具有抑菌功能的生物活性肽、复合生物活性肽及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 具有抑菌功能的生物活性肽、复合生物活性肽及其制备方法和用途 (Biological active peptide and composite biological active peptide with bacteriostatic function and preparation method and application thereof ) 是由 高峰 刘迎春 訾阳 杜贺阳 王珍如 格日勒图 于 2021-03-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了具有抑菌功能的生物活性肽、复合生物活性肽及其制备方法和用途。本发明首先公开了具有抑制细菌功能的生物活性肽,所述生物活性肽的制备方法包括：以羊血为原料利用酶水解法处理得到羊血血红蛋白,其中,所述的酶选自胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任何一种。本发明进一步公开了具有更佳抑制细菌功能的复合生物活性肽,该复合生物活性肽由采用胃蛋白酶对羊血进行酶水解法处理得到的生物活性肽以及采用木瓜蛋白酶对羊血进行酶水解法处理得到的生物活性肽复合组成,体外和体内抑制试验结果表明,本发明所提供的生物活性肽或复合生物活性肽对于沙门氏菌和大肠杆菌具有显著的抑菌和抗炎作用。(The invention discloses a biological active peptide with a bacteriostatic function, a composite biological active peptide, a preparation method and application thereof. The invention firstly discloses a bioactive peptide with the function of inhibiting bacteria, and the preparation method of the bioactive peptide comprises the following steps: sheep blood is taken as a raw material and treated by an enzymatic hydrolysis method to obtain sheep blood hemoglobin, wherein the enzyme is selected from any one of pepsin, neutral protease, papain or trypsin. The invention further discloses a composite bioactive peptide with better bacteria inhibiting function, which is formed by compounding a bioactive peptide obtained by carrying out enzymatic hydrolysis on sheep blood by adopting pepsin and a bioactive peptide obtained by carrying out enzymatic hydrolysis on the sheep blood by adopting papain, and in-vitro and in-vivo inhibition test results show that the bioactive peptide or the composite bioactive peptide provided by the invention has obvious antibacterial and anti-inflammatory effects on salmonella and escherichia coli.)
技术领域
本发明涉及生物活性肽，尤其羊血来源的具有抑菌功能的生物活性肽、复合生物活性肽及其制备方法，本发明进一步涉及所述生物活性肽以及复合生物活性肽在制备抑菌药物中的用途，属于生物活性肽及其制备领域。
背景技术
