一种具有生物活力的人工合成材料及其农业应用
阅读说明：本技术 一种具有生物活力的人工合成材料及其农业应用 (Artificially synthesized material with biological activity and agricultural application thereof ) 是由 林敏� 柯秀彬 燕永亮 王劲 战嵛华 周正富 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种应用于农业的具有生物活力的人工合成材料,含有本发明设计合成的人工亲水蛋白、人工血红蛋白以及聚羟基脂肪酸酯(PHA)。所述材料可用于制备微米级活性人工微囊,包裹具有固氮、解磷解钾、抗病虫和促生等特性的农用微生物优良菌株形成新型菌肥,还可用于制备新型农作物种子活性包衣剂等农业领域。所述材料具有保持菌体活力、定向结合根表和施肥精准高效等独特性能,适用于机械化播种、水肥一体化滴灌和无土栽培等现代农业生产方式。(The invention provides an artificial synthetic material with biological activity for agriculture, which contains artificial hydrophilic protein, artificial hemoglobin and Polyhydroxyalkanoate (PHA) designed and synthesized by the invention. The material can be used for preparing micron-sized active artificial microcapsules, wrapping agricultural microbial excellent strains with the characteristics of nitrogen fixation, phosphate and potassium dissolution, disease and insect resistance, growth promotion and the like to form novel bacterial fertilizers, and can also be used for preparing agricultural fields such as novel crop seed active coating agents and the like. The material has the unique properties of keeping the activity of thalli, directionally combining with a root table, applying fertilizer accurately and efficiently and the like, and is suitable for modern agricultural production modes such as mechanized sowing, water and fertilizer integrated drip irrigation, soilless culture and the like.)
技术领域
：本发明涉及一种具有生物活力的人工合成材料及其在农业中的应用。
背景技术
：理想的农用微生物制品(制剂)应该具有可塑性、可降解性、保水性、根表亲和性和供氧供碳等优良特性，以实现固氮、解磷解钾、抗病虫等功能，促进植物生长。
目前，微生物肥料产品存在菌株存活力差、活性低导致的货架期短、剂型单一、难以长距离运输、施用方式复杂、效果不稳定等问题。此外，固氮微生物菌剂等产品受根际氨氮、逆境等胁迫因子影响极大，导致田间固氮效率低下，节肥增产效果不稳定，且只能采用人工播种、难以满足当前我国机械化和设施化农业发展的迫切需求。利用种子包衣将高分子化合物配制的成膜剂、增塑剂和着色剂等，与抗菌剂、杀虫剂和植物生长调节剂等混合，包裹在作物种子外表，从而达到防治苗期病虫害、促进生长发育、提高作物产量等目的。但是，现有种子包衣剂均缺乏保护微生物活性的功能，被包裹的农用微生物存活率低，其固氮、解磷解钾、抗病虫和促生等功效迅速丧失。针对传统微生物菌肥田间应用效果不稳定、不能满足适应农业现代化发展需求等不足，需要研制新型的合成生物材料，或合成微米级活性微囊包裹活性微生物形成新型菌肥，或作为新型农作物种子活性包衣剂等。
聚羟基脂肪酸酯，简称PHA，是很多微生物在营养失衡的情况下，在体内合成的一种可生物降解的细胞内聚酯，主要作为微生物的碳源及能量储备。PHA结构多元化，通过改变菌种、给料、发酵过程可以很方便地改变PHA的组成，而组成结构多样性带来的性能多样化使其在应用中具有明显的优势。鉴于PHA微球表面易被修饰改造，越来越多的功能蛋白通过与PHA微球表面蛋白的融合表达，呈递在了PHA微球表面，使其成为一种高效的蛋白固定化及呈递的新技术。此外，由于PHA微球可完全降解并被彻底代谢掉，不仅避免了其他基质材料在大剂量使用时的毒性问题，而且可为环境中的微生物提供生长所需的碳源。因具以上良好的生物降解性和生物相容性等特性，PHA在药物缓释体系和新型包被材料研发中发挥着重要作用。
