阅读说明：本技术 一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法 (Self-aggregation granular sludge construction method for wastewater gradient energy recovery ) 是由 邢德峰 李�真 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法,属于发酵产氢技术领域。本发明为了解决现有废水处理混合培养体系组成复杂、启动时间长、能源效率低,操作繁琐、成本高、不利于扩大化等问题。本发明将哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和铜绿假单胞菌PqsL共培养形成的自聚集颗粒污泥接种至连续流生物制氢反应器中,通过微生物互作快速启动反应器,在处理废水同时高效回收氢气和乙醇等能源。本发明的铜绿假单胞菌PqsL能够快速消耗连续流生物制氢反应器内的氧气,为哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3提供适宜厌氧环境,使其在未经厌氧处理的连续流生物制氢反应器体系中进行快速连续产氢,简化反应条件的同时,缩短反应器的启动时间。(A self-aggregation granular sludge construction method for waste water gradient energy recovery belongs to the technical field of fermentation hydrogen production. The invention aims to solve the problems of complex composition, long starting time, low energy efficiency, complex operation, high cost, unfavorable expansion and the like of the existing wastewater treatment mixed culture system. The invention inoculates self-aggregation granular sludge formed by co-culturing the ethanol producing bacillus harbin YuAN-3 and the pseudomonas aeruginosa PqsL into a continuous flow biological hydrogen production reactor, quickly starts the reactor through microbial interaction, and efficiently recovers energy sources such as hydrogen, ethanol and the like while treating wastewater. The pseudomonas aeruginosa PqsL can quickly consume oxygen in the continuous flow biological hydrogen production reactor, provides a suitable anaerobic environment for the Harbin ethanol producing bacterium YUAN-3, quickly and continuously produces hydrogen in a continuous flow biological hydrogen production reactor system without anaerobic treatment, simplifies reaction conditions and shortens the starting time of the reactor.)

一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法

技术领域

本发明涉及一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法，属于发酵产氢技术领域。

背景技术

发酵法生物制氢能够在常温常压下利用有机废水生产清洁高效的氢气能源，具有产氢率高、生态友好、成本低等诸多优点。而氢作为一种重要的能量载体，燃烧密度高，清洁可持续，是一种极具发展前景的化石燃料替代品。

绝大多数厌氧发酵法生物制氢体系是以不同废水来源的预处理厌氧活性污泥为接种物的混合培养体系，其优势在于接种方便、操作简单、整个运行过程不需要灭菌处理。然而，混合培养体系具有复杂的有机组成和多变的氧含量，启动时间长，大大影响生物制氢系统的发酵特性和产氢能力。单一的纯培养体系虽然发酵类型固定、产氢效率高，但对培养条件极为敏感，一旦培养环境不适宜，制氢效率会大大降低，运行条件繁琐、成本高，不适合运用于连续制氢。尤其是哈尔滨产乙醇杆菌，其培养需要严格的厌氧环境，操作繁琐，条件苛刻，成本高、不利于扩大化。因此，提供一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法是十分必要的。

发明内容

本发明为解决现有混合培养体系组成复杂、启动时间长、制氢效率低，需要严格厌氧条件，操作繁琐、成本高、不利于生物制氢的扩大化等问题，提供了一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法。

本发明的技术方案：

一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法，该方法的具体操作步骤如下：

将哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)YUAN-3和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PqsL共培养形成的自聚集颗粒污泥接种至连续流生物制氢反应器中，35℃-37℃恒温共培养5小时后开始产氢产乙醇；所述的连续流生物制氢反应器的水力停留时间为6小时-12小时，回流比为6：1。

优选的：所述的铜绿假单胞菌PqsL培养操作步骤如下：将液体培养基A经高温高压蒸汽灭菌后，接种铜绿假单胞菌PqsL，然后在温度为35℃、转速为100rpm的恒温摇床里震荡培养6小时-12小时，得到淡黄色浑浊菌液，然后取100ml-300ml淡黄色浑浊菌液，12000r/h离心1分钟，弃上清液，得到铜绿假单胞菌PqsL的接种物。

最优选的：所述的淡黄色浑浊菌液在波长600nm处吸光度为0.9-1.0。

最优选的：每1L所述的液体培养基A由2.0g的蛋白胨，1.0g的酵母提取物，2.0g的NaCl组成。

优选的：所述的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3培养操作步骤如下：将液体培养基B经纯度为99.99％的N₂曝气和高温高压蒸汽灭菌后，接种哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3，在温度为35℃、转速为100rpm的恒温摇床里震荡培养24小时-48小时，得到伴有球状凝集颗粒的浑浊菌液，取100ml-300ml的浑浊菌液12000r/h离心1分钟，弃上清液，得到哈尔滨乙醇杆菌YUAN-3的接种物。

最优选的：每1L所述的液体培养基B由5g-15g的葡萄糖，1.0g的牛肉膏，2.0g的NaCl，1.0g的K₂HPO₄，0.2g的MgCl₂·6H₂O，0.1g-0.5g的L-半胱氨酸组成。