生物活性肽被定义为对身体功能和状况有积极影响并最终可能影响健康的特定蛋白质片段(Dziuba M,Darewicz M.Food Proteins as Precursors of BioactivePeptides-Classification Into Families[J].Food ence&Technology International,2007,13(6):393-404.)。生物活性肽具有调节机体一系列生理功能的潜力。它们可以在蛋白质的多肽链中被加密，并且可以通过蛋白质水解释放，在那里它们可以与适当的受体相互作用，表现出类似激素的活性(FitzGerald R,Murray B.A.Bioactive peptides andlactic fermentations[J].International Journal of Dairy Technology,2006,(59):118-125.)。生物活性肽通常含有3到20个氨基酸，而从食物中提取的生物活性肽通常包含2到9个氨基酸。它们的活性取决于氨基酸组成和序列，目前已经被报道的具有生物活性的活性肽包括：降血压肽(降压肽)、抗血栓肽、阿片肽、酪蛋白磷酸肽(CPP)、抗菌肽、细胞调节肽以及免疫调节肽。根据其功能性质分类，生物活性肽可分为抗菌肽、免疫调节肽、抗氧化肽、抗高血压肽等。这些肽对人体健康起着重要作用。生物活性肽具有巨大的开发潜力，尤其在功能性食品中，其方法是增加其在食品中的浓度，使其产生可测量的生物效应，或将其引入天然不含肽的食品中。生物活性肽作为信号分子，在生理功能和发病机制中发挥着重要作用，在目前的药物研究中，抗菌肽和蛋白质被认为有潜在的农业用途。经初步研究发现，一些天然形成的生物活性肽具有非特异性、毒性、低稳定性、不易降解等不良特性，这些低有效性会影响它们在农作物上的应用。关于提取、分离、表征、分子合成生物活性肽的分子结构这样的高级研究技术，在上个世纪下半叶得到了极大的发展和改进，因此，生物活性肽应运而生。近年来已经有多种生物活性卓越的多肽被合成，它们可以用于医疗和免疫等科学范畴，而且具有抗菌活性的肽和小蛋白已从许多生物体中分离出来，它们在防御方面的作用已经确定，在它们被发现不久后，它们在农业上的用途就已经被挖掘。然而，一些天然肽具有不理想的性质，使其应用复杂化，这也使多肽的合成和高通量活性筛选这一研究被推进，为新肽的重新设计和合理设计提供了可能。
抗菌肽最早是由Karolinska研究所Dr.Hans Berman(Boman H G,HultmarkD.Cell-free immunity in insects.Annu[J].Rev Microbiol,1987,41(1):103-126.)在昆虫幼虫中发现的。抗菌肽根据其分子结构可分为两大类：线性肽和富含二硫键合的半胱氨酸肽。富含半胱氨酸的抗菌肽首先在哺乳动物的循环吞噬细胞中被发现，这些细胞的一个功能是识别外来微生物，将其摄取并杀死。细胞杀死摄入的微生物的一种机制是细胞内释放抗菌肽。在哺乳动物中，抗菌肽有两个主要家族：防御素和cathelicidins。在确认吞噬细胞中有防御素的存在后，其他科学家也发现了与线性肽相似的富含半胱氨酸的肽，并在气管和肠道的粘液涂层上皮中也发现了此类肽，此类肽可以被认为是哺乳动物皮肤上的等价物，在这些地方经常能看到细菌，并为它们的繁殖提供良好的环境。因此，这些广谱抗生素作为抵御吸入空气、食物和水中病原体的第一道防线尤为重要。抗菌肽现在已经在自然界中被鉴定出存在于植物种子、鱼的皮肤分泌物和螃蟹的血液中。基于肽的防御机制在动物界广泛存在，进一步的研究已经从细菌到植物到人类的每一个物种中都鉴定出了抗菌肽。抗菌肽在复杂的多细胞生物进化过程中发挥了重要的作用，它具有强大的广谱抑菌性能，它们用来抵御各种微生物，包括细菌、真菌、病毒和原生动物。因其在动植物中广泛存在，也决定了它的生物多样性。
抗菌肽通常有30-60个氨基酸组成，具有热稳定性好、蛋白酶活性稳定和能广谱抑菌的优点，能够快速有效的杀灭真菌和细菌(Srensen OE,Borregaard N,etal.Antimicrobial peptides ininnate immnue responses[J].Contrib Microbiol,2008,(15):61-77.)。抗菌肽作为一种新的抗感染治疗方式，Robert Hancock和Hans GeorgSah几乎存在于所有生命形式中，它们作为具有抗菌和免疫调节活性的短阳离子两亲肽，是先天性免疫防御的重要组成部分。这些肽为两类不同的抗菌药物提供了模板，直接作用的抗微生物宿主防御肽具有快速、高效和异常广谱的活性。在哺乳动物中，这些肽在生理条件下通常具有极弱的抗菌活性，但它们通过各种机制调节免疫反应的能力在生物体中尤为重要，这一功能是先天免疫过程中不可或缺的一部分，先天免疫本身具有许多成功抗感染治疗的特征，即快速作用和广谱抗菌活性。因此，抗菌肽被认为是新一代的抗生素，也是天然免疫调节剂。
中国的动物血资源非常丰富，动物血液具有来源广、易获得等特点，由于其副产品单一导致动物血的价值没有被充分利用。但是随着现代技术的发展，动物血可以被水解成具有活性的多肽，这些肽具有防病、治病、调节人体生理机能的功效。现有研究中关于猪血和牛血的生物活性肽研究较多，但是关于羊血来源的研究较少，研究体系不完善。因此,利用动物血将血细胞中的血红蛋白分解为珠蛋白和血红素，并进而将珠蛋白酶解成具有生物活性的肽类物质,用于食品工业和制药工业,将极大满足人们日益增长的对食品的功能性的需要,解决动物屠宰时血液对环境的污染,提高蛋白质资源的利用率。为了能使生物活性肽更好地发挥自身抑菌活性，使畜禽动物腹泻在实际合适生产中能被更高效快捷地治疗，因此生物活性肽的抑菌性的研究具有解决这一难题的实际生产意义。
