阅读说明：本技术 一种薄荷dna提取的新工艺 (Novel technology for extracting mint DNA ) 是由 薛刚 张嫽 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种薄荷DNA提取的新工艺,包括：鲜薄荷植株剪碎,在液氮中磨成薄荷粉；取薄荷粉,加入2-3倍重量份的乙醚和乙醇混合液,常温浸泡2-3h,其中,乙醚：乙醇为1:1.2-1.5；向S2中的浸泡液中加入等体积的纯净水,在50-60℃下水热处理1-2h,离心获得沉淀物；取沉淀物5-10g,加入15-20mL 65℃预热的裂解缓冲液和300-400μL的β-巯基乙醇,于60-70℃下保温40-50min;加入15-20mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液,混合后,室温下离心分离获得上清液；向上清液中加入等体积的异丙醇,出现絮状沉淀,离心分离获得DNA沉淀；用体积浓度为75%的乙醇洗涤DNA沉淀,获得薄荷DNA,达到了提高薄荷DNA纯度的效果。(the invention discloses a novel technology for extracting mint DNA, which comprises the following steps: cutting fresh herba Menthae plant, and grinding into herba Menthae powder in liquid nitrogen; taking mint powder, adding a mixed solution of diethyl ether and ethanol in an amount which is 2-3 times of the weight of the mint powder, and soaking for 2-3 hours at normal temperature, wherein the weight ratio of diethyl ether: the ratio of ethanol is 1: 1.2-1.5; adding purified water with the same volume into the soak solution in the S2, carrying out hydrothermal treatment at 50-60 ℃ for 1-2h, and centrifuging to obtain a precipitate; taking 5-10g of precipitate, adding 15-20mL of lysis buffer preheated at 65 ℃ and 400 mu L of beta-mercaptoethanol at 300-70 ℃, preserving the temperature for 40-50min at 60-70 ℃, adding 15-20mL of phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution with the volume ratio of 25:24:1, mixing, and performing centrifugal separation at room temperature to obtain supernatant; adding isopropanol with the same volume into the supernatant to generate flocculent precipitate, and performing centrifugal separation to obtain DNA precipitate; the DNA precipitate is washed by ethanol with the volume concentration of 75 percent to obtain the mint DNA, thereby achieving the effect of improving the purity of the mint DNA.)

一种薄荷DNA提取的新工艺

技术领域

本发明涉及植物DNA提取技术领域，特别涉及一种薄荷DNA提取的新工艺。

背景技术

薄荷为唇形科植物，属内约有30种植物，广泛分布于北半球的温带地区。薄荷属内多种植物具有药用价值，可用于食品、医药、香料、化妆品等领域。

薄荷品种的准确鉴定是其安全运用的前提和保障，利用分子标记从DNA分子水平揭示薄荷品种间的差异以及相关性，可以对其亲缘关系做出更为准确的鉴定，在分子水平上为薄荷种质资源的品种分类、质量评价等提供依据。

薄荷中含有大量薄荷油，影响薄荷DNA的提取进程，薄荷油容易大量留存于薄荷DNA提取物中，导致薄荷DNA的纯度不高，进而影响薄荷DNA的后续使用。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种薄荷DNA提取的新工艺，达到提高薄荷DNA提取纯度的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种薄荷DNA提取的新工艺，包括有以下步骤：

S1液氮研磨：鲜薄荷植株剪碎，在液氮中磨成薄荷粉；

S2浸泡：取薄荷粉，加入2-3倍重量份的***和乙醇混合液，常温浸泡2-3h，其中，***：乙醇的体积比为1:1.2-1.5；

S3水热处理：向S2中的浸泡液中加入等体积的纯净水，在50-60℃下水热处理1-2h，离心获得沉淀物；

S4 DNA提取：取沉淀物5-10g，加入15-20mL 65℃预热的裂解缓冲液和300-400μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于60-70℃下保温40-50min；加入15-20mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S5 DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S6 DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得薄荷DNA。

通过采用上述方案，在DNA提取之前，预先进行浸泡和水热处理，设置合理的浸泡和水热处理参数，使得薄荷中的大量挥发油等物质溶于溶液中，而大部分的薄荷DNA仍然存在于沉淀物中，通过离心分离，获得包含大量薄荷DNA的沉淀物，之后，再进行DNA的提取，能够极大的降低薄荷DNA中的挥发油等物质，提高薄荷DNA的提取纯度，便于薄荷DNA的分析，并为薄荷种质资源的品种分类、质量评价等提供依据。

DNA提取用裂解缓冲液为3％CTAB、100mmol/L Tris-HCl,pH 8.0、20mmol/L EDTA,pH8.0、1.4mol/L NaCl、2％β-巯基乙醇。Tris-HCl(Ph8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA鳌合Mg²⁺或Mn²⁺离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变。

较佳的，步骤S2中，***：乙醇为1:1.3。

较佳的，步骤S2中，辅助超声波处理，超声波功率为50-100W。

通过采用上述方案，经过超声波处理，超声波在水中传播产生特殊的“空化效应”，不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴，微气穴不断“***”产生微观的强大冲击波，冲击波不断作用在薄荷组织上，进一步剥蚀薄荷组织的内部结构，促进挥发油等物质的外逸，提高挥发油等物质的去除效果。

较佳的，步骤S2中，超声波间隔处理多次，每次超声波处理时间为5-8min,相邻两次超声波处理之间间隔20-40min。

较佳的，步骤S2中，超声波功率为80W，每次超声波处理时间6min,相邻两次超声波处理之间间隔30min。

通过采用上述方案，超声波处理时间过长，容易导致薄荷组织在超声处理过程中产生的碎片过多，造成挥发油等的外逸通道堵塞，影其外逸。限定超声波处理时间和间隔时间，给薄荷组织碎片足够的流动时间，避免其堵塞挥发油等物质的外逸通道，进一步提高挥发油等的去除效果。此外，超声波间隔处理的设置还能降低能耗，进而降低成本。

