载体的结构，即获得多肽类的运输增强型药物。
对于短的小肽(小于60氨基酸)，不需要任何基因表达系统；大于60氨基酸的多肽或蛋白，需要基因表达载体表达。
在另一些实施例中，核酸类药物PMO，可将其通过共价连接与EXP连接，得到核酸药物PMO+EXP的复合结构，再通过EXP与药物运输载体上的CD63/CD81结合，形成核酸+EXP+药物运输载体的结构，即获得核酸类的运输增强型药物。
第6组实施例、本发明的靶向药
本组实施例提供一种靶向药，其特征在于，所述靶向药的药物成分包含于第3组实施例任一所述的靶向给药系统。
例如，与EXP共价连接的PMO可应用于DMD治疗。
第7组实施例、本发明的细胞外囊泡回收试剂盒
本组实施例提供一种细胞外囊泡回收试剂盒，其特征在于，包括第1组实施例任一所述的短肽EXP。
在进一步的实施例中，所述的细胞外囊泡回收试剂盒还包括，用于回收和纯化细胞外囊泡的常规试剂；
优选地，所述用于回收和纯化细胞外囊泡的常规试剂包括：；
更优选地，所述短肽EXP包被于镍珠，或磁珠，或利用成熟化学加工以共价键链接微珠或纳米珠。
在一些实施例中，所述细胞外囊泡选自exosome和/或微囊泡。
第8组实施例、本发明的疾病诊断试剂盒
本组实施例提供一种疾病诊断试剂盒，其特征在于，所述疾病诊断的标志物为exosome表面蛋白分子及疾病相关的特异性蛋白分子例如肝癌特异性抗原AFP；所述试剂盒包括权利要求1所述的短肽EXP。
例如，肿瘤病人或肌肉病人；可像现有技术的CP05一样，通过将短肽EXP附着在磁珠上，来结合游离的exosome，通过检测结合到的exosome浓度，来诊断是否患病。
在进一步的实施例中，所述的疾病诊断试剂盒还包括，用于回收和纯化exosome的常规试剂；
优选地，所述用于纯化exosome的常规试剂包括：包被短肽EXP的镍珠；结合液(50mM咪唑,500mM氯化钠,20mM磷酸氢二钠,pH7.4)；冲洗液(75mM咪唑,500mM氯化钠,20mM磷酸氢二钠,pH7.4)；洗脱液(500mM咪唑,500mM氯化钠,20mM磷酸氢二钠,pH7.4)；上述试剂均可商购获得。
优选地，所述exosome选自：人血清来源的exosome，和/或，人尿液来源的exosome，和/或，其他来源的游离exosome，和/或，细胞培养上清中的exosome。
第9组实施例、本发明的纯化细胞外囊泡的方法
本组实施例提供一种纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括：用第1组实施例任一所述的短肽EXP结合或捕获所述细胞外囊泡。
在进一步的实施例中，所述的一种纯化微囊泡的方法还包括：
步骤一，将分别将His标记的EXP及CP05(100μg)与40μl镍珠在200μl结合液中结合，4℃旋转孵育1h。
步骤二，向已经包被His-EXP及His-CP05的镍珠中加入1ml预离心好的血清(4400g，离心20min，13000g，离心5min)，4℃旋转孵育30min.；
步骤三，弃掉血清，冲洗液洗掉非特异结合，10min/次，洗3次。
步骤四，洗脱液100μl洗脱回收细胞外囊泡。
在一些实施例中，所述细胞外囊泡选自：exosome和/或微囊泡。
第10组实施例、本发明的EXP短肽的制药用途
本组实施例提供第1组实施例任一所述的短肽EXP在制药领域的用途。
在具体的实施例中，所述用途包括：将所述短肽EXP与药物运输载体连接获得基于短肽EXP-载体复合物的增强型药物运输载体。
在进一步的实施例中，所述用途还包括：将药物分子与所述短肽EXP-载体复合物连接获得基于药物分子-短肽EXP-载体复合物的药物。
在进一步的实施例中，所述用途还包括：将靶向肽与所述药物分子-短肽EXP-载体复合物连接获得靶向药物。
第11组实施例、本发明的EXP的诊断试剂制备用途
本组实施例提供第1组实施例任一所述的短肽EXP在制备疾病诊断试剂方面的用途。
在具体的实施例中，所述用途包括，将所述短肽EXP与exosome连接。
在一些实施例中，所述人血清来源的exosome、人尿液来源的exosome或其他来源的exosome。
实验例1、CP05及不同短肽与exosome结合能力检测。
1.1流式检测CP05及不同短肽与exosome的结合能力。
(1)将FAM标记的CP05及不同短肽各0.06μg，分别与10μg不同来源的exosome(dC2C12、CDC、血清)混合后，补足DPBS至体积为200μL.
