具体实施方式

实施例1具有抗菌和抗病毒双重活性猪血红蛋白β链C端片段的确定

以猪血红蛋白β链为模板，从N-端到C-端逐步分解成大小为15-17个氨基酸的片段，两个相连的片段有5个氨基酸重叠，共设计14个多肽片段，设计意图见图1。委托常州市祥泰生物科技有限公司采用自动化多肽合成设备高效快速地合成所设计的14个多肽片段，记为片段1～片段14。见表1。

表1 14个多肽片段的序列

1.1根据用细胞病变抑制法测定多肽片段的抗病毒活性

采用PEDV/Vero系统检测多肽片段的生物活性，按常规传代细胞培养方法消化的Vero细胞悬液，用DMEM培养基（10%胎牛血清）稀释至每毫升含30万个细胞，加入96孔细胞培养板内，每孔0.1ml，置37℃、含5% CO₂培养箱内，静置培养24小时。将长成良好单层的细胞孔，弃去培养液，用DMEM培养基（10%胎牛血清）将每个含有数量为10¹⁰个多肽片段样品溶于1mL无菌水中，再进行10倍系列稀释，稀释10¹～10⁸倍，得到8个不同稀释度的多肽，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，置37℃、含5％CO₂培养箱内，培养18～24小时后，再接种病毒。每次试验均设不同多肽片段对照组、细胞对照组及病毒对照组。将PEDV用DMEM液(含胰蛋白酶20µg/ml)稀释至1000TCID50/ml，加入培养板各孔内，每孔0.1ml。置37℃、含5% CO₂培养箱内培养30h。

结果判定：(1)弃掉96孔板中营养液，使用PBS洗涤3次；(2)将4%多聚甲固定液滴加入每孔中，4℃下固定30min；(3)弃去固定液，使用PBS洗涤3次。每孔加入0.25% Tritonx-100 100µl静置15min，对细胞进行通透，协助染色；(4)每孔加入100 µL配制的5% BSA液封闭1h；(5)使用PBS洗涤3次，每次5min；(6)加入100 µL小鼠抗PEDV的单克隆抗体（稀释比1:1000），于37℃孵育1h；(7)使用PBS洗涤3次，每次静置2min。每孔加入100 µL稀释好的AlexaFluoro8488标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗（1:1000），于37℃解育1h；(8)使用PBS洗涤3次，每次5min；(9)使用倒置荧光显微镜进行观察。

结果计算：按Reed-Muench法计算结果，多肽片段单位以log₁₀表示。能保护半数细胞免受攻击病毒破坏的多肽片段最高稀释度的倒数，即为多肽片段效价。见表2和图2。

结果表明片段13的抗病毒效价最高，片段12和片段14次之。

表2 14个多肽片段的抗病毒活性

1.2抑菌圈试验测定多肽片段的抑菌活性

在超净工作台内，取100mL无菌的药敏试验检测培养基，加入100uL检测菌菌液，所述检测菌为大肠杆菌，摇匀，得到含菌检测培养基；吸取混合均匀的含菌检测培养基10mL，在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在超净工作台上使其凝固。

待含菌检测培养基凝固后用灭菌的打孔器打孔，孔径为2.7mm，在培养皿底部上均匀的打七个上样孔，将上样孔内的含菌检测培养基挑出，用记号笔在培养皿底部为七个上样孔做好标记，包括一个阴性对照上样孔、一个阳性抗生素对照上样孔和多肽片段待测样品上样孔。阴性对照上样孔内放置无菌水，阳性抗生素对照上样孔内放置阳性抗生素，待测样品上样孔内分别放置不同的待测多肽样品，用微量移液器分别吸取5uL 1 mg/mL待测样品加入各自对应的上样孔中，并将培养皿置于37℃培养箱中培养16~18 h。用游标卡尺测定抑菌圈直径，计算抑菌效价。由阳性抗生素抑菌圈为标准计算出样品的效价。