内蒙古地区是中国的羊肉生产与消费大省，羊血作为羊肉屠宰的副产物，可加工成常规蛋白质饲料，但由于其动物来源的安全性、处理步骤繁琐和适口性差的特点，作为动物饲料常常不被认可，所以被浪费的现象非常严重，而且血液的不恰当排放也会造成严重的环境污染问题。畜禽腹泻在畜牧业生产中是一种常见的多发性疾病，由于高发病率和高死亡率导致腹泻成为畜牧生产中的一大难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种源于羊血的具有抑菌功能的生物活性肽或复合生物活性肽；
本发明的目的之二提供一种制备所述具有抑菌功能的生物活性肽或复合生物活性肽的方法；
本发明的目的之三将所述的生物活性肽或复合生物活性肽用于制备抑菌药物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了一种具有抑制细菌功能的生物活性肽，其制备方法包括：以羊血为原料利用酶水解法处理得到的羊血血红蛋白，其中，所述的酶选自胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任何一种；优选的，所述的酶是胃蛋白酶。其中，在用胃蛋白酶对羊血进行酶水解法处理时，所述的酶水解法温度优选是37℃，在用中性蛋白酶对羊血进行酶水解法处理时，所述的酶水解法温度可以是45℃，在用木瓜蛋白酶对羊血进行酶水解法处理时，所述的酶水解法温度优选是37℃，在用胰蛋白酶对羊血进行酶水解法处理时，所述的酶水解法温度优选是55℃。
作为一种优选的具体实施方案，在用酶对羊血进行酶水解法处理时，加酶量为血红蛋白粉质量的0.5-8wt％，最优选为3wt％。
作为一种优选的具体实施方案，在用酶对羊血进行酶水解法处理时，所述的酶水解法处理时间可以是0.5-10h，优选为1-6h，最优选为3h。
为了实现更好的抑菌效果，还可以将酶水解法处理得到的羊血血红蛋白进行提纯处理，包括：将酶水解法处理得到的羊血血红蛋白粗提液离心后，上清用除菌过滤器过滤后，将所得过滤液依次放入规格为10kDa、5kDa、2kDa超滤膜中过滤，收集滤液，得到纯化的生物活性肽。
本发明更进一步的提供了一种具有更好抑制细菌效果的复合生物活性肽，所述的复合生物活性肽是以羊血为原料分别利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶水解法处理得到的两种羊血血红蛋白组成。
其中，两种羊血血红蛋白可以按照任何的比例组成，优选的，两种羊血血红蛋白按照(1-5)：(1-5)的体积比组成，更优选的，两种羊血血红蛋白按照1：1的体积比组成。本发明中所述的细菌优选为沙门氏菌或大肠杆菌。
本发明具体技术方案详述
本发明首先将胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶4种蛋白酶酶解羊血血红蛋白1-6h所得生物活性肽与生理盐水按照7:3的体积比混合，将生物活性肽进行稀释，将用生理盐水稀释后的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88进行抑菌试验。通过药敏纸片法初步验证4种蛋白酶酶解的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88的抑菌性。其中，胃蛋白酶酶解3h、4h、5h、6h的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88均未出现抑菌圈，但在酶解1h、2h出现对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88敏感性较高的抑菌圈，其抑菌圈直径大小分别为12.05mm(1h，沙门氏菌)、11.99mm(2h，沙门氏菌)、15.89mm(1h，大肠杆菌)、15.05mm(2h，大肠杆菌)、14.58mm(1h，E.coli K88)、14.83mm(2h，E.coli K88)；中性蛋白酶酶解2h、3h、4h、5h、6h的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88均未出现抑菌圈，但是中性蛋白酶酶解1h的生物活性肽出现对普通的大肠杆菌高敏感的抑菌圈，其抑菌圈直径为14.81mm；胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解1h-6h均未出现抑菌圈。可初步判定胃蛋白酶酶解法可制备出具有较好抑菌性能的生物活性肽。
