阅读说明：本技术 交联血红蛋白的制备方法及包含该血红蛋白的器官灌注液 (preparation method of cross-linked hemoglobin and organ perfusate containing hemoglobin ) 是由 游可为 史国营 孙新宇 陈浩源 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种交联血红蛋白的制备方法,其包括如下步骤：a、稀释脱氧血红蛋白,加入到无氧反应器中；b、无氧反应器顶部设置雾化器,交联剂通过所述雾化器加入反应器中,发生交联反应；c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白。本发明制得的交联血红蛋白含有较低含量的大分子(大于500kD)和小分子(小于64KD),加入到器官灌注液中能够解决现行灌注液因缺少携氧剂而引起器官的酸中毒和溶酶体酶激活不良后果及再灌注时产生过量的自由基损伤细胞的现象,其制备、储存、运输及使用均十分简单方便。(The invention discloses a preparation method of cross-linked hemoglobin, which comprises the following steps: a. diluting the deoxyhemoglobin, and adding the diluted deoxyhemoglobin into an anaerobic reactor; b. an atomizer is arranged at the top of the anaerobic reactor, and a cross-linking agent is added into the reactor through the atomizer to perform a cross-linking reaction; c. adding a reducing agent to terminate the crosslinking reaction, and removing unreacted crosslinking agent and terminating the reducing agent by an ultrafiltration liquid exchange mode to obtain the crosslinked hemoglobin. The cross-linked hemoglobin prepared by the invention contains low-content macromolecules (more than 500kD) and small molecules (less than 64kD), can solve the problems of organ acidosis and lysosome enzyme activation badness caused by lack of oxygen carrying agent of the existing perfusate and the phenomenon of cell damage caused by excessive free radicals generated during reperfusion after being added into the organ perfusate, and is very simple and convenient in preparation, storage, transportation and use.)

交联血红蛋白的制备方法及包含该血红蛋白的器官灌注液

技术领域

本发明涉及医疗技术中器官保存技术领域，特别是涉及一种交联血红蛋白的制备方法，尤其还涉及包含该交联血红蛋白的器官灌注液。

背景技术

人类很多的疾病来自细胞、组织、器官坏死，从而导致功能丧失，引发人体残疾，甚至死亡，随着现代医学的发展，器官移植技术日趋成熟，单从手术角度来说：器官移植技术已很完美，换头手术都不是大问题。而事实上，器官移植目前仍面临种种困难，对离体器官的保存就是其中之一。器官移植必需移植活的器官，因此，供移植用的器官，从切离供者体内之时起直到其主要血管与受者血管接通期间，始终保持着完整的解剖结构和活性，是移植成功的一个前提。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞的得不到所必需的氧和养料，在常温(35-37度)下于短期内即会死亡。能耐受的时间是极短的，如心、肝仅10-15分钟，肾约在45-60分钟，若超过上述时限，移植后就很难恢复功能。在临床实际工作中，则要求常温下的缺血时间越短越好，最好不超过3-5分钟，最长不超过7-8分钟。根本不可能在如此短促的时间内完成移植手术。因此，必需设法使离体器官的活性能长时间维持。

为延长对离体器官的保存时间，科学家探讨了多种方法，其中，低温保存是现在较常用的一种方法，但其虽然可以有效延长器官的保存时间，可低温保存对细胞的损伤也很明显，正常情况下，细胞浸浴在高钠低钾的细胞外液内，细胞膜内的Na-K ATP酶(Na泵)细胞内外钠、钾比，钠、钾交换由氧化磷酸化供能。当代谢被抑制，Na泵得不到ATP供给，细胞内蛋白产生胶体渗透压致细胞水肿。细胞内蛋白质与非透过性阴离子产生渗透拉力大约110-140mOsm/kg。低温缺血、Na泵活性受到抑制时，细胞膜电位降低。继而Na和Cl因浓度梯度而进入细胞内，为维持半透膜内外侧水平衡，所以细胞内水聚积致使细胞水肿。

再者，采用灌注的方式延长离体器官的保存也是较为常用的方法，目前常用的灌注液有Krebs-Henseleit液、St ThomasⅡ液，UW液和Celsior液等，但这些灌注液都缺少携氧剂，使灌注的器官始终处理缺氧状态。体外灌注液若不能向离体器官有效供氧，组织和细胞就会因缺氧而增加无氧酵解，造成酸中毒和溶酶体酶激活不良后果。保证氧的供应、维持最低能量代谢和排除代谢废物是器官体外保存中亟待解决的问题。