亲水性蛋白是一种带有极性基团的生物大分子，对水有强的亲和能力。这类分子形成的固体材料的表面，易被水所润湿，保持高的亲水性，保水性能极佳。作为极端响应逆境胁迫的重要组成部分，亲水性蛋白已成为生命科学研究领域的热点之一。
血红蛋白广泛存在于动物、植物及微生物体内，具有典型的分子结构和生理功能，大量应用于食品、药物的工业生产中。在正常生理条件下，血红素以亚铁的形式存在，称为氧合血红蛋白，负责生理呼吸过程中的氧结合。此外，血红蛋白还具有抗菌功能。
如果能将生物可降解材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)与具有亲水和携氧等功能的人工合成蛋白组分结合，作为新型材料包裹固氮微生物，有望实现保护微生物活性、固氮、促进作物生长等功效。
现有技术中，仅有PHA单独作为种衣包裹的报道，但未见采用亲水蛋白和/或血红蛋白相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用于农业的具有生物活力的人工合成材料。
所述材料含有以下三种成分：
人工亲水蛋白，由本发明设计合成，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
人工血红蛋白，由本发明设计合成，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
聚羟基脂肪酸酯(PHA)。
其中，所述人工亲水蛋白是具有高保水特性的蛋白，含有8个由11个氨基酸残基组成的基序，在两个基序之间含有连接肽，可能作为分子伴侣保护逆境胁迫下的细胞以及保护酶(乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等)或蛋白(α-酪蛋白)的活性，HD结构能在生物分子之间起着物理屏障的作用，降低生物分子之间的碰撞，从而减少他们聚集和阻止结构发生改变。该蛋白不仅可以在胞内对其他的多种蛋白具有保护作用，在体外环境中对其他的蛋白或者细胞都具有良好的保护作用。
所述人工血红蛋白具有高携氧能力。可为PHA和血红蛋白提供防脱水环境，为亲水蛋白提供适宜的氧环境。
聚羟基脂肪酸酯(PHA)为生物可降解材料，作为载体包裹固氮微生物以及人工亲水蛋白和人工血红蛋白组分人工构建微米级固氮微囊(图1)，并通过调控碳源和氧气供应、保持水分及有效缓解外界逆境胁迫实现固氮菌活力保持的作用，进一步提供一种作为新型高效固氮菌剂的包囊材料以及替代传统种子包衣剂的包膜加工工艺(图2)。
本发明的材料有广泛的农业应用范围，可以用本发明的材料制备微米级活性微囊包裹具有固氮、解磷解钾、抗病虫和促生等特性的农用微生物形成新型菌肥、制备新型农作物种子活性包衣剂等农业领域，能够体现出保持菌体活力、定向结合根表和施肥精准高效等独特性能，适用于机械化播种、水肥一体化滴灌和无土栽培等现代农业生产方式，替代高成本和低效率的传统农用微生物接种方法。
三种成分的用量比例是：短链PHA水溶液(浓度范围50-200g/L)，人工亲水蛋白溶液(浓度范围0.1-1g/ml)，人工血红蛋白溶液(浓度范围0.1-1g/ml)，按照10:1:1的体积比混合。
所述短链PHA(short-chain-length,SCL-PHA)是共含有3至5个碳原子的PHA，这类单体聚合之后形成常见的均聚物，如聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸脂(PHV)等。
当本发明的生物材料用于种子包衣剂时，三种成分的用量比例是短链PHA水溶液(浓度100g/L)，人工亲水蛋白溶液(浓度0.5g/ml)、人工血红蛋白溶液(浓度0.5g/ml)按照10:1:1的体积比混合。
种子包衣剂配制方法是：由43.1wt.％膜包衣配制剂、43.3wt.％水和13.6wt.％色素浓缩物组成的浆料包衣作物种子，浆料的施用量为5.5g/kg种子。
所述膜包衣配制剂由水(60％wt/wt)、流变学添加剂(0.2％wt/wt)、消泡剂(0.2％wt/wt)、50％乙酸乙烯酯粘合剂乳液(15％wt/wt)以及本发明的生物材料(24.6％wt/wt)组成。
为了区分不同品种的种子，须加入着色剂如色素浓缩物作为指示剂。可选用色素红112(CAS No.6535-46-2)，色素红2(CAS No.6041-94-7)，色素红48：2(CAS No.7023-61-2)，色素蓝15：3(CAS No.147-14-8)，色素绿36(CAS No.14302-13-7)中的一种或几种。
流变学添加剂可以改进包衣过程中材质的流变学特性，用于降低摩擦和改善种子外观。可选用蒙脱粘土、锂蒙脱石、卡波姆、丙二醇、十一碳稀酰胺DEA、PEG-200甘油硬脂肪酸中的一种或几种。
消泡剂能促使包衣过程中的液膜排液，因而导致气泡破灭。可选用聚乙二醇，甘油，矿物油消泡剂，有机硅消泡剂，和非有机硅消泡剂(比如聚醚，聚丙烯酸类)，二甲基聚硅氧烷(硅油)，芳基烷基修饰的聚硅氧烷，聚醚硅氧烷共聚物(含有蒸气沉积二氧化硅)中的一种或几种。
本发明的有益效果：
本申请针对农业微生物菌肥生产中的关键瓶颈问题，甄选具有结构多元、可生物降解和高生物相容性的PHA材料、高保水特性的人工亲水蛋白和高携氧能力的人工血红蛋白，创建新型的具有生物活力的人工合成材料。