本发明测定了羊血来源生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88的最小抑菌浓度，其中，胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对沙门氏菌的最小抑菌浓度为18.27μg/mL；胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对沙门氏菌的最小抑菌浓度为18.27μg/mL；胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对E.coli K88的最小抑菌浓度为36.54μg/mL。胰蛋白酶生物活性肽酶解1-6h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88没有抑制效果，即无MIC值；中性蛋白酶生物活性肽酶解1-6h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88没有抑制效果，即无MIC值；木瓜蛋白酶生物活性肽酶解1-6h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88没有抑制效果，即无MIC值。综上所述，4种蛋白酶所制成的生物活性肽1-6h只有胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88有抑菌性，其余各个时间生物活性肽对于沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88均没有抑菌效果。可初步判定胃蛋白酶酶解3h可制备出具有较好抑菌性能的生物活性肽。
本发明进一步考察了3组羊血来源的复合生物活性肽体外抑菌效果，这3组复合生物活性肽分别如下：(1)胃蛋白酶酶解生物活性肽与中性蛋白酶酶解生物活性肽按照1：1的体积比组成的混合液；(2)胃蛋白酶酶解生物活性肽与木瓜蛋白酶酶解生物活性肽按照1：1的体积比组成的混合液；(3)木瓜蛋白酶酶解生物活性肽与中性蛋白酶酶解生物活性肽按照1：1的体积比组成的混合液；通过药敏纸片法初步验证复合蛋白酶酶解的生物活性肽对沙门氏菌和普通大肠杆菌抑菌性。
根据试验结果可见：胃蛋白酶与中性蛋白酶酶解3h、4h、5h、6h的复合生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌均未出现抑菌圈，但在酶解1h、2h出现对沙门氏菌、普通大肠杆菌敏感性较高的抑菌圈，其抑菌圈直径大小分别为11.68mm(1h，沙门氏菌)、13.71mm(2h，沙门氏菌)、10.48mm(1h，大肠杆菌)、12.32mm(2h，大肠杆菌)；胃蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解3h的复合生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌均未出现抑菌圈，但是胃蛋白酶与中性蛋白酶酶解1h、2h、4h、5h、6h的复合生物活性肽出现对沙门氏菌、普通的大肠杆菌高敏感的抑菌圈，其抑菌圈直径为9.36mm(1h，沙门氏菌)、12.85mm(2h，沙门氏菌)、9.21mm(4h，沙门氏菌)、11.86mm 5(5h，沙门氏菌)、15.06mm(6h，沙门氏菌)、10.86mm(1h，大肠杆菌)、12.38mm(2h，大肠杆菌)、11.84mm(4h，大肠杆菌)、10.01mm(5h，大肠杆菌)、9.89mm(6h，大肠杆菌)；木瓜蛋白酶与中性蛋白酶酶解1h-6h的复合生物活性肽均未出现抑菌圈，初步判定胃蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解法复合的生物活性肽可制备出具有较好抑菌性能的生物活性肽。
本发明进一步考察了羊血来源生物活性肽的体内抑菌效果，试验结果证明羊血来源生物活性肽具有体内抑菌和抗炎的作用。
本发明以羊血为原料利用酶水解法处理羊血血红蛋白得到具有抗菌性能的生物活性肽，对肽的抗菌性展开研究，拟为羊血来源生物活性肽在畜牧业中抗腹泻致病菌提供一定的基础数据，为羊血来源生物活性肽的开发利用提供一定的理论基础，对解决动物屠宰时血液对环境的污染以及提高动物血液饲料资源在畜牧业生产中的应用具有一定的经济价值和社会效益。
附图说明
图1胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶药敏纸片抑制沙门氏菌结果。
图2胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶药敏纸片抑制普通大肠杆菌结果
图3胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶药敏纸片抑制E.coli K88结果。
图4胃蛋白酶与中性蛋白酶复合酶药敏纸片抑制沙门氏菌结果。
图5胃蛋白酶与木瓜蛋白酶复合酶药敏纸片抑制沙门氏菌结果。
图6胃蛋白酶与中性蛋白酶复合酶药敏纸片抑制大肠杆菌结果。
图7胃蛋白酶与木瓜蛋白酶复合酶药敏纸片抑制大肠杆菌结果。
图8空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组的十二指肠切片。
图9空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组的空肠切片。
图10空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组的回肠切片。