(2)4℃垂直摇床旋转孵育2-4hrs.
(3)流式上机检测结合效率。
结果如图1(A)所示。
1.2 Exosome介导CP05及不同短肽进入细胞能力检测。
(1)C2C12细胞消化计数，种至24孔板中，4×104/孔。5％CO2，37℃生长12h。
(2)将FAM标记的CP05及不同短肽按上述1.1的方法孵育4hrs.
(3)将孵育好的EXOCP05及EXOEXP分别加入到铺好的C2C12细胞中，更换培养基为无血清DMEM培养24小时。
(4)24小时后用DPBS清洗死细胞及非特异吸附在细胞表面的荧光分子。
(5)0.25％胰酶消化细胞。
(6)1000rpm离心5min，弃上清。
(7)细胞沉淀用500μL DPBS重悬。
(8)1000rpm 5min离心，清洗两次后。
(9)200μLDPBS重悬细胞沉淀。
(10)流式检测分析加入EXOCP05及EXOEXP后FITC阳性细胞的百分比。
结果如图1(B)和(C)所示。
实验例2、CP05及EXP与exosom结合稳定性检测。
(1)C2C12细胞消化计数，种至24孔板中，4×104/孔。5％CO2，37℃生长12h。
(2)将FAM标记的CP05及EXP(20μg)分别与10μg DiI标记的exosome共孵育，4℃旋转孵育4小时。
(3)将上述孵育的EXOCP05及EXOEXP分别加入到C2C12细胞中，更换培养基为无血清DMEM 37℃继续培养。
(4)培养不同时间(6hrs、12hrs、24hrs、48hrs)后，DPBS清洗细胞。
(5)4％的多聚甲醛室温固定30min后封片。
(6)显微镜观察不同时间点exosome(DiI)与短肽(FAM)的共定位效率及FRET荧光能量转移。
结果如图2所示。
实验例3、CP05及EXP与exosome竞争性结合能力检测。
(1)将AF750标记的CP05(0.06μg)分别与FAM标记的CP05(0.06μg，0.3μg)或EXP(0.06μg，0.3μg)与10μg exosome共孵育，补足DPBS至体积200μl。
(2)4℃旋转孵育4小时。
(3)流式上机检测FITC及APC-Cy7通道exosome阳性百分比。
结果如图3所示
实验例4、EXP靶点检测验证。
(1)分别将100μg EXP或CP05与30μL活化的Flag磁珠混匀，4℃孵育过夜。
(2)PBST洗去未结合在磁珠上的短肽，回收磁珠。
(3)利用非变性组织裂解液裂解C2C12细胞，冰上裂解30min，12000rpm离心回收上清。
(4)将C1C12裂解上清分别加入到回收的磁珠中，4℃孵育2hrs.
(5)弃去上清，PBST洗掉非特异结合的蛋白，旋转混匀仪，上下旋转清洗，5min每次，共洗3次后，弃掉PBST。
(6)向沉淀中加入100μL 1×loading buffer，SDS-PAGE上样50μl泡胶。
(7)银染或者利用CD63，CD9，CD81，CD82等抗体杂交蛋白条带。
结果如图4所示。
实验例5、EXP与不同来源外泌体结合效率检测比较。
(1)将FAM标记的CP05及不同短肽各0.06μg，分别与10μg不同来源的exosome(dC2C12、CDC、血清)混合后，补足DPBS至体积为200μL.
(2)4℃垂直摇床旋转孵育2-4hrs.
