阅读说明：本技术 一种基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子、制备方法及应用 (Ferrous ion fluorescent probe molecule based on dansyl acid structure, preparation method and application ) 是由 高光芹 谢普会 王志敏 周晶晶 申丽婕 党玉丽 苏惠 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子、制备方法及应用,其分子式为C<Sub>12</Sub>H<Sub>14</Sub>NO<Sub>4</Sub>S,简称为：FeP1。该探针通过商品化试剂丹磺酰氯一步反应制得,合成产率高,制备成本低。通过荧光光谱仪研究了探针FeP1在Tris-DMSO(4:1,pH=7.4,v/v)溶液中与金属离子、常见阴离子、活性硫、活性氧等小分子物质的识别特性。结果表明：探针FeP1对亚铁离子(Fe<Sup>2+</Sup>)具有高效专一的选择性,具有较强的抗干扰能力,识别速度快,酸碱度适用范围广,其最低检出限为18 nM,可以广泛应用于生物体系和环境样品中亚铁离子的检测。(The invention provides a dansyl acid structure-based ferrous ion fluorescent probe molecule, a preparation method and application thereof, wherein the molecular formula of the probe molecule is C 12 H 14 NO 4 S, abbreviated as: FeP 1. The probe is prepared by one-step reaction of a commercialized reagent dansyl chloride, and has high synthesis yield and low preparation cost. The recognition characteristics of the probe FeP1 with metal ions, common anions, active sulfur, active oxygen and other small molecular substances in a Tris-DMSO (4:1, pH =7.4, v/v) solution were studied by a fluorescence spectrometer. The results show that: probe FeP1 for ferrous ion (Fe) 2+ ) Has high-efficiency and specific selectivity, strong anti-interference capability, high identification speed and pH value application rangeThe kit has wide range, the lowest detection limit is 18 nM, and the kit can be widely applied to detection of ferrous ions in biological systems and environmental samples.)

一种基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子、制备方法及 应用

技术领域

本发明涉及金属离子荧光探针检测领域，具体涉及一种基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子、制备方法及应用。

背景技术

铁是生物体中不可或缺的一种金属元素，参与生物体的很多生理活动，例如细胞中氧气的传输、维持造血功能、很多辅酶的合成及DNA的合成等。铁是血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素的重要组成部分，参与维持生命体的新陈代谢过程，直接参与生命体内氧气的运输和储存。铁在生物体内必须保持在一定的浓度，否则就会对生物体的健康产生十分不利的影响。

在生物体内发挥调节作用的主要是活性铁，活性铁被认为是保持细胞内铁代谢平衡的重要因素。在大多数情况下，活性铁主要是以二价铁离子（Fe²⁺）的形式存在的。因此，对于研究生物体内和铁元素有关的生理过程，以及由铁浓度变化引起的一些病症，可以通过研究活性Fe²⁺的浓度来进行判别。通过检验亚铁离子的含量，可以实时反映细胞内铁元素的含量，能够及时发现生物体的异常情况。

目前常见的亚铁离子检测方法主要有电感耦合等离子体发射光谱、原子吸收和分光光度法。但是这些方法所需仪器昂贵，操作复杂，测定样品时预处理繁琐，并且不能应用于生物体内的金属离子进行实时、原位的检测。因此，开发新的简便的Fe²⁺的检测方法具有重要的意义。

有机荧光探针作为一种新兴的荧光分析技术，相对于传统的仪器检测方法（例如质谱法、电化学法以及色谱法等）除了具有简单方便、成本廉价、仪器操作简单、选择性高、灵敏度高等优点。目前报道的大多数是有关检测Fe³⁺的淬灭型和增强型的荧光探针，而对Fe²⁺检测报道的荧光探针却很少，就目前铁离子探针的发展情况而言，用于Fe²⁺高效识别的荧光探针的开发是充满挑战和机遇的。

发明内容

本发明提出了一种基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子、制备方法及应用，通过简单的一步反应制得，通过商品化间氯过氧苯甲酸对商品化的丹磺酰氯结构中氮原子进行氮氧化反应，碱性氧化铝中和反应产生的酸，从而得到基于丹磺酸的探针，该探针在Tris-DMSO溶液体系中可以用做Fe²⁺的高选择性荧光探针。