该材料特性突出，共能互补，PHA微球本身具有结合蛋白的特性，人工亲水蛋白可为PHA和血红蛋白提供防脱水环境，人工血红蛋白为亲水蛋白提供适宜的氧环境。此外，本申请采用新型人工活性材料和农用微生物优良菌株，开发具有固氮、解磷钾、抗病虫和促生等功能的人工微囊或新型种衣剂等产品，可以显著提高菌株的生物活性和存活能力，同时具有保持菌体活力、定向结合根表和施肥精准高效等独特性能，适用于机械化播种、水肥一体化滴灌和无土栽培等现代农业生产方式，应用范围广泛。
附图说明
图1一种具有生物活力的人工合成材料构建示意图。
图2基于人工合成材料制备固氮微囊以及进一步加工成为新型固氮菌剂的包囊材料和替代传统种子包衣剂的包膜。
图3具有生物活力的人工合成材料的制备流程图。
图4一种具有生物活力的人工合成材料的显微镜照片。
图5固氮微囊中活性微生物的存活率(A)及固氮酶活性(B)变化。
图6固氮微囊中活性微生物在水稻(A)和玉米(B)根系的定殖数量。
图7包膜种子中活性微生物的存活率(A)及固氮酶活性(B)变化。
图8为SEQ ID No.2人工亲水蛋白MHYD氨基酸序列同源性分析；
图9为SEQ ID No.4人工血红蛋白MHGB氨基酸序列同源性分析。
序列信息
SEQ ID No.1：人工亲水蛋白基因mhyd核苷酸序列
SEQ ID No.2：人工亲水蛋白MHYD的氨基酸序列
SEQ ID No.3：人工血红蛋白基因mhgb核苷酸序列
SEQ ID No.4：人工血红蛋白MHGB的氨基酸序列
具体实施方式
以下实施例中提到的有关蛋白来源如下：
SEQ ID No.2人工亲水蛋白MHYD来源及人工合成
将耐辐射异常球菌亲水蛋白DosH的结构域进行了截短与重组，优化其蛋白保护功能与提高表达效率。图8为氨基酸序列同源性分析。
SEQ ID No.4人工血红蛋白MHGB来源及人工合成
利用牦牛肌红蛋白为骨架，通过结构域重组人工设计的具有更高携氧能力的新型人工肌红蛋白。图9为氨基酸序列同源性分析。
实施例1人工亲水蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化
实验过程：
(一)IPTG诱导重组蛋白表达
(1)将成功构建的重组菌株BL-DosHM划线活化。挑取单菌落于新鲜的(含卡那霉素50mg/mL)3mL的LB培养基中，37℃220rmp振荡培养过夜。
(2)次日将种子液按1：100转接于含Km(50mg/mL)20mL的LB培养基中，于37℃220rmp振荡培养，OD600约0.6～0.8。
(3)加入终浓度分别为0.5mM的IPTG于16℃过夜(同时未加IPTG的作为空白对照)，诱导大肠杆菌进行外源表达。
(4)取诱导后的菌液，5,000rmp离心5min，收集菌体。将收集的细胞用NTA-0缓冲液进行震荡悬浮(1/20培养体积)，混匀，冰浴30min。
(5)加入终浓度为0.05％的Triton X-100，混匀，置于冰上15min。
(6)利用超声波对细胞进行破碎。超声波破碎时间为15min，破碎细胞频率为每间隔2s，破碎3s。破碎后，置于冷冻离心机，12000rpm离心10min。
(7)吸取上清液进行纯化。
(二)带有His标签融合蛋白的纯化
(1)提前制备层析柱，加入2-3mL NTA树脂于层析柱中，用10倍NTA体积的NTA-0Buffer进行洗脱。
(2)将破碎后的细胞总蛋白加入到层析柱中，流速为每小时15mL，收集穿透部分。为增加纯化效率，反复上样3次。流出部分进行SDS-PAGE分析。
(3)加入NTA-0缓冲液进行洗脱，用量为5倍树脂体积。收集液体用于检测蛋白与树脂的结合情况。
(4)分别加入5倍体积的NTA-200缓冲液进行洗脱，流速为每小时15mL。收集洗脱缓冲液，用于SDS-PAGE分析确定目标蛋白表达情况。
(5)取少量分别加入5×蛋白上样缓冲液混匀后于沸水浴中煮沸10min，12000rpm，10min。取10μL上清液进行SDS-PAGE电泳，确定最终洗脱浓度。
(6)利用超速离心过滤管更换蛋白缓冲液，将蛋白溶解在50mM Tris-HCl缓冲液中。
实施例2人工血红蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化
实验过程：
(一)IPTG诱导重组蛋白表达
(1)将成功构建的重组菌株BL-SYMB划线活化。挑取单菌落于新鲜的(含卡那霉素50mg/mL)3mL的LB培养基中，37℃220rmp振荡培养过夜。
(2)次日将种子液按1：100转接于含Km(50mg/mL)20mL的LB培养基中，于37℃220rmp振荡培养，OD600约0.6～0.8。
(3)加入终浓度分别为0.5mM的IPTG于20℃培养10小时，诱导大肠杆菌进行外源表达。
(4)取诱导后的菌液5,000rmp离心5min，收集菌体。将收集的细胞用NTA-0缓冲液进行震荡悬浮(1/20培养体积)，混匀，冰浴30min。
(5)加入终浓度为0.05％的Triton X-100，混匀，置于冰上15min。
(6)利用超声波对细胞进行破碎。超声波破碎时间为15min，破碎细胞频率为每间隔2s，破碎3s。破碎后，置于冷冻离心机，12000rpm离心15min。
(7)吸取上清液进行纯化。
