阅读说明：本技术 一种具有抗肿瘤活性的石莼多糖及其制备方法 ([db:专利名称-en]) 是由 赵超 吴德胜 林国鹏 刘丹 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的石莼多糖及其制备与应用,其是先利用CO<Sub>2</Sub>超临界萃取法分离获得石莼粗多糖,再脱色素、除蛋白、纯化后得到纯度高的石莼活性多糖,其提取率达20%以上。经动物药效学证实,所得多糖在KM小鼠体内对H22肝癌瘤具有显著的杀伤能力,且无明显副作用,是一种无毒性、副作用小、十分安全的生物活性物质,可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物,或制作成功能食品。([db:摘要-en])

一种具有抗肿瘤活性的石莼多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有辅助抗肿瘤作用的石莼多糖的制备方法。

背景技术

肿瘤作为一种恶性疾病，其致死率较高，患者也深受其附带病痛的困扰，并且其患病率正逐年上升，社会对于抗肿瘤药物的需求也逐年上涨。传统上用于抗肿瘤的药物常伴有各种各样的副作用，或者价格十分昂贵，因而目前市场对于高效、低副作用、低成本、适用性广的新型抗肿瘤药物具有相当大的需求。

海藻中的天然高分子化合物如多糖等，具有一定的抗肿瘤作用，已成为开发新型抗肿瘤药物的重点方向。其中，石莼又称海白菜、岩头青等，分布广泛，价格低廉，作为食品的应用已有较长历史，且在传统医药记载上具有利水消肿、软坚化痰、清热解毒之功效，虽有关于其药用的研究，但其深入挖掘及广度开发则相对滞后，与其同科属的浒苔则已有较为完善的研究，因此开发石莼的药用潜力是非常有必要的。大量研究资料表明，天然多糖具有良好的抗肿瘤生物活性，因此系统地完成石莼多糖类物质制备及药理活性分析，开发出一种具有抗肿瘤活性且副作用小的石莼多糖是相当有必要的。且在目前所公开的海藻多糖相关专利中，尚未有石莼多糖在抗H22瘤方面的应用，而绿藻石莼多糖及其抗H22肿瘤活性更尚未见其他研究报道或专利。

超临界萃取（SFC）是一种利用压力和温度对超临界流体溶解能力影响而衍生的提取技术，可以有效分离极性不同的物质，在分离效率和纯度上相比传统水提法都有显著的提升，并且可以使用较低的萃取温度，避免高温导致提取物发生变化。在目前所公开的超临界萃取相关专利中，尚未有超临界萃取在石莼多糖提取上的应用，而本发明提取的石莼多糖在结构上也区别于其他方法提取的石莼多糖。

发明内容

本发明为解决现有技术的不足，提供了一种抗肿瘤活性强、不良反应低的石莼多糖，并提供该石莼多糖的制备方法。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有抗肿瘤活性的石莼多糖，其是由鼠李糖、岩藻糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸按摩尔比39.44:0.65:0.48:15.68:1.61:1.94:0.26:0.73:0.89组成，其数均分子量为8.10×10⁴Da，重均分子量为1.45×10⁵Da。

所述具有抗肿瘤活性的石莼多糖的制备方法包括以下步骤：

1）将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎，然后按20-30mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为60%-80%的乙醇溶液，回流提取1-2小时，回流结束后烘干，得到干燥脱脂的石莼粉末，回收的乙醇可循环使用；

2）使用CO₂作为溶剂，将体积浓度为75-95%的乙醇溶液作为夹带剂，将夹带剂按质量比1-1.5:1均匀喷洒在步骤1）所得石莼粉末中，移入超临界萃取釜中进行萃取，萃取釜压力为30-40MPa，温度为35-55℃，CO₂流速控制在10-20L/h，萃取时间为120-180分钟；萃取后在所得萃取液中加入体积浓度为95%的乙醇，使溶液中乙醇的体积浓度达80%，然后在4℃静置8-12小时，滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，减压干燥，得石莼粗多糖；

3）将步骤2）制备得到的石莼粗多糖按体积比1:100-1:120完全溶解于蒸馏水中，然后加入溶液重量0.1%-0.2%的中性蛋白酶，于40℃下静置2-3小时后，于100℃煮沸20-30分钟，再于4000-5000rpm离心10-15分钟，除去沉淀，得到除去蛋白的粗制多糖溶液；

4）将步骤3）所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后，按35-50mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素，再以60-80rpm摇床震荡1-2小时，而后以6000-8000rpm离心20-30分钟，收集上清液；

5）利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4）所得上清液中的小分子及色素，再将截留液减压浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥，粉碎，得到精制的石莼活性多糖粉末。