结果表明片段13的抑菌活性最高，片段14和片段12次之。表3和图3。

表3 14个多肽片段的抑菌活性

1.3猪血红蛋白β链C端片段的抗病毒活性和抗细菌活性

将片段12、片段13和片段14进行串联，形成猪血红蛋白β链C端片段IVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAGVANALAHKYH，并托常州市祥泰生物科技有限公司采用自动化多肽合成设备高效快速地合成猪血红蛋白β链C端片段，按照1.1和1.2的方法进行验证猪血红蛋白β链C端片段的抗病毒活性（8.16*10⁴）U/ml和抗细菌活性（13.47±0.67）mm。结果表明：猪血红蛋白β链C端片段的抗病毒和抑菌活性均高于片段12、片段13和片段14。

实施例2 猪血红蛋白β链C端片段在枯草芽孢杆菌中的高效表达

2.1 pHT01-P43-HBB表达载体的构建

分别按酶切位点BamH I核酸人工序列（序列1）、枯草芽孢杆菌P43组成型启动子核酸人工序列（序列2）、猪血红蛋白β链C端片段核酸人工序列[简称：HBB] （序列3）、酶切位点Sma I核酸人工序列（序列4）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框（序列5）并插入枯草芽孢杆菌表达载体pHT01上，得到pHT01-P43-HBB重组载体，见图4。

上述序列1、2、3、4是依次串联。

2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备

挑取新鲜的LB固体培养基(添加新霉素抗性)表面的B.subtilis WB800n单菌落，接种于5 mL的LB培养基中，37℃、200 r/min培养过夜；取500μL上述菌液转接到50 mL GM增殖培养基中，37 ℃、200r /min培养至OD600=1.0；将菌液转移至已灭过菌的100 mL离心管，冰水浴10 min后，5000 r /min、4 ℃离心10 min，收集菌体；用预冷的电转缓冲液ETM洗涤3～4次，将洗涤后的菌体重悬于500 μL的ETM中，即为枯草芽孢杆菌电转化感受态细胞。

LB培养基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.0；

LB固体培养基：在LB培养基中加入质量浓度20 g/L琼脂粉；

ETM电转缓冲液：山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.5 mol/L、海藻糖0.5 mol/L、甘油体积分数10%。

2.3 构建表达猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌重组菌

取出3管新制60μL的枯草芽孢杆菌B.subtilis W800n感受态细胞，分别加入6μL的质粒pHT01-P43-HBB混合均匀，预冷5 min后将混合的菌液加入2 mm的冰中预冷电转杯中，用Eppendorf电转仪在2000 V、5 ms条件下电击1次。电转完毕后，迅速加入1 mL RM复苏培养基，37℃、200 r/min复苏4 h后，离心重悬后涂布在含氯霉素(40 μg/mL)固体LB培养基，放在37 ℃恒温培养箱中倒置培养1～2 d，筛选抗氯霉素的菌株。

挑取上述抗氯霉素菌株的单菌落作为模板，分别通过上下游引物来进行PCR扩增，扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，见图5，最终获得表达猪血红蛋白β链C端片段的枯草芽孢杆菌重组菌株。

RM复苏培养基：NaCl 10g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.38 mol/L。

PCR反应体系：dNTP Mixture（2.5mM）4 ul、10×LA PCR Buffer II（Mg2+Plus）2.5ul、F primer （CGCGGATCCGCGTGTCGACGT ）10μmol/L、R primer（TTAGTGGTACTTGTGGGCCAG）10μmol/L、变性液 1ul、TaKaRa LA Taq （5U/ul）0.25ul、dH₂Oup to 25 ul。

PCR反应条件：94℃ 1 min 1 cycle、98℃ 10 sec、55℃30 sec 72℃ 1.5 min30cycles。取10 µL 进行1%琼脂糖凝胶电泳。出现555bp的条带为阳性转化子。

实施案例3 生产猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌重组菌的高密度发酵

生产猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌重组菌株在含有30µg/mL氯霉素抗性的LB平板上划线培养后，选取单个菌落，接种至含250mL LB液体培养基的1L三角瓶中，于摇床中在37℃、200rpm 的条件下培养，培养至OD600=0.6～0.8；镜检无染菌后，作为一级种子备用。将4瓶一级种子液共1L接入已灭菌的100L发酵培养基，发酵过程中，温度维持37 ℃，pH值维持在8.0，(pH值通过滴加10%的氨水来维持)，并且通过对通风量与搅拌速率的控制使溶氧(dissolved oxygen，DO)维持在20%～40%。发酵时间为32h。