(二)带有His标签融合蛋白的纯化
(1)提前制备层析柱，加入2-3mL NTA树脂于层析柱中，用10倍NTA体积的NTA-0Buffer进行洗脱。
(2)将破碎后的细胞总蛋白加入到层析柱中，流速为每小时15mL，收集穿透部分。为增加纯化效率，反复上样3次。流出部分进行SDS-PAGE分析。
(3)加入NTA-0缓冲液进行洗脱，用量为5倍树脂体积。收集液体用于检测蛋白与树脂的结合情况。
(4)分别加入5倍体积的NTA-200缓冲液进行洗脱，流速为每小时15mL。收集洗脱缓冲液，用于SDS-PAGE分析确定目标蛋白表达情况。
(5)取少量分别加入5×蛋白上样缓冲液混匀后于沸水浴中煮沸10min，12000rpm，10min。取10μL上清液进行SDS-PAGE电泳，确定最终洗脱浓度。
(6)利用超速离心过滤管更换蛋白缓冲液，将蛋白溶解在50mM Tris-HCl缓冲液中。
实施例3具有生物活力的人工合成材料的制备
实验过程：
(一)原料组成如下：
短链PHA为商业化产品，购买自深圳意可曼生物科技有限公司；人工亲水蛋白溶解于50mM Tris-HCl缓冲液中，浓度为0.5g/ml；人工血红蛋白溶解于50mM Tris-HCl缓冲液中，浓度为0.5g/ml。
(二)按照上述原料，采用如下步骤制备而成(图3)：
(1)将适量的短链PHA水溶液采用超声波仪器在20kHz-100kHz之间进行声处理5min，形成第一溶液；
(2)将溶解在50mM Tris-HCl缓冲液中的人工亲水蛋白和人工血红蛋白以1:1比例进行混合，搅拌15min，形成第二溶液；
(3)将声处理后的第一溶液按照5:1体积比加入到第二溶液中形成第三溶液，第三溶液中PHA水溶液:人工亲水蛋白溶液:人工血红蛋白溶液体积比为10:1:1；
(4)采用合适的中和剂0.1mM碳酸钠对第三溶液进行中和处理；
(5)将中和的溶液采用超声波仪器在20kHz-100kHz之间进行声处理15min，得到中和溶液，超声处理引起中和液中PHA与其所封装的人工蛋白产生自组装。使用一次性0.45μm的微孔过滤器将中和液过滤，对颗粒产量或粒径分布不会有显著影响。
(6)40℃下真空干燥48小时，最终获得含有生物活力的人工合成材料。
实验结果：
使用光学显微镜在常规研究条件下观察本发明人工合成材料的结构，粒径在100-200μm左右，成品颗粒均匀，表明结构呈多孔蜂窝状(图4)。
实施例4固氮微囊的制备及菌株存活率和活性测定
实验过程：
(1)将固氮菌株A和B过夜培养至OD1.0(数量约为108-109/mL)。
(2)将上述人工合成材料与固氮菌株A和B混合，静置24h后离心，弃去上清液，将沉淀物收集自然风干后获得固氮微囊。同时将PHA材料与固氮菌株A和B混合处理、人工蛋白与固氮菌株A和B混合以及固氮菌株A和B不经处理等作为对照。
(3)将固氮微囊以及不同对照处理溶解在生理盐水中，室温保存。分别在d0、d5、d10、d15、d20、d40、d60、d80、d100天取出适量样品，震荡后用平板菌落计数法测定活菌数计算菌株存活率。
(4)将固氮微囊以及不同对照处理溶解在生理盐水中，室温保存。分别在d0、d5、d10、d15、d20、d40、d60、d80、d100天取出适量样品，震荡后利用乙炔还原法测定固氮条件下微囊的固氮酶活性。
(5)向测固氮酶活的小瓶中分别加入9ml的K无氮培养基，再加入1ml的待测样品。
(6)用酒精灯灼烧过的镊子夹取灭过菌的胶塞封住小瓶，并加盖固封。
(7)在小瓶中注入5分钟氩气以排尽瓶内空气，然后注入1mL氧气和10mL乙炔。
(8)将小瓶置于30℃，200rpm摇床培养，分别在4小时后，6小时后，8小时后，10小时后吸取瓶内2.5mL气体检测乙烯峰面积，利用公式固氮酶活＝乙烯峰面积×(三角瓶的气相总体积/取样体积)/(1nmol乙烯标准峰面积×反应时间×菌体全蛋白总量)计算固氮微囊的固氮酶活。
实验结果：
固氮微囊内的固氮菌A和菌B的存活率最高，20天后的存活率分别为67.5％和64.3％，100后的存活率分别为5.4％和7.5％(图5A)。经过PHA材料处理的固氮菌A和菌B在100天后的存活率分别为2.9％和1.0％。经过人工蛋白处理的固氮菌A和菌B在100天后的存活率分别为0.1％和0.08％。未经过处理菌株的存活率最低，20天后菌株数量接近于0。
经过20天后微囊包裹的固氮菌A和菌B的固氮酶活最高，分别维持在6235和6547nmol ethylene(mg protein h)-1，较培养起始时分别下降约7.6％和6.8％(图5B)；100天后微囊包裹的固氮菌A和菌B的固氮酶活维持在5382和5453nmol ethylene(mg proteinh)-1，较培养起始时下降约20.1％和22.4％。经过PHA材料处理的固氮菌A和菌B在20天后酶活下降约35％，100天后下降89％。经过人工蛋白处理的固氮菌A和菌B在20天酶活下降约91％，100天后下降约97％。未经过处理菌株的酶活在20天后下降约98.2％。
以上结果表明经过人工合成材料包裹固氮菌后形成固氮微囊能够有效提高固氮菌的存活率和固氮酶活。
实施例5固氮微囊在根系的定殖效率测定
实验过程：
(一)水稻根系定殖效率