同时，在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤,恢复血流加重保存器官损害的机理尚不完全明了,一般认为与氧自由基损害作用有关,正常情况下,ATP的代谢产物次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶(XOD)迅速地转变为嘌呤进而转变为中产物尿酸.然而,在缺氧严重的情况下,高能键很快耗尽,次黄嘌呤含量增加,XOD转变为一种能产生过氧化物的酶。同时，缺氧也使内源性抗氧化剂如过氧化物歧化酶(SOD)失活或耗尽，当血循环重建氧供突然增加就会产生过量的自由基损伤细胞。

所以，在器官灌注液中加入携氧剂显得尤为重要。红细胞是动物体内天然的氧载体，曾有人将其直接用于器官体外灌注保存。而红细胞容易发生破裂,膜内氨基磷脂、内毒素、血型糖蛋白和胞内酶的外渗都可能损伤血管内皮及心肌细胞并造成毛细血管阻塞。

采用无基质血红蛋白代替红细胞是一条新思路。但是，脱离了红细胞后的血红蛋白是有肾毒性的蛋白，必须经过交联变为合适的分子量的蛋白才可以临床应用，交联血红蛋白有PEG、戊二醛、棉子糖、双阿司匹林等方法，其中戊二醛凭其与蛋白质反应具有活性高、反应快、给合量高、交联性能好，且交联产物性质稳定并可保持蛋白质的精细结构，对酶的活性影响小的特点，成为血红蛋白交联常选择的方法。但戊二醛交联也有其明显的缺点，一是交联反应无特异性，因为血红蛋白表面约有40个赖氨酸侧链氨基以及四个链端氨基可以参与反应，反应较难控制，终产品的分子量分布从32kD到1000kD以上，致使终产品是非均一性的混合物。分子量的控制一直是戊二醛交联血红蛋白的一个难点，过低的分子量稳定性差，容易离解造成肾毒性，而且携氧效率低；过高的分子量会使血液黏度增加，不利于血液的流动，而且会沉积在血管内壁及肝或脾中。体外实验表明要尽量降低未聚合的二聚体的含量，降低大于500kD大分子聚合的含量，已获得安全性和有效性高的产品。同时，使该交联的血红蛋白能够替代红细胞用于器官体外灌注保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种交联血红蛋白的制备方法，该方法制得的交联血红蛋白含有较低含量的大分子(大于500kD)和小分子(小于64KD)，将该交联血红蛋白加入到器官灌注液中能够解决现行灌注液因缺少携氧剂而引起器官的酸中毒和溶酶体酶激活不良后果及再灌注时产生过量的自由基损伤细胞的现象，其制备、储存、运输及使用均十分简单方便。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：

a、稀释脱氧血红蛋白，加入无氧反应器中；

b、所述无氧反应器顶部设置雾化器，交联剂通过所述雾化器加入反应器中，发生交联反应；

c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白。其中还原剂可以为硼氢化钠，超滤是使用10Kd-100kD的膜包或中空纤维柱通过切向流的方式纯化交联的血红蛋白。

上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤a中，稀释脱氧血红蛋白浓度到1-3g/dl，在所述血红蛋白中加入巯基化合物，使溶液中血红蛋白与巯基化合物的质量比为5-10:1。

上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤a中，所述巯基化合物为巯基乙胺、谷胱甘肽或N-乙酰-L-半胱氨酸。

上述交联血红蛋白的制备方法，其中，其中，所述步骤b中，所述交联剂的添加速度为50-500ml/min。

上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤b中，所述反应器的压力为1.05-1.25bar。

上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述反应器中加入的血红蛋白与交联剂的质量比为1000:29-45。