图11生物活性肽对大鼠小肠TNF-A基因表达量的影响。
图12生物活性肽对大鼠小肠IL-6基因表达量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
试验例1羊血来源生物活性肽粗提液的制备及体外抑菌试验
1.样品来源
新鲜的羊血采自四子王旗某屠宰场。
2.试验方法
2.1分离羊血血红蛋白
取新鲜羊血加入由葡萄糖24.5g、柠檬酸8g、柠檬酸钠22g用1L蒸馏水混匀的抗凝剂，在4℃条件下以10000r/min离心10min，收集血红蛋白沉淀，加入等体积的去离子水混合均匀，超声波破碎10min后，在4℃条件下以4000r/min离心10min，收集洁净血红蛋白，在冻干机中进行冷冻干燥24h后碾碎成粉4℃保存备用。
2.2羊血来源生物活性肽粗提液的制备
按需要量计算生物活性肽体积，将血红蛋白粉用水溶解(血红蛋白粉质量为加水量的5％)，加酶量为血红蛋白粉质量的3％，分别添加胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在各酶最适作用条件下进行水解。同时进行4组试验，按其需要剂量添加。
按照胃蛋白酶活性、胰蛋白酶活性、中性蛋白酶活性、木瓜蛋白酶活性的最适温度和pH值分别在气浴摇床中以100r/min水解6h(按表1进行)，在试验进行中每隔1h测定反应体系pH值，维持反应体系的pH值在规定的范围内，若过酸时滴加NaOH(1moL/L)，过碱时滴加HCl(1moL/L)。
在反应体过程的1h、2h、3h、4h、5h、6h分别取样，反应结束后在沸水浴加热10min后，以4℃5000r/min离心10min，获得生物活性肽粗提液，4℃冷藏备用。
表1 4种蛋白酶的最适反应条件
2.3羊血来源生物活性肽的分离与纯化
获取生物活性肽粗提液后，将粗体液在室温下3500r/min离心5min，先过0.45μm除菌过滤器再过0.22μm除菌过滤器，将所得过滤液依次放入规格为10kDa、5kDa、2kDa超滤膜中过滤，接滤液，所得的液体为最终的生物活性肽。
2.4羊血来源生物活性肽体外抗菌试验
2.4.1受试菌株的培养及分离
①受试菌株的采集：仔鸡腹泻粪便样品中分离鉴定的沙门氏菌，羊粪便样品中分离鉴定的大肠杆菌和标准大肠杆菌菌株(血清型O149：K88)
②将采集的新鲜粪便样品称取1g置于EP管中并加入10ml生理盐水，振荡混匀。吸取200μl混合液置于山梨醇麦康凯氏琼脂培养基中37℃恒温培养18h。在培养皿中选取单个菌落挑入生理盐水中制作成菌悬液，吸取200μl菌悬液置于山梨醇麦康凯氏琼脂培养基中37℃恒温培养18h，根据伊红美蓝培养基的显色指示，初步确定为大肠杆菌和沙门氏菌。重复上述步骤3次，得到分离纯化后的沙门氏菌、大肠杆菌和标准大肠杆菌菌株(血清型O149：K88)。
2.4.2抑菌圈直径测定(药敏纸片法)
将胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶4种蛋白酶酶解羊血血红蛋白1-6h所得生物活性肽与生理盐水按照7:3的体积比混合，将生物活性肽进行稀释，将用生理盐水稀释后的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88进行抑菌试验。试验方法如下：
①药敏纸片的制备
用打孔器将定性滤纸打成直径为6mm的圆形纸片，将滤纸放入灭菌的广口瓶中，每瓶装入20片，分别70％的药液倒入对应瓶中，将广口瓶放入高压灭菌锅内高压灭菌(121℃，27分钟)。摇床37℃100r/min浸泡18h后，将多余的药液倒掉，放在烘箱中37℃下烘干，放在4℃的冰箱中保存备用。
②药敏试验步骤
将已培养好的沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88用灭菌的移液枪枪头挑取单个菌落于灭菌的生理盐水试管中，，吸取200μl菌悬液(0.5麦式比浊管浓度)置于培养皿中并倾倒山梨醇麦康凯氏琼脂培养基平板，趁培养基尚未凝固时，将菌悬液与液体培养基充分混合。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴药敏纸片，用无菌的镊子将药敏纸片贴在培养基上。每个平皿上贴6张药敏纸片，要将纸片与琼脂表面充分接触，已经贴下就不可再拿起，纸片间距离应不少于24mm，纸片中心距平板边缘不少于15mm。记录各种药敏纸片的位置。将平板置于在37℃恒温培养18-24h后取出，拍照后用ImageJ 1.8.0测量抑菌圈的直径，测量五次，计算其平均值即为实验结果。
2.4.3最小抑菌浓度的测定(MIC法)
将已培养好的沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88用移液枪枪头挑取单个菌落于试管中，用生理盐水稀释，直至生理盐水稀释后的浑浊程度与0.5麦氏比浊管浑浊程度相同。