优选的：所述的共培养自聚集颗粒污泥接种物的培养操作步骤如下：将废水培养液经高温高压蒸汽灭菌后，同时接种0.05g-0.1g哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3接种物和0.05g-0.1g铜绿假单胞菌PqsL接种物，在温度为35℃、转速为100rpm的恒温摇床里震荡培养24小时-48小时，得到伴有球状凝集颗粒的浑浊菌液，取100ml-300ml的浑浊菌液8000r/h离心5分钟，弃上清液，得到自聚集颗粒污泥接种物。

优选的：所述的连续流生物制氢反应器包括反应器主体1、进水瓶2、进水泵3、循环泵4、收集气袋5和填料6，所述的反应器主体1通过进水泵3与进水瓶2连接，反应器主体1的上、下两端之间配有循环泵4进行回流，反应器主体1的上端连接收集气袋5用来收集反应器主体1内产生的氢气，多孔泡沫填料6填充在反应器主体1内，反应器主体1还设有溢流堰，反应器主体1的出水经过溢流堰排出；并且反应器主体1内设置有三相分离器，三相分离器用来分离上浮菌体、水和气体；所述的反应器主体1为有机玻璃，反应器主体1的有效反应区高径比为7：1，有效反应区体积为1L；所述的连续流生物制氢反应器的反应器主体1中装有pH为7的废水培养液，进水瓶2中装有pH为7-9的废水培养液。

最优选的：每1L所述的反应器主体1中废水培养液中接种0.5-1g自聚集颗粒污泥接种物。

最优选的：每1L所述的废水培养液含有5g-15g的蔗糖，1.0g的牛肉膏，2.0g的蛋白胨，1.0g的酵母提取物，2.0g的NaCl，1.0g的K₂HPO₄，0.2g的MgCl₂·6H₂O，0.1g-0.5g的L-半胱氨酸。

本发明具有以下有益效果：本发明利用哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和铜绿假单胞菌PqsL共培养形成的自聚集颗粒污泥接种至连续流生物制氢反应器中，通过微生物互作快速启动反应器，在处理废水同时高效回收氢气和乙醇等能源。具体的本方法中使用铜绿假单胞菌PqsL能够快速消耗连续流生物制氢反应器内的氧气，为哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3提供适宜厌氧环境，使其在未经厌氧处理的连续流生物制氢反应器体系中进行快速连续产氢，简化反应条件的同时，缩短反应器的启动时间，使本方法可以在启动5小时后即可实现快速连续稳定产氢，最大氢气产率为2.2mol-氢气/mol-蔗糖，大幅降低制氢成本。并且本方法结合连续流生物制氢反应器高传质效率、高底物转化和低水力停留时间(HRT)等优秀性能，最终收集得到的氢气纯度更高，产率更大。此外，本发明还具有操作简便，适合扩大化的优势。

附图说明

图1为本发明连续流生物制氢反应器的结构示意图；

图中1-反应器主体，2-进水瓶，3-进水泵，4-循环泵，5-收集气袋，6-填料。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述具体实施例中涉及的哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)是2005年邢德峰等分离获得的乙醇型发酵的主要产氢功能细菌，其中菌株YUAN-3是从生物制氢反应器中分离得到的一株严格厌氧的高效产氢菌株，它是已报道的唯一一株具有自凝聚能力的产氢细菌，保藏编号为CGMCC No.1152。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种广泛存在于自然界的兼性厌氧细菌，实验室中可在LB培养基中好氧培养，能够快速消耗密闭环境中的氧气。

具体实施方式1：本实施方式中提供了一种废水梯级能源回收的自聚集颗粒污泥构建方法，该方法的具体操作步骤如下：

(一)在恒温摇床内好氧培养铜绿假单胞菌PqsL：采用经高温高压蒸汽灭菌后的液体培养基A培养铜绿假单胞菌PqsL，将接种后的锥形瓶放置在恒温摇床里震荡培养，其中，恒温摇床温度为35℃，转速为100rpm，12小时后形成在波长600nm处吸光度达0.9-1.0的淡黄色浑浊菌液，取100ml-300ml淡黄色浑浊菌液，12000r/h离心1分钟，弃上清液，得到铜绿假单胞菌PqsL的接种物；其中每1L液体培养基A由2.0g的蛋白胨，1.0g的酵母提取物，2.0g的NaCl组成。并且向液体培养基A中加入微量元素和维生素。

