阅读说明：本技术 一种地下水遗传毒性的检测方法及应用 (Detection method and application of groundwater genetic toxicity ) 是由 陈晓雯 赵建亮 胡立新 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种地下水遗传毒性的检测方法及应用,属于环境健康遗传毒理学领域,包括步骤如下：预培养、前处理、暴露反应和结果分析,本发明通过在各个阶段进行适应性优化,提高了菌种敏感性；具有良好的平行性和重现性。本发明用于甄别和检测水环境具有的遗传毒性效应,评估遗传毒性效应强度,为进一步采取污染防治措施提供科学依据。(The invention discloses a detection method and application of groundwater genotoxicity, belonging to the field of environmental health genotoxicology, comprising the following steps: the method has the advantages that the method improves the sensitivity of strains by performing adaptive optimization at each stage; has good parallelism and reproducibility. The method is used for screening and detecting the genotoxic effect of the water environment, evaluating the strength of the genotoxic effect and providing scientific basis for further adopting pollution prevention and control measures.)

一种地下水遗传毒性的检测方法及应用

技术领域

本发明属于环境健康遗传毒理学领域，尤其涉及一种地下水遗传毒性的检测方法及应用。

背景技术

近年来，由于人类活动引起地下水化学成分、物理性质和生物学特性发生改变而使水环境质量整体下降的事件已层出不穷，有研究甚至指出城市地下水过半遭严重污染。作为居民饮用水的重要来源，地下水污染的原因和程度各有差异，除了单纯的关注某类化合物的化学浓度指标，其综合的生物毒性效应及其表征也值得关注，目前关于地下水的各类毒性检测技术正亟待优化和推广，其中，关于遗传毒性效应的检测就是典型例子。

另一方面，不少研究表明，环境水体中存在许多具有遗传毒性效应的物质，长期暴露于这些物质下，即便剂量较低，也会增加人类的癌症发病率。此外，由于这些遗传毒性物质种类繁多，很多浓度属于微量或痕量级水平，仅用化学检测手段很难准确评估其遗传效应。

遗传毒性物质主要是指亲电的或经过代谢转化后形成亲电中间体的潜在致癌物。这些物质能与DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)产生相互化学作用而引起DNA或RNA损伤变异，损伤没有得到及时修复，就会引起突变，甚至癌变，且能在子代中产生有害遗传变异效应。其中，DNA损伤包括DNA链断裂、分子基体修饰和DNA交联等方式。

部分多环芳烃、农药、酚类和蒽醌类物质能导致生物体发生DNA损伤，具有潜在遗传效应。部分苯并噻唑化合物也具有明显的毒性效应，特别是一些杂环胺类化合物。

但目前，国外针对水环境中遗传毒性物质，诸如芳香胺和硝基多环芳烃类物质等的研究较多，其它化合物调查和确认研究相对较零散。国内关于各种遗传毒性物质在水环境中的研究则更少。因此，需尽快建立合适的筛查方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种地下水遗传毒性的检测方法及应用，用于甄别和检测水环境具有的遗传毒性效应，评估遗传毒性效应强度，为进一步采取污染防治措施提供科学依据。

本发明采用的技术方案如下：

一种地下水遗传毒性的检测方法，包括以下步骤：

S1.预培养：将鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium TA 1535/PSK 1002菌液加入含50mg/mL氨苄青霉素的LB培养基，在37℃、150rpm条件下恒温振荡隔夜培养10-12h，得到实验用菌液；

S2.前处理：采集地下水样品，通过固相萃取法处理，得到实验样品；

S3.暴露反应：在S2步骤所得实验样品中加入S1步骤所得实验用菌液，用TGA培养液稀释10倍后于37℃，150rpm条件下恒温振荡培养1.5-2h，使其595nm吸光度达到0.5-0.8，再在37℃，800rpm条件下恒温振荡培养3.5-4h，得稀释后混合液，测量其在595nm吸光度；