采用微量肉汤二倍稀释法，测定4种酶酶解羊血血红蛋白6h所得生物活性肽对三种菌的最小抑菌浓度。在96孔板中第1-11孔中分别加入100μl EC肉汤，在第1孔加入液体生物活性肽原液100μl吹打混匀，然后吸取100μl至第2孔，混匀后再吸取100μl至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，并从第11孔中吸取100μl弃去，在每孔中加入100μl浓度为1×108CFU/ml菌悬液，第12孔中只加100μl EC肉汤和100μl浓度为1×108CFU/ml菌悬液作为空白对照。此时各孔药物浓度依次为生物活性肽蛋白浓度的1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625、0.001953125、0.0009765倍。将96孔板置于恒温培养箱中37℃恒温培养18h后,观察菌落生长情况，如果肉眼观察不明显还可加入5μlTTC显色剂，加入显色剂后于37℃恒温培养3h后观察颜色变化情况。
2.4.4羊血来源生物活性肽对3种菌细胞膜渗透性的影响
用生理盐水将已培养好的沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88用移液枪枪头挑取单个菌落于试管中，用生理盐水稀释，调整E.coli K88菌液浓度为1×10 6CFU/mL。在96孔板空白对照孔中加入200μL的菌悬液，之后分别加入10μL0.035mol/LONPG，再加入10μL的胃蛋白酶生物活性肽(E.coli K88的MIC浓度)。
在37℃下培养，分别测定10、30、60、90和120min时各孔溶液的OD415，每个时间点分别做3个平行试验，试验方案见表2。
表2羊血来源生物活性肽对3种菌细胞膜渗透性的影响试验方案
此外，当培养到60min时，室温4000r/min离心20min,测量上清液中每分钟生成的ONPG含量。公式为(A415×1000/样品体积(μL)/反应时间(min)×4.86,A415代表上清OD值，4.86为ONPG消光系数(cm/mM))。
2.4.5羊血来源生物活性肽对3种菌细胞表面疏水性的影响
羊血来源生物活性肽对3种菌细胞表面疏水性的影响试验方案见表3。称取37.5gEC肉汤,溶于1L蒸馏水中，充分混合使其溶解，高压灭菌锅灭菌(121℃，15分钟)将沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88于营养肉汤中培养至对数期，室温5000r离心10min，弃上清留菌体沉淀，用0.1mol/L灭菌PBS洗涤3次。然后将菌体沉淀重新悬浮于0.1mol/L KNO3中，调整浓度(AO)为1×106CFU/mL备用。(按表3加入各溶液)室温孵育10min，涡旋振荡2min，使各溶液充分的混合，静置15min后，待其分层，吸取上层液体置于96孔板中，每组重复3次，测定OD400(A1)值。以此计算3种菌对各溶剂的疏水性(粘附性)。
计算公式：E.coli疏水性(粘附性)＝(1-A1/A0)×100％。
表3羊血来源生物活性肽对3种菌细胞表面疏水性的影响试验方案
2.4.6羊血来源生物活性肽对3种菌培养液蛋白浓度的影响
用生理盐水将已培养好的沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88用移液枪枪头挑取单个菌落于试管中，用生理盐水稀释，调整菌悬液浓度为1×106CFU/mL。用制成浓度为1×106CFU/mL菌悬液，在EP管中调整菌悬液和生物活性肽的浓度为1MIC，在37℃、100rmp/min的气浴摇床中连续培养6h，放入摇床后开始计时，每隔1h取样一次，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白浓度，每组三个重复。
3.试验结果
3.1羊血来源生物活性肽对3种菌抑菌圈直径的影响
通过药敏纸片法初步验证4种蛋白酶酶解的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88的抑菌性。
表4 4种蛋白酶酶解生物活性肽抑制3种菌的抑菌圈直径(mm)
注：抑菌圈直径R≥15mm为极敏；10≤R＜15mm为高敏；8≤R＜10mm为低敏；R＜8mm；为不敏感表中的6mm为药敏纸片的直径大小
根据表4和图1-3的抑菌结果可见：胃蛋白酶酶解3h、4h、5h、6h的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88均未出现抑菌圈，但在酶解1h、2h出现对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88敏感性较高的抑菌圈，其抑菌圈直径大小分别为12.05mm(1h，沙门氏菌)、11.99mm(2h，沙门氏菌)、15.89mm(1h，大肠杆菌)、15.05mm(2h，大肠杆菌)、14.58mm(1h，E.coli K88)、14.83mm(2h，E.coli K88)；中性蛋白酶酶解2h、3h、4h、5h、6h的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88均未出现抑菌圈，但是中性蛋白酶酶解1h的生物活性肽出现对普通的大肠杆菌高敏感的抑菌圈，其抑菌圈直径为14.81mm；胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解1h-6h均未出现抑菌圈。可初步判定胃蛋白酶酶解法可制备出具有较好抑菌性能的生物活性肽。