(二)在恒温摇床内厌氧培养哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3：采用经高纯N₂(99.99％)曝气并高温高压蒸汽灭菌后的液体培养基B培养哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3，将接种后的厌氧瓶放在恒温摇床中震荡培养，其中，恒温摇床温度为35℃，转速为100rpm，40小时后在厌氧瓶底部形成白色球状凝集颗粒的浑浊菌液，取100ml-300ml淡黄色浑浊菌液，12000r/h离心1分钟，弃上清液，得到哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的接种物；其中每1L液体培养基B由11g的葡萄糖，1.0g的牛肉膏，2.0g的NaCl，1.0g的K₂HPO₄，0.2g的MgCl₂·6H₂O，0.3g的L-半胱氨酸组成；其中液体培养基B的配置方法为：先加入除L-半胱氨酸外的所有药品并煮沸10分钟，冷却至室温后加入L-半胱氨酸并溶解，继续煮沸定容至1L，并用多通道曝气针将高纯氮气(99.99％)曝入培养液中，直到培养液由粉红色变为啤酒色，稳定五分钟后将气针取出，瓶口用胶塞封死，最后经过121℃高压蒸汽灭菌，持续时间为15分钟。

(三)自聚集颗粒污泥接种物的培养：将废水培养液经高温高压蒸汽灭菌后，同时接种0.07g的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和0.07g的铜绿假单胞菌PqsL，在温度为35℃、转速为100rpm的恒温摇床里震荡培养24小时-48小时，得到伴有球状凝集颗粒的浑浊菌液，取100ml-300ml的浑浊菌液8000r/h离心5分钟，弃上清液，得到自聚集颗粒污泥接种物；其中每1L所述的废水培养液含有13g的蔗糖，1.0g的牛肉膏，2.0g的蛋白胨，1.0g的酵母提取物，2.0g的NaCl，1.0g的K₂HPO₄，0.2g的MgCl₂·6H₂O，0.1g-0.5g的L-半胱氨酸。其中，每1L废水培养液由13g的蔗糖，1.0g的牛肉膏，2.0g的蛋白胨，1.0g的酵母提取物，2.0g的NaCl，1.0g的K₂HPO₄，0.2g的MgCl₂·6H₂O，0.3g的L-半胱氨酸组成。并且向废水培养液中加入微量元素和维生素。

(四)运行连续流制氢反应器：将废水培养液注入连续流生物制氢反应器的反应器主体1和进水瓶2中，并调节反应器主体1内废水培养液的pH为7，调节进水瓶2中废水培养液的pH值为7-9，反应器主体1通过进水泵3与进水瓶2连通，反应器主体1的反应区设有三相分离器，以分离反应器主体1内上浮菌体、水和气体，菌体经过沉降区返回反应区，反应器上、下端之间配有循环泵4进行回流，上端连接收集气袋5来收集氢气，反应器主体1的出水经过溢流堰排出。该连续流生物制氢反应器的有效反应区高径比为7:1，有效反应区体积为1L。反应器的水力停留时间为8小时，回流比为6：1，运行5小时后即开始稳定产氢，最大氢气产率为2.2mol-氢气/mol-蔗糖，反应持续45天。

每1L的液体培养基A和废水培养液中均提供微量元素溶液和维生素溶液各8ml。其中，微量元素溶液含有3.0g/L的MgSO₄·7H₂O，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.1g/L的ZnSO₄·7H₂O，0.01g/L的H₃BO₃，0.1g/L的CaCl₂·2H₂O，0.01g/L的Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g/L的CoCl₂·6H₂O，0.024g/L的NiCl₂·6H₂O，0.025g/L的Na₂WO₄·2H₂O，0.01g/L的CuSO₄·5H₂O，0.01g/L的KAl(SO₄)₂·12H₂O，1.0g/L的NaCl。维生素溶液的组成为0.2g/L的维生素H，0.5g/L的维生素B₁，0.5g/L的维生素B₂，0.5g/L的维生素B₅，1g/L的维生素B₆，0.001g/L的维生素B₁₂，0.025g/L的核黄素，0.02g/L的柠檬酸，0.01g/L的叶酸，0.5g/L的硫辛酸，0.5g/L的对氨基苯甲酸。

并且本实施例中摇床培养的方式还可以采用恒温室内的多通道磁力搅拌器搅拌培养的方式替代，培养条件为35℃、100r/min(2cm磁力搅拌子)。

具体实施方式2：本实施方式中提供了哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3在连续流生物制氢反应器培养方法，该方法操作步骤与具体实施方式1的主要区别为在步骤(四)中仅接种哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的接种物，其余培养条件及步骤均相同，该方法的培养40小时后开始产氢气，最大氢气产率为1.62mol-氢气/mol-蔗糖。

具体实施方式1与具体实施方式2的产氢效果对比如下表，

由上表可知，将哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3和铜绿假单胞菌PqsL的自聚集颗粒污泥接种在连续流生物制氢反应器中，可显著缩短连续流生物制氢反应器的启动时间的同时，最大产氢速率明显增加，且对底物利用率没有不利影响。可知，自聚集颗粒污泥接种至连续流生物制氢反应器中是处理废水同时高效回收氢气和乙醇等能源的有效策略，在复杂环境如特殊基质、低pH值、低温或有氧环境等也可实现高效产氢，可进一步应用于实际生产。