(3)流式上机检测结合效率。
结果如图5所示。
实验例6、EXP捕获血清中外泌体形态及功能鉴定。
(1)将分别将His标记的EXP及CP05(100μg)与40μl镍珠在200μl结合液中结合，4℃旋转孵育1h。
(2)向已经包被His-EXP及His-CP05的镍珠中加入1ml预离心好的血清(4400g，离心20min，13000g，离心5min)，4℃旋转孵育30min.；
(3)弃掉血清，冲洗液洗掉非特异结合，10min/次，洗3次。
(4)洗脱液100μl洗脱回收细胞外囊泡。
6.1捕获exosome的粒径大小测试。
(1)取洗脱回收的exosome 20μL，稀释到1ml PBS中。
(2)Nanosight检测其粒径分布。
结果如图6(A)，6(B所示)
6.2捕获exosome的形态鉴定。
(1)取10μL洗脱回收的exosome及正常超离回收的exosome，加入等体积10μL 4％PFA固定。
(2)吸取10μL exosome固定液滴到铜网上，室温吸附20min。
(3)在封孔膜上滴100μL PBS，铜网面朝下，洗掉未吸附在铜网上的exosome。
(4)将铜网转移到1％戊二醛中固定5min。
(5)在封孔膜上滴100μL H20,将铜网面朝下，洗涤，2min一次，重复洗涤8次。
(6)将铜网转移到50μL草酸铀(PH＝7)溶液中，染色5min。
(7)将铜网转移到50μL甲基纤维素-草酸铀中，冰上放置10min。
(8)将铜网从甲基纤维素-草酸铀中取出，吸取多余的液体，空气中干燥。
(9)透射电镜观察exosome的形态。
结果如图6C所示。
6.3捕获exosome的蛋白表达检测。
(1)取30μL洗脱回收的exosome及10μg正常超离回收的exosome,加入相应5×Loading buffer,100℃使其蛋白变性。
(2)10％SDS-PAGE上样，跑胶1.5小时。
(3)250mA转膜2.5小时。
(4)4℃封闭2小时。
(5)孵育一抗过夜(CD63,CD81,CD9,HSC90,ALIX)
(6)洗一抗，10min一次，共3次。
(7)孵育相应二抗，4℃2小时。
(8)洗二抗，15min一次，共3次。
(9)曝光。
结果如图6(D)所示。
实施实例7、EXP介导exosome运输PMO的功能测试。
7.1肌肉组织免疫组化染色：
(1)利用冰冻切片机将小鼠前胫骨肌(TA)组织切成8μm厚的切片；
(2)PBS浸泡15min，加入含20％胎牛血清(FBS)，20％山羊血清(NGS)的封闭液封闭1小时；
(3)弃封闭液，加入dystrophin抗体(1:3000)孵育2小时；
(4)PBS洗3遍，加入荧光二抗，孵育1小时；
(5)PBS洗3遍，封片，晾干，荧光显微镜观察。
结果如图7(A)所示。
7.2蛋白免疫印迹染色。
(1)取50μg不同处理的肌肉蛋白，加入相应5×Loading buffer,72℃加热煮5min。
(2)4-6％SDS-PAGE上样，跑胶2.5小时。
(3)110mA转膜18小时。
(4)4℃封闭2小时。
(5)孵育一抗过夜(dystrophin，α-actinin)
(6)洗一抗，10min一次，共3次。
(7)孵育相应二抗，4℃2小时。
(8)洗二抗，15min一次，共3次。
(9)曝光。
结果如图7(C)所示。
实验例8 EXP介导MV作为药物运输载体的功能测试。
8.1 MV回收步骤。
(1)细胞上清或者尿液，配平，离心4500g，4℃，20min。
(2)弃沉淀，上清离心13000g，4℃，5min。
(3)弃沉淀，上清离心20000g，4℃，90min。
(4)弃上清，沉淀用1ml PBS重悬，再次离心20000g，4℃，90min。
(5)弃上清，沉淀用100μL PBS重悬。
(6)WB检测其标志蛋白表达，Nanosight检测其粒径分布，方法同上。结果如图8(A)，8(B)所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津医科大学
<120> 一种短肽EXP及基于该短肽的药物递送系统和细胞外囊泡回收试剂盒
<130> P190283-TJY
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EXP
<400> 1
Cys Arg His Lys Met Trp Thr Val Lys Ser Arg Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 39880
<400> 2
Cys Lys His Asn Gln Trp Thr Val Thr Ser Arg Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 39881
<400> 3
Ser Gln Cys Ser Val Ser Thr Lys Leu
1 5
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