本发明所得石莼活性多糖具有抗肿瘤活性，可用于制备防治H22肝癌等肿瘤的药物，其药物剂型为药学上可接受的片剂、颗粒剂、胶囊剂等。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明利用CO₂超临界萃取法分离获得石莼粗多糖成分，再脱色素、除蛋白、纯化后得到纯度高的石莼活性多糖，其提取率达20%以上。

（2）经动物药效学证实，所得石莼活性多糖在KM小鼠体内对H22肝癌瘤具有确切的杀伤能力，且无明显副作用。

（3）本发明所提供的石莼活性多糖是一种无毒性、副作用小、十分安全的生物活性物质，可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，其不仅为石莼作为海洋药物资源的进一步利用提供了新的途径，也为治疗或预防肿瘤的药物开发提供了新的选择。

（4）目前研究尚未有关于超临界萃取石莼多糖及其抗肿瘤活性的报道，且本发明提取的多糖结构独特未有报道。

附图说明

图1为给药前后H22肝癌瘤模型小鼠血清中TNF-α含量的对比结果。

图2为模型组（A）和超临界萃取多糖组（B）的肿瘤切片的HE染色镜检图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

（1）将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎，然后按20mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为60%的乙醇溶液，回流提取1小时，回流结束后烘干，得到干燥脱脂的石莼粉末，回收的乙醇可循环使用；

（2）使用CO₂作为溶剂，将体积浓度为75%的乙醇溶液作为夹带剂，将夹带剂按质量比1.5:1均匀喷洒在步骤1）所得石莼粉末中，移入超临界萃取釜中进行萃取，萃取釜压力为30MPa，温度为55℃，CO₂流速控制在10L/h，萃取时间为150分钟；萃取后在所得萃取液中加入体积浓度为95%的乙醇，使溶液中乙醇的体积浓度达80%，然后在4℃静置8小时，滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，减压干燥，得石莼粗多糖；

（3）将步骤2）制备得到的石莼粗多糖按体积比1:100完全溶解于蒸馏水中，然后加入溶液重量0.1%的中性蛋白酶，于40℃下静置2小时后，于100℃煮沸20分钟，再于4000rpm离心10分钟，除去沉淀，得到除去蛋白的粗制多糖溶液；

（4）将步骤3）所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后，按35mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素，再以60rpm摇床震荡1小时，而后以6000rpm离心20分钟，收集上清液；

（5）利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4）所得上清液中的小分子及色素，再将截留液减压浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥，粉碎，得到精制的石莼活性多糖粉末。

实施例2

（1）将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎，然后按25mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为70%的乙醇溶液，回流提取2小时，回流结束后烘干，得到干燥脱脂的石莼粉末，回收的乙醇可循环使用；

（2）使用CO₂作为溶剂，将体积浓度为85%的乙醇溶液作为夹带剂，将夹带剂按质量比1.25:1均匀喷洒在步骤1）所得石莼粉末中，移入超临界萃取釜中进行萃取，萃取釜压力为40MPa，温度为35℃，CO₂流速控制在20L/h，萃取时间为180分钟；萃取后在所得萃取液中加入体积浓度为95%的乙醇，使溶液中乙醇的体积浓度达80%，然后在4℃静置12小时，滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，减压干燥，得石莼粗多糖；

（3）将步骤2）制备得到的石莼粗多糖按体积比1:120完全溶解于蒸馏水中，然后加入溶液重量0.15%的中性蛋白酶，于40℃下静置3小时后，于100℃煮沸25分钟，再于4500rpm离心15分钟，除去沉淀，得到除去蛋白的粗制多糖溶液；

（4）将步骤3）所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后，按45mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素，再以70rpm摇床震荡2小时，而后以7000rpm离心25分钟，收集上清液；

（5）利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4）所得上清液中的小分子及色素，再将截留液减压浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥，粉碎，得到精制的石莼活性多糖粉末。

实施例3

（1）将石莼利用清水浸泡脱盐后干燥并粉碎，然后按30mL/g的量向所得石莼干粉中加入体积浓度为80%的乙醇溶液，回流提取2小时，回流结束后烘干，得到干燥脱脂的石莼粉末，回收的乙醇可循环使用；

（2）使用CO₂作为溶剂，将体积浓度为95%的乙醇溶液作为夹带剂，将夹带剂按质量比1:1均匀喷洒在步骤1）所得石莼粉末中，移入超临界萃取釜中进行萃取，萃取釜压力为40MPa，温度为55℃，CO₂流速控制在10L/h，萃取时间为120分钟；萃取后在所得萃取液中加入体积浓度为95%的乙醇，使溶液中乙醇的体积浓度达80%，然后在4℃静置12小时，滤取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、***洗涤，减压干燥，得石莼粗多糖；