(1)实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验处理共8个，包括菌A+PHA+人工蛋白、菌B+PHA+人工蛋白、菌A+PHA、菌B+PHA、菌A+人工蛋白、菌B+人工蛋白、菌A和菌B；实验设置8个重复。
(2)将水稻种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。水稻种子在无菌滤纸中培养，期间保持滤纸湿润，发芽5-7天后出苗。将水稻幼苗放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆2株苗，每组8个重复。将各个处理的微囊或菌剂溶解于定量的Hoagland溶液中，以溶液的形式倒入土壤中。
(3)分别在d0、d5、d10、d15、d20、d40、d60、d80、d100天取出水稻，用无菌水清洗水稻的根部。剪取水稻根部，用无菌滤纸吸干根部，称重。放入加入10ml 0.85％的生理盐水的离心管中。离心管经过超声处理100s，间歇5s，重复5次，然后涡旋振荡10min。将悬液梯度稀释(10-3、10-4、10-5)后涂板。30℃培养24h后进行菌落计数，计算根表定殖的微生物数量。
(二)玉米根系定殖效率
(1)实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验处理共8个，包括菌A+PHA+人工蛋白、菌B+PHA+人工蛋白、菌A+PHA、菌B+PHA、菌A+人工蛋白、菌B+人工蛋白、菌A和菌B；实验设置8个重复。
(2)将玉米种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。将表面灭菌后的玉米种子放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。试验设置8个重复。玉米出苗后间苗至2颗/盆。将各个处理的微囊或菌剂溶解于定量的Hoagland溶液中，以溶液的形式倒入土壤中。
(3)分别在d0、d5、d10、d15、d20、d40、d60、d80、d100天取出玉米，用无菌水清洗水玉米的根部。剪取玉米根部，用无菌滤纸吸干根部，称重。放入加入10ml 0.85％的生理盐水的离心管中。离心管经过超声处理100s，间歇5s，重复5次，然后涡旋振荡10min。将悬液梯度稀释(10-3、10-4、10-5)后涂板。30℃培养24h后进行菌落计数，计算根表定殖的微生物数量。
实验结果：
水稻接种微囊包裹的固氮菌A和菌B后，20天后根系上固氮菌A和菌B数量分别达到1.48×105和2.46×105/g root，100天后水稻根系固氮菌A和菌B数量分别达到4.41×106和3.21×106/g root(图6A)。当接种PHA材料处理的固氮菌A和菌B后，20天后菌A和菌B在水稻根系的数量达到1.58×104和9.87×103/g root，100天后数量达到1.25×105和7.25×104/g root。当接种人工蛋白处理的固氮菌A和菌B后，20天后菌A和菌B在水稻根系的数量达到3.27×103和1.34×103/g root，100天后数量达到2.21×104和1.24×104/g root。当接种未经处理的菌A和菌B后，20天后菌A和菌B在水稻根系的数量为8.54×102和8.76×102/groot，100天后数量为8.52×102和8.72×102/g root。
玉米接种微囊包裹的固氮菌A和菌B后，20天后根系固氮菌A和菌B数量达到5.49×105和7.36×105/g root，100天后玉米根系固氮菌A和菌B数量达到4.31×106和6.42×106/g root(图6B)。当接种PHA材料处理的固氮菌A和菌B后，20天后菌A和菌B在玉米根系的数量达到2.74×104和8.96×103/g root，100天后数量达到9.84×104和6.99×104/g root。当接种人工蛋白处理的固氮菌A和菌B后，20天后菌A和菌B在玉米根系的数量达到1.83×103和2.76×103/g root，100天后数量达到7.89×103和1.63×104/g root。当接种未经处理的菌A和菌B后，20天后菌A和菌B在玉米根系的数量为1.09×103和1.26×103/g root，100天后数量为1.03×103和1.37×103/g root。
以上结果表明经过人工合成材料包裹固氮菌后形成固氮微囊与植物根系的亲和力显著增强。
实施例6固氮微囊对植物的促生效果评价
实验过程：
(一)水稻促生试验
(1)实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验处理共8个，包括菌A+PHA+人工蛋白、菌B+PHA+人工蛋白、菌A+PHA、菌B+PHA、菌A+人工蛋白、菌B+人工蛋白、菌A和菌B；实验设置8个重复。
(2)将水稻种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。水稻种子在无菌滤纸中培养，期间保持滤纸湿润，发芽5-7天后出苗。将各个处理的微囊或菌剂溶解于生理盐水中，水稻幼苗分别放入生理盐水中浸泡30min。将浸泡后的水稻幼苗放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆2株苗，每组8个重复。试验设置8个重复。水稻生长周期内按照正常管理。种植90天后分别测定水稻地上和地下部生长量、千粒重、氮含量等生长指标。