实现本发明的技术方案是：

一种基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子，分子式为C₁₂H₁₄NO₄S，简称为：FeP1，所述荧光探针结构式如下所示：。

反应结构式如下：

。

所述的基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子的制备方法，步骤如下：

（1）将间氯过氧苯甲酸溶解于无水二氯甲烷中，得到溶液A；

（2）将丹磺酰氯溶解于无水二氯甲烷中，得到溶液B，冰浴搅拌条件下，将溶液A缓慢滴加入溶液B，升温至室温反应一段时间，加入一定量的碱性氧化铝搅拌一段时间，减压去除溶剂，经硅胶柱层析分离得到产物FeP1，即荧光探针分子。

所述步骤（1）中间氯过氧苯甲酸与步骤（2）中丹磺酰氯的摩尔比为（1-5）：1，步骤（2）中室温反应时间为2-12h。

所述步骤（2）中丹磺酰氯与碱性氧化铝的摩尔比为1：（2-8），搅拌时间为1-4h。

所述步骤（2）中硅胶柱层析分离采用体积比为1:（4-15）的甲醇和二氯甲烷的洗脱液，产率为40-90%。

所述的基于丹磺酸结构的荧光探针分子在高灵敏、特异检测亚铁离子领域的应用。

本发明的有益效果是：

（1）本发明的荧光探针为基于丹磺酸的化合物，探针结构中由于氮氧化物的存在，在溶液中几乎没有荧光，当探针与亚铁离子发生特异性识别后，探针被还原为新的产物丹磺酸，探针结构中发生分子内电荷转移（ICT）效应，释放出较强的荧光，从而实现了对亚铁离子的荧光识别。通过高分辨质谱技术手段对上述反应机理进行了验证（如附图5所示），荧光探针FeP1识别亚铁离子后溶液的高分辨质谱测试结果为250.0543（[M-H⁺]^-），最终还原产物丹磺酸的负离子理论计算值为250.0543。该数据确证了附图4所示作用机理。

（2）本发明的荧光探针是通过商品化试剂丹磺酰氯和商品化的间氯过氧苯甲酸一步反应制得，合成产率高，制备成本低，具有广泛的实用性。

（3）本发明通过荧光光谱仪研究了探针FeP1在Tris-DMSO溶液中对相关分析物的识别性能，对亚铁离子具有专一的选择性，具有较强的抗金属阳离子和常见阴离子干扰性，对亚铁离子的最低检出限为18 nM。该测试结果表明探针FeP1具有应用于环境和生物体系中亚铁离子的检测的实用价值，在环境和生物体系检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的荧光探针FeP1核磁共振氢谱图。

图2为本发明的荧光探针FeP1核磁共振碳谱图。

图3为本发明的荧光探针FeP1高分辨质谱图。

图4 为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺的反应机理图。

图5 为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺的反应机理高分辨验证图。

图6为本发明的荧光探针FeP1对常见金属离子的荧光选择性图，激发波长350 nm。

图7为本发明的荧光探针FeP1对常见阴离子、活性硫、活性氧小分子的荧光选择性图，激发波长350 nm。

图8为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺对常见金属离子的抗干扰性图，激发波长350 nm，发射波长489 nm。

图9为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺对常见阴离子、活性硫、活性氧的抗干扰性图，激发波长350 nm，发射波长489 nm。

图10为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺的酸碱度适用范围图，激发波长350 nm，发射波长489 nm。

图11为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺的荧光滴定图，激发波长350 nm。

图12为本发明的荧光探针FeP1识别Fe²⁺的工作曲线图，激发波长350 nm，发射波长489 nm。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中制备荧光探针FeP1的过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属离子等均购自阿拉丁试剂公司。在荧光探针FeP1的表征和性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱。采用Thermo公司的Q-Exactive HR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。

实施例1

基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子的方法，步骤如下：

冰浴条件下，将间氯过氧苯甲酸（172 mg, 1 mmol）的10 mL无水二氯甲烷缓慢滴加入含有丹磺酰氯（269.5 mg, 1 mmol）的10 mL无水二氯甲烷溶液中，随后升至室温反应2小时，加入碱性氧化铝（204 mg, 2 mmol）搅拌1小时。旋干溶剂，柱层析分离，展开剂DCM/MeOH=4:1，得黄色产品107 mg，产率40%。