本发明还提供了一种器官灌注液，该器官灌注液包括上述制备方法制得的交联血红蛋白。

上述器官灌注液，其中，所述器官灌注液还包括维生素K1和前列环素。

上述器官灌注液，其中，所述器官灌注液包括：

上述各成分含量指在1000ml所述器官灌注液中的含量。

本发明还提供了一种器官灌注液的制备方法，其包括如下步骤：

a、按配方比例加入人白蛋白、肝素、8.4％碳酸氢钠、10％葡萄糖酸钙、万古霉素、庆大霉素、10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、维生素K1，蒸馏水定量，过滤除菌，无菌灌装，封口，得到溶液Ⅰ；

b、将权利要求1-6中任一项制备方法制得的交联血红蛋白溶液经脱氧、过滤除菌、无菌无氧灌装、热塑封口得到溶液Ⅱ；

c、按配方比例提供单独包装的前列环素，得到溶液Ⅲ；

d、将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ按比例混匀，配合溶液Ⅲ输注，得到器官灌注液。

本发明的交联血红蛋白的制备方法具有如下有益效果：

1、本发明的交联血红蛋白的制备方法，采用雾化器加入交联剂，显著改善了交联过程，降低了交联血红蛋白中大分子和小分子的含量，使交联血红蛋白中的分子量小于64KD的小分子含量小于5％，分子量大于500KD的大分子含量小于10％，不再需要对交联血红蛋白做进一步的分子量分离纯化，降低了工艺的复杂度，节约了成本，提高了收率，同时提高了聚合效果，使其更易放大，明显提升了交联剂的加入速度，交联剂的加入速度可以达到500ml/min，大大缩短了交联时间，节约了生产成本；

2、本发明的交联血红蛋白的制备方法，通过在交联之前加入巯基化合物，进一步降低了高分子量和低分子量血红蛋白的含量，降低了由低分子量蛋白引起的肾毒性和血管收缩的风险和高分子量蛋白引起的血液黏度增加，不利于血液的流动，而且会沉积在血管内壁及肝或脾中的风险；

3、本发明的交联血红蛋白的制备方法，通过提高反应器的压力，进一步降低了交联血红蛋白中大分子和小分子的含量；

4、将本发明制备的交联血红蛋白加入器官灌注液中，解决了离体器官因缺氧而造成的酸中毒和溶酶体酶激活不良后果及在灌注时产生过量的自由基损伤细胞的问题；

5、本发明的器官灌注液中加入凝血剂维生素K1和血管扩张剂前列环素，更好的提高了灌注时交联血红蛋白的有效性和安全性；

6、本发明制得的器官灌注液，通过对灌注液的脱氧和无氧条件灌装及采用低透氧率的药袋灌装的措施，很好的解决了血红蛋白因长期保存被氧化的问题；

7、本发明制得的器官灌注液，在保存1年后对所含的交联血红蛋白进行活性检测，其氧合血红蛋白和高铁血红蛋白的含量都不高于5％，均在合格范围内。

附图说明

图1为本发明交联血红蛋白制备流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明。

一制备交联血红蛋白

实施例1

如图1所示，稀释脱氧的血红蛋白到2g/dl，加入到无氧反应器12内，其液面10高度不超过反应器12高度的一半，在反应器12顶部固定雾化器1，在雾化器1上接入进液管2与进气管3，在反应器12顶部设置平衡气管4，以调整反应器12内的压力，封闭反应器12，开启底部搅拌转子11，通过水浴夹套13加热反应液到42℃，打开进液管阀门5，加入交联剂戊二醛，调整进液速度为260ml/min，打开进气管阀8，通入惰性气体，优选高纯氮气，调整气体流量使交联剂雾粒与反应液面10充分接触，提高反应效率，调控平衡气管4上的排气阀6，使反应器12的压力平衡在1.15bar，按血红蛋白与戊二醛的质量比为1000:37的比例加入交联剂，直至结束，用硼氢化钠终止，30kD超滤换液纯化，得到交联血红蛋白。

用Thermo的HPLC(ULTMATE3000)进行分子量分布分析，用的分子筛柱为AgilentAdvance BioSEC2.7um,7.8×300mm；所用流动相为：750mM氯化镁、50mM Tris、0.1mM EDTA，取上述交联的血红蛋白制备样品进行上样，每针上样交联血红蛋白20ug，其结果为：MW>500Kd(<10％)含量7.2％，MW<64kD(<5％)的含量为4.6％，制得的交联血红蛋白分子量分布见表1。

实施例2

与实施例1的制备方法相同，不同之处在于加入交联剂之前，向稀释的脱氧血红蛋白溶液中加入N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，加入的NAC的终浓度为3mg/ml，血红蛋白与NAC的质量比为20：3，制得的交联血红蛋白分子量分布见表1。

实施例3

与实施例1的制备方法相同，不同之处在于加入交联剂之前，向稀释的脱氧血红蛋白溶液中加入谷胱甘肽，加入的谷胱甘肽的终浓度为3mg/ml，制得的交联血红蛋白分子量分布见表1。