较佳的，步骤S3中，取沉淀物8g，加入16mL 65℃预热的裂解缓冲液和320μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于65℃下保温45min；加入16mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液。

本发明的目的二：提供一种上述方法制备的薄荷DNA。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、DNA提取之前，预先通过浸泡和水热处理去除薄荷中的大量挥发油等物质，之后，再对包含大量薄荷DNA的沉淀物进行DNA提取，能够极大的降低薄荷DNA中的挥发油等杂质，提高薄荷DNA的提取纯度；

2、浸泡过程中进行超声波辅助处理，促进挥发油等的外逸，提高挥发油等的去除效果；

3、限定超声波处理时间和间隔时间，给薄荷组织碎片足够的流动时间，避免其堵塞挥发油等的外逸通道，进一步提高挥发油等的去除效果。此外，超声波间隔处理的设置还能降低能耗，进而降低成本。

具体实施方式

以下对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种薄荷DNA提取的新工艺，包括有以下步骤：

S1液氮研磨：鲜薄荷植株剪碎，在液氮中磨成薄荷粉；

S2浸泡：取薄荷粉，加入2倍重量份的***和乙醇混合液，常温浸泡2h，其中，***：乙醇的体积比为1:1.2；期间，辅助超声波处理，超声波功率为50W，超声波间隔处理两次，每次超声波处理时间为5min,相邻两次超声波处理之间间隔20min；

S3水热处理：向S2中的浸泡液中加入等体积的纯净水，在50℃下水热处理1h，离心获得沉淀物；

S4 DNA提取：取沉淀物5g，加入15mL 65℃预热的裂解缓冲液和300μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于60℃下保温40min；加入15mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S5 DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S6 DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得薄荷DNA，

上述裂解缓冲液的配比为：3％CTAB；100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)；20mmol/L EDTA(pH 8.0)；1.4mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇。100mL裂解缓冲液的配置过程为：取10％CTAB30mL，加1mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)10mL，加0.5mol/L EDTA(pH 8.0)4mL，加5mol/L NaCl28mL，定容至100mL，高压灭菌20min，β-巯基乙醇现用现加。

实施例2

S1液氮研磨：鲜薄荷植株剪碎，在液氮中磨成薄荷粉；

S2浸泡：取薄荷粉，加入2.5倍重量份的***和乙醇混合液，常温浸泡2.5，其中，***：乙醇的体积比为1:1.3；期间，辅助超声波处理，超声波功率为80W，超声波间隔处理两次，每次超声波处理时间为6min,相邻两次超声波处理之间间隔30min；

S3水热处理：向S2中的浸泡液中加入等体积的纯净水，在55℃下水热处理1.5h，离心获得沉淀物；

S4 DNA提取：取沉淀物8g，加入16mL 65℃预热的裂解缓冲液和320μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于65℃下保温45min；加入16mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S5 DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S6 DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得薄荷DNA，

裂解缓冲液的配比和配置同实施例1。

实施例3

S1液氮研磨：鲜薄荷植株剪碎，在液氮中磨成薄荷粉；

S2浸泡：取薄荷粉，加入3倍重量份的***和乙醇混合液，常温浸泡3h，其中，***：乙醇的体积比为1:1.5；期间，辅助超声波处理，超声波功率为100W，超声波间隔处理两次，每次超声波处理时间为8min,相邻两次超声波处理之间间隔40min；

S3水热处理：向S2中的浸泡液中加入等体积的纯净水，在60℃下水热处理2h，离心获得沉淀物；

S4 DNA提取：取沉淀物10g，加入20mL 65℃预热的裂解缓冲液和400μL的β-巯基乙醇，混合均匀，于70℃下保温50min；加入20mL体积比为25:24:1的酚-氯仿-异戊醇溶液，混合后，室温下离心分离获得上清液；

S5 DNA分离：向上清液中加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀，离心分离获得DNA沉淀；

S6 DNA洗涤：用体积浓度为75％的乙醇洗涤DNA沉淀，获得薄荷DNA，

裂解缓冲液的配比和配置同实施例1。

实施例4与实施例2不同的是：S2中不辅助超声波处理。

实施例5与实施例2不同的是：S2中超声波处理不间隔进行，而是持续超声12min。

实施例6与实施例2不同的是：S2中***：乙醇为1:1.2。

实施例7与实施例2不同的是：S2中***：乙醇为1:1.5。

薄荷DNA浓度和纯度的测定：采用常规方法，用UV-1810型紫外-可见分光光度计，分别测定薄荷DNA样品在260nm和280nm的吸光值OD260和OD280，DNA纯度计算公式如下：

检测数据列于表1。

表1 DNA纯度检测数据。

纯DNA的OD260/OD280≈1.8，OD260/OD280数值越接近1.8，DNA纯度越高。由表1中的检测结果可知，实施例1-3的OD260/OD280值更接近1.8，说明本发明的方法制备的薄荷DNA的纯度较高，浸泡和超声波处理有效提高了制备薄荷DNA的纯度。对比实施例2、5可以看出，超声波间隔处理的手段也能提高薄荷DNA的提取纯度。对比实施例6、7可以看出，***：乙醇的比值影响薄荷DNA的提取纯度，这是因为适宜的***：乙醇的比值能够提高挥发油的外逸和溶解，进而提高薄荷DNA的提取纯度。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。