在稀释后混合液中依次加入B-buffer-SDS混合溶液和4.5mg/mL的O-NPG溶液，于30℃、800rpm条件下振荡反应30-35min；最后加入1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，分别于420nm和550nm波长下测定吸光度；

S4.结果分析：采用诱导率判别是否具有遗传毒性，根据样品的梯度曲线进一步甄别假阳性结果，并用标准品的毒性当量浓度来表征样品的遗传毒性效应强度。

LB培养液：21g LB肉汤溶解于1L milli-Q水中，121℃下灭菌20min；在超净台内冷却后加入50mg/mL氨苄青霉素1mL，制得含50mg/mL氨苄青霉素的LB培养基；于4℃保存。milli-Q水超纯水是美国Millipore公司Milli-Q Academic A10超纯水系统生产的。尤为适合细胞培养。

TGA培养液：10g胰蛋白胨，5gNaCl，11.9gHEPES缓冲液于900mL milli-Q水，调节pH至7.0±0.2，稀释至980mL milli-Q水，121℃下灭菌20min，再在超净台内加入10wt％葡萄糖20mL，混合均匀，冷却后加入50mg/mL氨苄青霉素1mL。

B-Buffer溶液：40.6g Na₂HPO₄·12H₂O(0.1M，MW＝358.14)，6.24gNaH₂PO₄·2H₂O(0.04M，MW＝156.01)，0.75gKCl(0.01M，MW＝74.55)，0.12g/0.25g MgSO₄/MgSO₄·7H₂O(0.001M，MW_MgSO4＝120.37)于900mL milli-Q水中。调节pH值至7.0±0.2，稀释至1000mL。使用前于通风橱内取15mL加入40.5μLβ-巯基乙醇溶液。

O-NPG溶液：45mg O-NPG溶于10mL磷酸缓冲溶液，现配现用，水浴溶解(50℃)。其中，磷酸缓冲液：称取0.61g NaH₂PO₄·2H₂O和2.18g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于100mL milli-Q水，调节pH值至7.0±0.2，灭菌20min。O-NPG(2-Nitrophenylβ-D-galactopyranoside，2-硝基苯基-β-D-半乳糖苷，SIGMA)为显色剂。

本发明的原理为：鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium TA 1535/pSK10020umuC基因在正常情况下被LexA基因产物一阻遏蛋白所封闭，当环境污染物使细菌的DNA受损，细菌即产生SOS反应，菌体RecA基因产物被激活，成为具有活性的蛋白水解酶，此酶可切除阻遏蛋白，使受封闭的umuC操纵子启动，并带动umuC-LacZ融合基因转录和翻译，表达出有β-半乳糖苷酶活性的融合蛋白。通过检测该酶被诱导的活性，即可判断受试物引起DNA损伤的程度。

进一步地，S1步骤中菌液与含50mg/mL氨苄青霉素的LB培养基的体积比为1:400-420。

进一步地，S1步骤中菌液与含50mg/mL氨苄青霉素的LB培养基的体积比为1:420。

进一步地，S1步骤所得实验用菌液在595nm吸光度为1.6-1.8。

进一步地，S2步骤中固相萃取法，具体为：将采集的1L地下水样品过GF/F滤膜，HLB固相萃取柱分别用10mL甲醇和10mL Milli-Q水进行活化，然后再以3-5mL/min的流速过HLB柱；完毕后，以2×50mL 5vt％甲醇的水溶液润洗采样瓶，并过HLB柱，再分别向每根柱里加入2×5mL Milli-Q水，抽干2h；先后以7mL甲醇和5mL二氯甲烷洗脱，合并洗脱液，于氮气下吹干，以1mL甲醇定容，过0.22μm有机相滤膜并转移至深色小瓶中于-18℃保存。