(二)玉米促生试验
(1)实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验处理共8个，包括菌A+PHA+人工蛋白、菌B+PHA+人工蛋白、菌A+PHA、菌B+PHA、菌A+人工蛋白、菌B+人工蛋白、菌A和菌B；实验设置8个重复。
(2)将玉米种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。将各个处理的微囊或菌剂溶解于生理盐水中，表面消毒后的种子分别放入生理盐水中浸泡30min。将浸泡后的玉米种子放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。试验设置8个重复。玉米出苗后间苗至2颗/盆，玉米生长周期内按照正常管理。种植100天后分别测定玉米地上和地下部生长量、单株籽粒产量、氮含量等生长指标。
实验结果：
水稻接种微囊包裹的固氮菌A和菌B后，植物株高、干重、根系长度、种子千粒重以及氮含量均显著高于PHA材料处理、人工蛋白处理以及未处理对照(表1)。其中微囊包裹的固氮菌A和菌B接种后水稻株高相比于其他处理提高22-38％，根系长度提高18-66％，植物干重增加9-41％，千粒重增加17-47％，氮含量增加25-106％。
表1温室盆栽条件下固氮微囊对水稻生长量、产量和氮含量的影响
玉米接种微囊包裹的固氮菌A和菌B后，植物株高、干重、根系长度、种子千粒重以及氮含量都显著高于PHA材料处理、人工蛋白处理以及未处理对照(表2)。其中微囊包裹的固氮菌A和菌B接种后玉米株高相比于其他处理提高7-18％，根系长度提高26-64％，植物干重增加0.8-8％，单籽粒产量增加5-45％，氮含量增加11-60％。
表2温室盆栽条件下固氮微囊对玉米生长量、产量和氮含量的影响
以上结果表明经过人工合成材料包裹固氮菌后形成固氮微囊进入植物根际后能够显著提高植物地上部和地下部的生长量、产量以及氮含量。
实施例7利用固氮包膜制备种子包衣及其菌株存活率和活性测定
实验过程：
(1)膜包衣配制剂根据表3制备。用由43.1wt.％膜包衣配制剂、43.3wt.％水和13.6wt.％色素浓缩物组成的浆料包衣水稻和玉米种子。浆料的施用量为5.5g/kg种子。
表3膜包衣配制剂的组成物
成分
组成比例(％wt/wt)
水
60
流变学添加剂
0.2
消泡剂
0.2
乙酸乙烯酯粘合剂乳液(50％)
15
具有生物活性的人工合成材料
24.6
(2)分别在d0、d5、d10、d15、d20、d40、d60、d80、d100天取出适量种子样品，用破壁机破碎震荡后溶解于生理盐水中，用平板菌落计数法测定活菌数计算菌株存活率。
(4)分别在d0、d5、d10、d15、d20、d40、d60、d80、d100天取出适量种子样品，用破壁机破碎震荡后溶解于生理盐水中，利用乙炔还原法测定固氮条件下微囊的固氮酶活性。
(5)向测固氮酶活的小瓶中分别加入9ml的K无氮培养基，再加入1ml的待测样品。
(6)用酒精灯灼烧过的镊子夹取灭过菌的胶塞封住小瓶，并加盖固封。
(7)在小瓶中注入5分钟氩气以排尽瓶内空气，然后注入1mL氧气和10mL乙炔。
(8)将小瓶置于30℃，200rpm摇床培养，分别在4小时后，6小时后，8小时后，10小时后吸取瓶内2.5mL气体检测乙烯峰面积，利用公式固氮酶活＝乙烯峰面积×(三角瓶的气相总体积/取样体积)/(1nmol乙烯标准峰面积×反应时间×菌体全蛋白总量)计算固氮微囊的固氮酶活。
实验结果：
经过包膜处理的种子包衣中固氮菌A和菌B的存活率最高，20天后的存活率分别为41.3％和43.6％，100后的存活率分别为7.5％和7.6％(图7A)。而未经过种子包衣处理菌株20天后的存活率为0.11％，100天后存活率为0.0011％。
经过包膜处理的种子包衣中固氮菌A和菌B的固氮酶活最高，20天后固氮菌A和菌B的固氮酶活分别维持在3235和2997nmol ethylene(mg protein h)-1，较培养起始时分别下降约39％和42％(图7B)；100天后包膜处理的种子中的固氮菌A和菌B的固氮酶活维持在2382和2053nmol ethylene(mg protein h)-1，较培养起始时下降约55％和60％。未经过包衣处理的菌株的酶活在20天后下降约89％，为563nmol ethylene(mg protein h)-1，100天后酶活仅为55nmol ethylene(mgprotein h)-1，相对于初始阶段的1.1％。
以上结果表明经过固氮包膜处理形成的种子包衣能够显著提高固氮菌的存活率和固氮酶活。
实施例8固氮包膜种子包衣效果评价
实验过程：
(一)水稻种子包衣效果评价
(1)实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验处理共3个，包括菌A包膜种子、菌B包膜种子、未包膜种子；实验设置8个重复。
(2)将水稻种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。水稻种子在无菌滤纸中培养，期间保持滤纸湿润，发芽5-7天后出苗，统计发芽率。将水稻幼苗移栽至装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆2株苗，每组8个重复。试验设置8个重复。水稻生长周期内按照正常管理。种植90天后分别测定水稻地上和地下部生长量、千粒重、氮含量等生长指标。