核磁氢谱¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ：4.15 (s, 6 H), 7.72 (m, 2 H),8.14 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 8.78 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 9.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 13.47 (s, 1 H); 核磁碳谱¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ：60.3, 119.9, 124.3,125.1, 125.7, 125.8, 127.2, 131.8, 132.8, 142.6, 146.1; 高分辨质谱HR-ESI-MScalcd for：C₁₂H₁₄NO₄S: 267.0565, found 268.0636 [M+H⁺]，(具体图谱参见附图1-3)。

实施例2

基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子的方法，步骤如下：

冰浴条件下，将间氯过氧苯甲酸（374 mg, 2 mmol）的15 mL无水二氯甲烷缓慢滴加入含有丹磺酰氯（269.5 mg, 1 mmol）的10 mL无水二氯甲烷溶液中，随后升至室温反应4小时，加入碱性氧化铝（204 mg, 2 mmol）搅拌2小时。旋干溶剂，柱层析分离，展开剂DCM/MeOH=5:1，得黄色产品133.5 mg，产率50%。

核磁氢谱¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ：4.15 (s, 6 H), 7.72 (m, 2 H),8.14 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 8.78 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 9.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 13.47 (s, 1 H); 核磁碳谱¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ：60.3, 119.9, 124.3,125.1, 125.7, 125.8, 127.2, 131.8, 132.8, 142.6, 146.1; 高分辨质谱HR-ESI-MScalcd for：C₁₂H₁₄NO₄S: 267.0565, found 268.0636 [M+H⁺]，(具体图谱参见附图1-3)。

实施例3

基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子的方法，步骤如下：

冰浴条件下，将间氯过氧苯甲酸（430 mg, 2.5 mmol）的15 mL无水二氯甲烷缓慢滴加入含有丹磺酰氯（269.5 mg, 1 mmol）的10 mL无水二氯甲烷溶液中，随后升至室温反应7小时，加入碱性氧化铝（306 mg, 3 mmol）搅拌2小时。旋干溶剂，柱层析分离，展开剂DCM/MeOH=6:1，得黄色产品174 mg，产率65%。

核磁氢谱¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ：4.15 (s, 6 H), 7.72 (m, 2 H),8.14 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 8.78 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 9.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 13.47 (s, 1 H); 核磁碳谱¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ：60.3, 119.9, 124.3,125.1, 125.7, 125.8, 127.2, 131.8, 132.8, 142.6, 146.1; 高分辨质谱HR-ESI-MScalcd for：C₁₂H₁₄NO₄S: 267.0565, found 268.0636 [M+H⁺]，(具体图谱参见附图1-3)。

实施例4

基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子的方法，步骤如下：

冰浴条件下，将间氯过氧苯甲酸（688 mg, 4 mmol）的20 mL无水二氯甲烷缓慢滴加入含有丹磺酰氯（269.5 mg, 1 mmol）的10 mL无水二氯甲烷溶液中，随后升至室温反应10小时，加入碱性氧化铝（408 mg, 4 mmol）搅拌3小时。旋干溶剂，柱层析分离，展开剂DCM/MeOH=10:1，得黄色产品214 mg，产率80%。

核磁氢谱¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ：4.15 (s, 6 H), 7.72 (m, 2 H),8.14 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 8.78 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 9.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 13.47 (s, 1 H); 核磁碳谱¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ：60.3, 119.9, 124.3,125.1, 125.7, 125.8, 127.2, 131.8, 132.8, 142.6, 146.1; 高分辨质谱HR-ESI-MScalcd for：C₁₂H₁₄NO₄S: 267.0565, found 268.0636 [M+H⁺]，(具体图谱参见附图1-3)。