GF/F滤膜为市售的玻璃纤维滤膜；milli-Q水超纯水是美国Millipore公司Milli-Q Academic A10超纯水系统生产的。尤为适合细胞培养。

进一步地，S3步骤中S2步骤所得实验样品和S1步骤所得实验用菌液的体积比为1:18-20；优选为1:19。由于样品和菌液的混合比例对结果的准确性至关重要；如果菌液浓度过高，样品容易被稀释，毒性降低后难以测定，梯度曲线基本不呈现抑制特征；如果菌液浓度过低，则细菌生长量不足，可能导致细菌受样品刺激而大量死亡，规律性极差；因此，经过实验，将样品和菌液的混合比例确定为1：19，此时菌液的A595值介于0.5-0.8，即暴露阶段总体积为200μL。

进一步地，S3步骤中B-buffer-SDS混合溶液由B-Buffer溶液与0.1wt％SDS按20:1的体积比混合而得；现配现用。SDS为十二烷基硫酸钠。

进一步地，S3步骤中B-buffer-SDS混合溶液、O-NPG溶液与稀释后混合液的体积比为11-14:2-4:4-6；优选为12:3:5。

进一步地，S3步骤中Na₂CO₃溶液与稀释后混合液的体积比0.8-1.2:0.8-1.5；优选为1:1。

上述的方法在遗传毒性的检测与评估中的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明预培养阶段的操作保证菌种的活性，并采用LB培养基，由于LB培养基有助于细菌进行快速扩增，且增强了菌种活性，可在10-12小时内达到预培养要求，解决了现有技术一般采用TGA培养基难以使菌种在规定时间内达到培养浓度要求的问题；

2、本发明中，为使菌种在实验过程中生长环境稳定，使用TGA培养基将实验用菌液于37℃，150rpm条件下恒温振荡培养1.5-2h，由于菌液浊度的吸光值响应度在595nm处的响应值最高，使其595nm吸光度达到0.5-0.8，另外，该菌种在1.5-2小时之间进入对数生长期，因此将前培养时间定为1.5-2小时，菌种敏感性高；

3、本发明中，由于样品和菌液的混合比例对结果的准确性至关重要；如果菌液浓度过高，样品容易被稀释，毒性降低后难以测定，梯度曲线基本不呈现抑制特征；如果菌液浓度过低，则细菌生长量不足，可能导致细菌受样品刺激而大量死亡，规律性极差；因此，经过实验，将样品和菌液的混合比例确定为1：19，有效提高了准确性；

4、本发明中，暴露时间也是一个关键控制因素，暴露时间较短，容易使暴露不完全，毒性显示不显著，结果规律性不强，无法呈现良好的S型剂量关系，而暴露时间过长，容易导致假阳性结果的出现，因此，根据暴露阶段结束后菌液的A₅₉₅值变化，选择在37℃，800rpm恒温振荡条件下暴露4小时，进一步提高了准确性；

5、本发明除了采用常规IR值对样品是否具有遗传毒性进行判别，同时还根据样品的梯度曲线进一步甄别假阳性结果，用4-NQO标准品的当量浓度来表征样品的遗传毒性效应强度，其结果与传统方法有很好的吻合度，且可反映部分毒性较弱的样品点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为地下水遗传毒性效应分布图；

图2为Salmonella typhimurium TA 1535/PSK 1002生长曲线(37℃，175rpm)图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

本发明较佳实施例提供的一种地下水遗传毒性的检测方法，具体步骤如下：

(1)取Salmonella typhimurium TA 1535/PSK 1002菌液冻存管，常温解冻，解冻后加1mL LB培养液，离心(10min，3000g)，吸取并弃掉上清液，加入含50mg/mL氨苄青霉素的LB培养基1mL，充分混匀后，吸取150μL加入到20mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、150rpm条件下恒温振荡隔夜培养10-12小时，此时菌液在595nm处吸光度为1.6-1.8。