(二)玉米种子包衣效果评价
(1)实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验处理共3个，包括菌A包膜种子、菌B包膜种子、未包膜种子；实验设置8个重复。
(2)将玉米种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。将表面灭绝后的玉米种子放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。试验设置8个重复。玉米出苗后统计出芽率，并间苗至2颗/盆，玉米生长周期内按照正常管理。种植100天后分别测定玉米地上和地下部生长量、单株籽粒产量、氮含量等生长指标。
实验结果：
经过固氮菌A和菌B包膜形成的水稻种子发芽率为98.6％，显著高于在未包膜种子的发芽率96.3％。成熟期植株株高约为109cm，比未包膜种子对照提高24％；根系长度约为32cm，较未包膜种子对照提高60％；植物干重约为87g，较未包膜种子对照提高38％；千粒重约为28g，较未包膜种子对照提高56％；氮含量约为2.5g/plant，较未包膜种子对照提高92％(表3)。
经过固氮菌A和菌B包膜形成的玉米种子发芽率为99.5％，显著高于在未包膜种子的发芽率97.2％。成熟期植株株高约为206cm，比未包膜种子对照提高102％；根系长度约为76cm，较未包膜种子对照提高41％；植物干重约为492g，较未包膜种子对照提高6％；单籽粒产量约为186g，较未包膜种子对照提高39％；氮含量约为3.2g/plant，较未包膜种子对照提高167％(表4)。
以上结果表明经过固氮包膜处理形成的种子包衣能够显著提高种子发芽率，成熟后的植物地上部和地下部的生长量、产量以及氮含量也得到显著增加。
表4温室盆栽条件下固氮包膜种子的发芽率、生长量、产量及氮含量
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种具有生物活力的人工合成材料及其农业应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATGTTTGAAC GCGATGAACA TCACTTTCCG GTTAAGCGTC TGTTGCTGCT CGGTGCCCTC 60
GTCGGGGCCG GCGCCTACTA CCTGAGCCGC GAGCAAAACC GCAAGGCGCT CGACGCCAAG 120
CTGGCCGAAC TTGGCCTGAA AGACGCCGCG CAGGACGTGG GCAGCAGCGT GACCAAGGGC 180
TGGGAAAAGA CCAAGGACGC CGCTCAGAAC GCCGGAAGTG TCATCGCCGA CAAAGCGCAG 240
GACGTGGCGG GCGAAGTGAA GAGCGCCGTG GCGGGCGCGA CCGCCGAAAT CAAGGACGCG 300
GGCAAGGAAG TGGCCGACAC CGCCAAGGAC GCCGGTCAGA ACGTGGGCCA GAACGTCAAG 360
CGCGAAGCTG CCGACCTCGC TGACCAGGCG AAGGACAAAG CCCAGGACGT GAAGGCTGAT 420
GTCAGCAAGG CTGCCGACCA GGCCAAAGAC AAAGCTCAGG ATGTCGCCCA GAACGTGCAA 480
GCCGGGGCCC AGCAGGCCGC CGCCAACGTC AAGGACAAGG TTCAGGATGT GAAGGCTGAC 540
GCCAGCAAGG ACGCCGAAGC GGGCAAGCAG GGCGGCCAGA CCGGCAGCAC CACGAACAAT 600
GCTGGTACGG CGGGCAACAC CGGCATGACG GGCAACACCA ACACCCGCAA GAACTGA 660
<210> 2
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Phe Glu Arg Asp Glu His His Phe Pro Val Lys Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Val Gly Ala Gly Ala Tyr Tyr Leu Ser Arg Glu Gln
20 25 30
Asn Arg Lys Ala Leu Asp Ala Lys Leu Ala Glu Leu Gly Leu Lys Asp
35 40 45
Ala Ala Gln Asp Val Gly Ser Ser Val Thr Lys Gly Trp Glu Lys Thr
50 55 60
Lys Asp Ala Ala Gln Asn Ala Gly Ser Val Ile Ala Asp Lys Ala Gln
65 70 75 80