实施例4

与实施例1的制备方法相同，不同之处在于加入交联剂之前，向稀释的脱氧血红蛋白溶液中加入巯基乙胺，加入的巯基乙胺的终浓度为3mg/ml，制得的交联血红蛋白分子量分布见表1。

表1

通过表1可知，在戊二醛交联时，加入巯基化合物，可以显著提高血红蛋白分子间交联，其机理可能是巯基化合物抑制了血红蛋白二硫键的形成，使其均匀的分布在溶液中，有利于均一分子量的蛋白形成，降低了未聚合小分子量血红蛋白的残留，降低了大分子量血红蛋白聚合物的形成，加入的巯基化合物优先选择N-乙酰-L-半胱氨酸。

实施例5-6和对比例1

与实施例2的制备方法相同，不同之处在于溶液中血红蛋白与NAC浓度和质量比不同，制得的交联血红蛋白分子量分布见表2。

表2

通过表2可知，在加入戊二醛交联前，加入不同浓度NAC对交联度的影响是有差异的，在血红蛋白：NAC质量比为5-10:1的范围内效果较好，加入的巯基化合物浓度过低时，交联的血红蛋白中小分子含量过高，超过了5％。

对比例2

与实施例2的制备方法相同，不同之处在于交联剂戊二醛的添加方式为滴加。

对比例3

与实施例2的制备方法相同，不同之处在于对比例3为在反应系统的循环管路中放置静态混合器，在静态混合器处设置分支管路加入交联剂，使血红蛋白和交联剂在静态混合器处充分混合，交联剂加入速度为100ml/min，制得的交联血红蛋白分子量分布见表3。

对比例4

与对比例3的制备方法相同，不同之处在于交联剂加入速度为150ml/min，制得的交联血红蛋白分子量分布见表3。

表3

通过表3可知，在戊二醛交联时，本发明采用雾化的方式加入交联剂，可以显著提高血红蛋白分子间交联，降低未聚合小分子量血红蛋白的含量和大分子量血红蛋白聚合物的形成。在对比例3和对比例4中采用了静态混合器的加入方式，加入速度在达到150ml/min时，交联血红蛋白中小分子量血红蛋白的含量超过了5％，不符合分子量的分布要求，而实施例2中的加入速度可以达到260ml/min，制得的交联血红蛋白中的大分子量血红蛋白含量和小分子量血红蛋白含量均明显低于对比例3和对比例4。因此，本发明采用雾化的加入方式加入交联剂，同现有技术中在循环管路中放置静态混合器的加入方式相比，液液接触面积更大，聚合效果更好，显著降低了交联的血红蛋白中大分子的含量，并且交联剂的加入速度更快，更容易放大，聚合速度可以更快，能够明显节约生产成本。

实施例7-实施例9

与实施例2的制备方法相同，不同之处在于反应器内的压力不同，制得的交联血红蛋白分子量分布见表4。

表4

通过表4可知，在戊二醛交联时，密闭反应器内保持一定的压力有利于雾粒与液面的接触面积的增加，提高了反应的速率和均匀性，但较高的压力会增加反应器加工的难度，提高原料成本，增加生产成本，本发明中优选压力为1.05-1.25bar。

实施例10-12和对比例5

与实施例2的制备方法相同，不同之处在于交联剂戊二醛的加入速度不同，制得的交联血红蛋白分子量分布见表5。

表5

通过表5可知，在戊二醛交联时，在对比例5中交联剂加入速度为800ml/min时，制得的交联血红蛋白中小分子量的含量超过了5％，交联剂加入速度为50-500ml/min时，均可获得符合分子量要求的交联血红蛋白。如果交联剂的加入速度低于50ml/min，会延长生产时间，提高了生产成本，不建议再降低。采用本发明的方法，交联剂的加入速度达到500ml/min，仍然可以制得小分子含量低于5％的交联血红蛋白，符合分子量分布的质量标准，提高了生产效率。