发酵培养基：胰蛋白胨12 g/L、酵母浸粉24 g/L、蔗糖12g/L、KH₂PO₄ 6.5 mmol/L、K₂HPO₄ 27mmol/L。

表4连续3批本发明发酵液中猪血红蛋白β链C端片段的浓度SDS-PAGE检测结果(mg/L)

表5连续3批本发明发酵液上清抗病毒和抑菌检测结果(mg/L)

实施案例4含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂的制备

将上述发酵液利用压缩空气将发酵罐压力调节至0.05MPa左右，储料罐压力为零，利用发酵罐与储料罐之间的压力差通过不锈钢物料管道将发酵液压到储料罐中，加入20%麦芽糊精作为赋形剂，不同比例聚乙二醇20000（0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.5%）作为保护剂进行喷雾干燥，采用喷雾干燥机进行喷雾干燥（无锡市能达干燥设备有限公司生产），喷雾干燥条件如下：进口温度为135℃，出口温度为75℃，喷液速度为250L /h。结果表明选用0.75%的聚乙二醇20000作为保护剂，可有效保证猪血红蛋白β链C端片段的抑菌和抗菌效价，抗病毒活性的保持率为99.52±0.23%，抑菌活性保持率为98.04±1.14%；见表6。

表6添加不同比例聚乙二醇20000对猪血红蛋白β链C端片段的抑菌和抗菌效价的影响（%）

实施例5含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪病毒性腹泻治疗效果

将30头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组10头，第1组为试验组，即含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组；第2组为对照组，即未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组；第3组为空白对照组，即未进行治疗组。各组仔猪注射器灌服2 mL PED病毒液(病毒浓度为1×10⁶ TCID50 /mL)，一天2次。当仔猪开始出现腹泻症状时，试验组仔猪灌服含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂，每次用量0.5g，用生理盐水稀释成4mL，每天2次；对照组仔猪灌服同等剂量重组未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂，每天2次；空白对照组仔猪灌服同等剂量生理盐水4mL。持续治疗7天，观察治疗效果。统计发病及死亡情况。

结果表明：试验组在猪灌服含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂后80%猪腹泻症状逐渐减轻，且7 d后恢复正常；灌服未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗对照组和未采取治疗措施的空白对照组则全部死亡，痊愈数为0%，死亡率为100 %，结果见表7。

表7含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪病毒性腹泻治疗效果

实施案例6含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪细菌性腹泻治疗效果

取30头15kg的健康断奶仔猪进行人工感染F18大肠杆菌，口服剂量为6×10⁹CFU，出现腹泻时，随机分为3组，每组10头第1组为试验组，即含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组，每次用量0.5g，用生理盐水稀释成4mL，每天2次；第2组为对照组，即未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗组，每次用量0.5g，用生理盐水稀释成4mL，每天2次；第3组为空白对照组，即未进行治疗组，为同等剂量生理盐水4mL，每天2次。持续治疗7天，观察治疗效果。统计发病及死亡情况。

结果表明：试验组在猪灌服含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂后腹泻症状逐渐减轻，3～4d后全部恢复正常；灌服未重组枯草芽孢杆菌喷干粉剂治疗对照组和未采取治疗措施的空白对照组腹泻均未好转，痊愈数也为0%，但死亡率为30%左右，结果见表8。

表8含有猪血红蛋白β链C端片段枯草芽孢杆菌喷干粉剂对猪细菌性腹泻治疗效果

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序列表

<110> 山东仙普爱瑞科技股份有限公司

<120> 一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌、制剂以及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

cgcggatccg cg 12

<210> 2

<211> 426

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

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<210> 3

<211> 117

<212> DNA

<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)

<400> 3

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<210> 4

<211> 12

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<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

tcccccgggg ga 12

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)

<400> 6

Ile Val Val Val Leu Ala Arg Arg Leu Gly His Asp Phe Asn Pro Asn

1 5 10 15

Val Gln Ala Ala Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu

20 25 30

Ala His Lys Tyr His

35