(2)将从10个采样点采集的1L地下水样品过GF/F滤膜，HLB固相萃取柱分别用10mL甲醇和10mL Milli-Q水进行活化，然后再以3-5mL/min的流速过HLB柱；完毕后，以2×50mL5vt％甲醇的水溶液润洗采样瓶，并过HLB柱，再分别向每根柱里加入2×5mL Milli-Q水，抽干2h；先后以7mL甲醇和5mL二氯甲烷洗脱，合并洗脱液，于氮气下吹干，以1mL甲醇定容，过0.22μm有机相滤膜并转移至深色小瓶中于-18℃保存；取200μL甲醇样品氮气吹干后定容于200μL二甲基亚砜中，用TGA培养液稀释10倍后稀释，取10μL稀释后的样品移至另一个96微孔板上相应的孔内，于超净台内进行。加完样品或标样的孔需尽快加入菌液于各个孔内，开始暴露反应。

阳性对照物：4-NQO(4-nitroquinoline-N-oxide，4-硝基喹啉-1-氧化物，SIGMA)；4-NQO溶液由溶解10mg 4-NQO于10mL二甲基亚砜中，-20℃冰箱内保存。用4-NQO做阳性对照；取4-NQO 10μL各浓度于孔板中，3个平行，1行为二甲基亚砜阴性对照。进行下一步反应。

(3)于37℃、150rpm条件下恒温振荡隔夜培养1.5-2小时，使其595nm吸光度达到0.5-0.8，移取菌液到加有样品的96孔板，在37℃，800rpm条件下恒温振荡培养4小时，测量其595nm吸光度；移出50μL于新的96孔板中，再加入120μL的B-buffer-SDS混合溶液，加入30μL 4.5mg/mL O-NPG溶液，启动酶反应，置于恒温摇床上培养，于30℃，800rpm条件下振荡反应30min；加入50μL1M Na₂CO₃溶液终止反应；取上清液200μL至96微孔板中，分别于420nm和550nm波长下测定吸光值。

(4)数据分析：

1.计算公式

用以下公式计算半乳糖苷酶活性U：

U＝1000×(OD₄₂₀-1.75×OD₅₅₀)/(t×v×OD₅₉₅)

其中，t为加入O-NPG后的反应时间，单位为min；OD₅₉₅、OD₄₂₀、OD₅₅₀为所测样品吸光度值；v为反应菌液的稀释倍率，即菌液/(菌液+buffer+SDS+碳酸钠)，本发明为0.2。

2.浓度vs酶活性做图

对阳性标准曲线作图，并用希尔方程拟合计算出样品及阳性控制的EC₅₀，如下所示：

or

式中，Amax为最大极限值；Amin为最小极限值；p为希尔斜率；EC₅₀为半数效应浓度，A为吸光值，C为测得的效应浓度。样品的当量效应浓度可通过测得的吸光度值进行逆运算推导。

样品的毒性用4-NQO的毒性当量(NEQ)表示，其计算方法为：NEQ(样品)＝EC₅₀(标曲)/EC₅₀(样品)；对于没有达到50％效应的样品可以选取接近50％效应的效应值代入到拟合的希尔方程，计算出该效应点的浓度，根据稀释倍数计算出样品中的毒性当量。

3.验证

阳性控制的结果验证如下：

式中，G为生长因子，I_R为诱导率；A_595,T为待测样品在595nm处的吸光度，A_595,B为空白在595nm处的吸光度，A_595,N为负对照在595nm处的吸光度；A_420,T为待测样品在420nm处的吸光度；其中，正对照I_R需大于2，G大于0.5的数据可用于计算I_R。

同理，样品的实验结果也可以通过诱导率I_R表示和进一步验证：

1_R＝U_样品/U_溶剂

式中，当I_R≥2时，表示诱导显著，结果为阳性，I_R<2时，表示诱导不显著，结果为阴性。

结果如图1和下表1所示(10件地下水样品分别标记为S1-S10)，阳性的组分在当量表达中也相应的浓度较高，而当量浓度还可显示部分弱效应点位的浓度，可见梯度当量表征具有更高的灵敏性。

表1地下水遗传毒性I_R值分布

+表示诱导显著；-表示诱导不显著。

实验例

本发明对鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002进行了生长曲线测定(TGA培养基体系)，结果如图2所示。

由图可知，该菌种在1.5-2小时之间进入对数生长期，因此将前培养时间定为1.5-2小时。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。