实施例14

稀释脱氧的血红蛋白到3g/dl，加入NAC，使NAC终浓度为3mg/ml，将混合溶液加入到无氧反应器12内，其液面10高度不超过反应器12高度的一半，在反应器12顶部固定雾化器1，在雾化器1上接入进液管2与进气管3，在反应器12顶部设置平衡气管4，以调整反应器12内的压力，封闭反应器12，开启底部搅拌转子11，通过水浴夹套13加热反应液到42℃，打开进液管阀门5，加入交联剂戊二醛，调整进液速度为500ml/min，打开进气管阀8，通入惰性气体，优选高纯氮气，调整气体流量使交联剂雾粒与反应液面10充分接触，提高反应效率，调控平衡气管4上的排气阀6，使反应器12的压力平衡在1.25bar，按血红蛋白与戊二醛的质量比为1000:45的比例加入交联剂，直至结束，用硼氢化钠终止，30kD超滤换液纯化，得到交联血红蛋白。

用Thermo的HPLC(ULTMATE3000)进行分子量分布分析，用的分子筛柱为AgilentAdvance BioSEC2.7um,7.8×300mm；所用流动相为：750mM氯化镁、50mM Tris、0.1mM EDTA，取上述交联的血红蛋白制备样品进行上样，每针上样交联血红蛋白20ug，其结果为：MW>500Kd(<10％)含量为6.5％，MW<64kD(<5％)的含量为2.4％，符合分子量分布的质量标准。

实施例15

稀释脱氧的血红蛋白到1g/dl，加入NAC，使NAC终浓度为1mg/ml，将混合溶液加入到无氧反应器12内，其液面10高度不超过反应器12高度的一半，在反应器12顶部固定雾化器1，在雾化器1上接入进液管2与进气管3，在反应器12顶部设置平衡气管4，以调整反应器12内的压力，封闭反应器12，开启底部搅拌转子11，通过水浴夹套13加热反应液到40℃，打开进液管阀门5，加入交联剂戊二醛，调整进液速度为50ml/min，打开进气管阀8，通入惰性气体，优选高纯氮气，调整气体流量使交联剂雾粒与反应液面10充分接触，提高反应效率，调控平衡气管4上的排气阀6，使反应器12的压力平衡在1.05bar，按血红蛋白与戊二醛的质量比为1000:29的比例加入交联剂，直至结束，用硼氢化钠终止，30kD超滤换液纯化，得到交联血红蛋白。

用Thermo的HPLC(ULTMATE3000)进行分子量分布分析，用的分子筛柱为AgilentAdvance BioSEC2.7um,7.8×300mm；所用流动相为：750mM氯化镁、50mM Tris、0.1mM EDTA，取上述交联的血红蛋白制备样品进行上样，每针上样交联血红蛋白20ug，其结果为：MW>500Kd(<10％)含量为2.7％，MW<64kD(<5％)的含量为4.8％，符合分子量分布的质量标准。

二、制备器官灌注液

实施例16

1、按每1000ml器官灌注液的配制比例称量溶液I各组分：

按配方比例加入人白蛋白、肝素、8.4％碳酸氢钠、10％葡萄糖酸钙、万古霉素、庆大霉素、10％复方氨基酸注射液、施尼维他复合维生素制剂(即注射用12种复合维生素)、维生素K1，蒸馏水定量，过滤除菌，无菌灌装，封口，得到的溶液定义为Ⅰ液；

2、按每1000ml器官灌注液的配制比例称量溶液Ⅱ组分：

取实施例2制得的交联血红蛋白30g

灭菌灌装的分配系统，在无菌无氧的环境下完成灌装，灌装的药袋要求无菌，隔氧率要小于0.008cc/m²/24hrs，灌装前，通过多次通抽惰性气体的方式置换药袋中残留的空气，灌装含30g交联血红蛋白的溶液后，用热塑的方式封口，即得溶液Ⅱ；

3、按每1000ml器官灌注液的配比提供溶液Ⅲ组分：

按配方比例提供单独包装的前列环素(2ug/ml)16ml，使用时单独连续输注，输注速度为4ml/hr；

用之前将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ按比例混匀，配合溶液Ⅲ灌注，即得到器官灌注液。

将本实施例制得器官灌注液保存一年后，对所含的交联血红蛋白进行活性检测，检测结果见表6，高铁血红蛋白和氧合血红蛋白均小于5％，符合质量要求。

表6

实施例17

1、按每1000ml器官灌注液的配制比例称量溶液Ⅰ各组分：

按配方比例加入人白蛋白、肝素、8.4％碳酸氢钠、10％葡萄糖酸钙、万古霉素、庆大霉素、10％复方氨基酸注射液、施尼维他复合维生素制剂、维生素K1，蒸馏水定量，过滤除菌，无菌灌装，封口，得到溶液Ⅰ；