Asp Val Ala Gly Glu Val Lys Ser Ala Val Ala Gly Ala Thr Ala Glu
85 90 95
Ile Lys Asp Ala Gly Lys Glu Val Ala Asp Thr Ala Lys Asp Ala Gly
100 105 110
Gln Asn Val Gly Gln Asn Val Lys Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ala Asp
115 120 125
Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Lys Ala Asp Val Ser Lys Ala
130 135 140
Ala Asp Gln Ala Lys Asp Lys Ala Gln Asp Val Ala Gln Asn Val Gln
145 150 155 160
Ala Gly Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asn Val Lys Asp Lys Val Gln Asp
165 170 175
Val Lys Ala Asp Ala Ser Lys Asp Ala Glu Ala Gly Lys Gln Gly Gly
180 185 190
Gln Thr Gly Ser Thr Thr Asn Asn Ala Gly Thr Ala Gly Asn Thr Gly
195 200 205
Met Thr Gly Asn Thr Asn Thr Arg Lys Asn
210 215
<210> 3
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ATGGGTCTCA GCGATGGGGA GTGGCAATTG GTTCTAAATG CATGGGGCAA AGTGGAAGCA 60
AACATTCCTC AGTACTCAGT GGTCTTTTAT ACTAGCATCC TAGAAAAGCA CCCAGAGACG 120
CTGGAAAAAT TCGATAAATT TAAGCATTTA AAAACGGAAG CAGAAATGAA GGCAAACCCT 180
AAATTAGCGG GCCACGCTGA AAAACTCTTT GGACTTGTGC GTGATAGTGC AATACAATTA 240
CGTGCCAAAA AGAAGGGGCA TCACGAAGCG GAGGACGCTG CTTTGGGAAG TATTCATGCA 300
CAAAATAAGC ATAAAATACC CGTTAAATAC CTCGAATTCA TATCCGACGC AATAATTCAT 360
GTTCTACATG CCAAACATCC CTCAGATTTT GGTGCCGATG CTCAGGCTGC GATGTCGAAA 420
GCTCTTGAAT TATTCAGAAA TGATATGGCT GCCCAGTATA AAGTACTTGG GTTTCATGGT 480
TAA 540
<210> 4
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Ala Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Glu Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr Ser
20 25 30
Ile Leu Glu Lys His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys
35 40 45
His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Asn Pro Lys Leu Ala Gly
50 55 60
His Ala Glu Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Ile Gln Leu
65 70 75 80
Arg Ala Lys Lys Lys Gly His His Glu Ala Glu Asp Ala Ala Leu Gly
85 90 95
Ser Ile His Ala Gln Asn Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu
100 105 110
Phe Ile Ser Asp Ala Ile Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser
115 120 125
Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Ala Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu
130 135 140
Phe Arg Asn Asp Met Ala Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe His Gly
145 150 155 160