实施例5

基于丹磺酸结构的亚铁离子荧光探针分子的方法，步骤如下：

冰浴条件下，将间氯过氧苯甲酸（860 mg, 5 mmol）的30 mL无水二氯甲烷缓慢滴加入含有丹磺酰氯（269.5 mg, 1 mmol）的10 mL无水二氯甲烷溶液中，随后升至室温反应12小时，加入碱性氧化铝（816 mg, 8 mmol）搅拌4小时。旋干溶剂，柱层析分离，展开剂DCM/MeOH=15:1，得黄色产品240.3 mg，产率90%。

核磁氢谱¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ ：4.15 (s, 6 H), 7.72 (m, 2 H),8.14 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 8.78 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 9.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 13.47 (s, 1 H); 核磁碳谱¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ：60.3, 119.9, 124.3,125.1, 125.7, 125.8, 127.2, 131.8, 132.8, 142.6, 146.1; 高分辨质谱HR-ESI-MScalcd for：C₁₂H₁₄NO₄S: 267.0565, found 268.0636 [M+H⁺].(具体图谱参见附图1-3)。

应用效果例

本发明采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧光光谱。

实施效果例1：荧光选择性实验

专一的选择性是考察荧光探针优异性的首要条件。

配制pH为7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为1 mM的探针FeP1溶液。采用荧光光谱仪考察了探针FeP1对亚铁离子的荧光选择性。在350 nm处荧光激发条件下，单独的探针FeP1 (10 µM)在Tris-DMSO (4:1, pH=7.4, v/v)溶液中在489处具有微弱的荧光发射强度，当加入10当量的亚铁离子后，在489 nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入10当量的其它物质 (常见金属阳离子和常见阴离子、活性硫、活性氧小分子物质) 时，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化（附图6和7）。以上实验结果表明，该探针对亚铁离子具有较好的专一选择性。

实施效果例2：荧光干扰性实验

为了测试探针分子对亚铁离子检测的抗干扰能力，在荧光发射光谱中分别测试了探针识别亚铁离子对金属阳离子和常见阴离子、活性硫、活性氧小分子物质的抗干扰性能力。配制pH为7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为1 mM的探针FeP1溶液。如附图8和9所示，在FeP1 (10 µM)的Tris-DMSO (4:1, pH=7.4, v/v)溶液中分别加入测试的10当量的各种金属阳离子和常见阴离子、活性硫、活性氧小分子物质测试其在489 nm处的荧光发射强度，然后再向含有上述各种小分子物质的溶液中加入100 µM的亚铁离子溶液，由附图8和9可知，在其他各种小分子物质存在时加入亚铁离子与单独加入亚铁离子时所得到的荧光发射强度(489 nm)基本相同，该结果表明探针FeP1对亚铁离子的检测具有较强的抗干扰能力。

实施效果例3：酸碱度（pH）对探针识别能力的影响

为了检验探针是否可以在不同的酸碱度（pH）条件下识别亚铁离子，探讨探针在实际样品中的应用，运用荧光光谱仪考察了探针FeP1在不同酸碱度（pH）对其识别亚铁离子的影响。分别配制pH为4，5，6，7，8，9浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为1mM的探针FeP1溶液。在Tris-DMSO (4:1, pH=7.4, v/v)溶液体系中，改变缓冲体系的pH值（4-9），单独探针(10 μL)的荧光发射强度(489 nm)变化不大，但是当加入10当量的亚铁离子的条件下，体系荧光发射强度(489 nm)在pH为4-7间具有较明显的增强（附图10），该结果表明探针FeP1可以应用于生理条件下识别检测亚铁离子。

实施效果例4：最低检出限实验

良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。

采用荧光光谱仪来测定其对亚铁离子的最低检出限。配制pH为7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，并用DMSO配制浓度为1 mM的探针FeP1溶液。在Tris-DMSO (4:1, pH=7.4, v/v)溶液中，固定探针FeP1的浓度为10 µM，测定其对不同浓度的Fe²⁺的响应强度，随着Fe²⁺浓度的增加，体系荧光强度不断增强（附图11），研究发现溶液荧光强度值在Fe²⁺浓度为0.1-1.1 µM间呈线性（R² = 0.983，附图12），经计算(3σ/k)得出该探针分子对Fe²⁺的检测限为18 nM，该测试结果表明探针FeP1具有应用于生物体系和环境中亚铁离子的检测的实用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。