2、按每1000ml器官灌注液的配制比例称量溶液Ⅱ组分：

取实施例2制备的交联血红蛋白50g

灭菌灌装用到的分配系统，在无菌无氧的环境下完成灌装，灌装的药袋要求无菌，隔氧率要小于0.008cc/m2/24hrs，灌装前，通过多次通抽惰性气体的方式置换药袋中残留的空气，灌装含50g交联血红蛋白的溶液后，用热塑的方式封口，即得溶液Ⅱ；

3、按每1000ml器官灌注液的配比提供溶液Ⅲ：

按配方比例提供单独包装的前列环素(2ug/ml)32ml，使用时单独连续输注，输注速度为6ml/hr；

用之前将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ按比例混匀，配合溶液Ⅲ灌注，得到器官灌注液。

实施例18

1、按每1000ml器官灌注液的配制比例称量溶液Ⅰ各组分：

按配方比例加入人白蛋白、肝素、8.4％碳酸氢钠、10％葡萄糖酸钙、万古霉素、庆大霉素、10％复方氨基酸注射液、施尼维他复合维生素制剂、维生素K1，蒸馏水定量，过滤除菌，无菌灌装，封口，得到溶液Ⅰ；

2、按每1000ml器官灌注液的配制比例称量溶液Ⅱ组分：

取实施例1制得的交联血红蛋白10g

灭菌灌装用到的分配系统，在无菌无氧的环境下完成灌装，灌装的药袋要求无菌，隔氧率要小于0.008cc/m²/24hrs，灌装前，通过多次通抽惰性气体的方式置换药袋中残留的空气，灌装含10g交联血红蛋白的溶液后，用热塑的方式封口，即得溶液Ⅱ；

3、按每1000ml器官灌注液的配比提供溶液Ⅲ组分：

按配方比例提供单独包装的前列环素(2ug/ml)8ml，使用时单独连续输注，输注速度为2ml/hr；

用之前将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ按比例混匀，配合溶液Ⅲ灌注，即得到器官灌注液。

三、犬肾离体灌注安全性和有效性的研究

在对犬麻醉诱导后，迅速打开腹腔，切取双肾，用实施例16制备的器官灌注液灌注离体肾，进行器官灌注液的安全性和有效性研究。

1、对实施例2制得的交联血红蛋白进行荧光染料标记

在配制实施例16的器官灌注液前，首先对实施例2制得的交联血红蛋白进行荧光染料标记，首选是异硫氰酸荧光素标记，通过对Wilderspin在Anal.biochem.,132:449(1982)和Anal.Biochem.,215:17-23(1993)中描述的方法进行改进，用异硫氰酸荧光素(下称为“FITC”)标记交联血红蛋白溶液中的血红蛋白。通过将6.6g FITC溶解在615mL的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.5)中来制备FITC标记的储备溶液。取实施例2制得的交联血红蛋白溶液1850ml，在室温氮气环境中连续搅拌反应2小时。通过30kD薄膜渗滤去除残余的FITC，与乳酸储存溶液(pH7.7)进行七倍体积交换，之后浓缩。

2、安全性和有效性的研究

将上述标记后的交联血红蛋白按实施例16中器官灌注液的制备方法，制备得到器官灌注液，进行肾脏的灌注。72小时后，用PBS缓冲液多次冲洗，以洗掉组织中的血红蛋白。取0.5x0.5x0.1cm³肾组织按常规脱水、浸蜡、切片，做HE染色，进行光镜观察，通过组织形态的变化判断组织的活性变化，同时用荧光显微镜观察组织中是否黏附有血红蛋白，肾包膜是否有血红蛋白渗出；取1cm³肾皮质组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以进一步观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。

荧光显微镜结果显示，灌注冲洗后的组织中没有发现黏附的血红蛋白，肾包膜也没观察到渗出的血红蛋白；光镜结果显示灌注72小时后，肾组织结构改变轻微，低倍镜下可见清晰的肾小管及肾小球。高倍镜下肾小球轮廓清晰，大小基本一致。除少量肾近曲小管轻度着肿外，大部分结构正常；电镜结果显示灌注72小时后，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清。总之，没有发现血红蛋白的组织黏附和渗出，72小时的灌注器官活性保持基本正常，说明此灌注液是安全有效的。