（3）将步骤2）制备得到的石莼粗多糖按体积比1:120完全溶解于蒸馏水中，然后加入溶液重量0.2%的中性蛋白酶，于40℃下静置3小时后，于100℃煮沸30分钟，再于5000rpm离心15分钟，除去沉淀，得到除去蛋白的粗制多糖溶液；

（4）将步骤3）所得粗制多糖溶液经HPD-826大孔吸附树脂填充柱除杂后，按50mL洗脱液加入1g非极性吸附剂活性炭吸附去除色素，再以80rpm摇床震荡2小时，而后以8000rpm离心30分钟，收集上清液；

（5）利用截留分子量为8000D以上的透析袋透析去除步骤4）所得上清液中的小分子及色素，再将截留液减压浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥，粉碎，得到精制的石莼活性多糖粉末。

实施例4

利用2 mol/L硫酸酸解实施例2所得石莼活性多糖粉末3小时，将石莼多糖和标准参照糖由盐酸羟胺和吡啶进行衍生化，而后由GC-MS进行单糖组成检测，测得该石莼多糖由鼠李糖、岩藻糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸按摩尔比39.44:0.65:0.48:15.68:1.61:1.94:0.26:0.73:0.89组成，以MALLS系统检测，其数均分子量为8.10×10⁴Da，重均分子量为1.45×10⁵Da。

经比较，所得石莼多糖结构不同于现有已报道其他石莼多糖（如林聪. 裂片石莼多糖的提取分离、结构及抗凝血活性研究[D]. 中国海洋大学, 2014；宋伟康, 田华, 尹学琼, et al. 海南石莼多糖的提取与分离及其结构性质的初步研究[J]. 海南大学学报：自然科学版, 2016, 34(3):243-249；郑传痴, 张倩茹, 王强, et al. 石莼硫酸多糖的分离纯化及结构解析[J]. 中国药房, 2010(27):2524-2526），且目前并相似结构石莼多糖的抑瘤报告。

实施例5 H22肝癌瘤模型小鼠抗肿瘤试验

用健康成年雄性KM小鼠建立H22肝癌瘤模型。造模前将培养的H22肝癌瘤细胞于1000rpm离心10分钟，以PBS重悬，计数后调整细胞浓度至10⁸/mL，作为接种瘤液。以皮下注射将瘤液注射到小鼠左前腋下，接种量为2×10⁷/mouse，接种体积0.2mL。将接种小鼠随机分为正常组（Normal）、模型组（Model）、阳性组（Control）、超临界萃取多糖组（ULP）四组，每组5只，正常组和模型组给予0.3mL生理盐水灌胃，阳性组给予0.3mL 20mg/kg环磷酰胺溶液腹腔注射，超临界萃取多糖组给予0.3mL 300 mg/kg石莼多糖水溶液（采用实施例2所得石莼活性多糖配制），连续给药10天，剥离小鼠身上肿瘤并称重，对比模型组瘤重计算抑瘤率，观察超临界萃取石莼多糖对H22肝癌瘤模型小鼠抗肿瘤能力的影响。剥取的肿瘤进行石蜡切片并HE染色，观察组织形态。同时，在动物实验的第0天取血，并在给药结束后取血，分离血清，测试血清中肿瘤坏死因子TNF-α的水平，核定其抗肿瘤性质。

结果显示，正常组未发现肿瘤，以模型组的瘤重为基准，并将其抑瘤率(%)设定为0，则环磷酰胺阳性组的抑瘤率(%)为70.08±10.65，超临界萃取多糖组的抑瘤率(%)为74.41±2.82，相比模型组均有显著差异性（p<0.01），说明本发明超临界萃取法制备的石莼多糖对H22肝癌瘤模型小鼠具有显著的抗肿瘤作用，而目前并无石莼多糖相关抑H22瘤的报道。

图1为给药前后H22肝癌瘤模型小鼠血清中TNF-α含量的对比结果。由图中可见，超临界萃取的石莼多糖可以显著降低TNF-α含量，有效抑制肿瘤的成长与扩散。

图2为模型组（A）和超临界萃取多糖组（B）的肿瘤切片的HE染色镜检图。由图中可见，相比于模型组瘤细胞的混乱***及无序堆叠，超临界萃取多糖组部分肿瘤区细胞染色体紊乱得到抑制，细胞核成型，形态往正常细胞趋近，并呈渐进变化趋势，说明药物可以激活免疫力，修复肿瘤导致的病变区域，促使病变组织恢复正常。

经综合分析，本发明获得的石莼多糖的抑瘤能力高于传统抗肿瘤药物环磷酰胺，并能抑制肿瘤的生长扩散，同时对病变组织有一定的修复效果，且实验过程中无明显毒副作用，未发现小鼠有器官病变、死亡率增高、畸变等现象。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。