3.2羊血来源生物活性肽对3种菌的最小抑菌浓度
4种蛋白酶所制成的生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88的最小抑菌浓度(即MIC)试验结果如表5所示，胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对沙门氏菌的最小抑菌浓度为18.27μg/mL；胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对沙门氏菌的最小抑菌浓度为18.27μg/mL；胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对E.coli K88的最小抑菌浓度为36.54μg/mL。胰蛋白酶生物活性肽酶解1-6h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88没有抑制效果，即无MIC值；中性蛋白酶生物活性肽酶解1-6h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88没有抑制效果，即无MIC值；木瓜蛋白酶生物活性肽酶解1-6h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88没有抑制效果，即无MIC值。综上所述，4种蛋白酶所制成的生物活性肽1-6h只有胃蛋白酶生物活性肽酶解3h对沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88有抑菌性，其余各个时间生物活性肽对于沙门氏菌、普通大肠杆菌和E.coli K88均没有抑菌效果。可初步判定胃蛋白酶酶解3h可制备出具有较好抑菌性能的生物活性肽。
表5羊血来源生物活性肽对3种菌的最小抑菌浓度
3.3羊血来源生物活性肽对3种菌细胞膜渗透性的影响
胃蛋白酶酶解3h生物活性肽对3种菌细胞膜渗透性的影响结果见表6。由表6可知，E.coli K88阴性对照组，由于只加入了菌液和生理盐水没有加入破坏细胞膜通透性的物质，表明在菌液中加入生理盐水没有破坏血清型E.coli K88的细胞膜，导致培养液中β-半乳糖苷酶活性含量最低(P＜0.01)。阳性对照组加入的是2％T-ritonX，对细胞膜具有极强的破坏性，因此导致E.coli K88的细胞膜破裂，β-半乳糖苷酶释放到培养液中，导致培养液中β-半乳糖苷酶活性含量最高(P＜0.01)。加入胃蛋白酶生物活性肽组由于对E.coli K88的细胞膜有破坏作用，与阴性对照和阳性对照有极显著差异(P＜0.01)。随时间的增加β-半乳糖苷酶释放到培养液中的数量越多，因此胃蛋白酶生物活性肽组由于对E.coli K88的细胞膜的破坏作用也随之增加。β-半乳糖苷酶释放量大小顺序表现为阳性对照组＞胃蛋白酶生物活性肽试验组＞阴性对照组。由表7、表8可见，胃蛋白酶酶解3h生物活性肽对沙门氏菌和普通大肠杆菌细胞膜渗透性的影响，与上述结果一致。
表6羊血来源生物活性肽对沙门氏菌细胞膜渗透性的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，其中大写字母表示时间差异，小写字母表示组间差异。同行数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
表7羊血来源生物活性肽对普通大肠杆菌细胞膜渗透性的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，其中大写字母表示时间差异，小写字母表示组间差异，。同行数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
表8羊血来源生物活性肽对E.coli K88细胞膜渗透性的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，其中大写字母表示时间差异，小写字母表示组间差异。同行数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
3.4羊血来源生物活性肽对E.coli K88细胞表面疏水性的影响
根据相似相溶原理，来确定胃蛋白酶生物活性肽酸碱性。由表9可知，胃蛋白酶实验组对E.coli K88的疏水性为99.18％，其对E.coli K88的疏水性均大于空白对照组(25.15％)、酸性对照组(75.85％)、碱性对照组(32.24％)，组间差异极显著(P＜0.01)，说明胃蛋白酶生物活性肽对E.coli K88粘附性高于酸性氯仿对E.coli K88粘附性，在表9中沙门氏菌和普通大肠杆菌实验组的疏水性均大于空白对照组、碱性对照组与酸性对照组且与酸性对照组无差异，因此确定胃蛋白酶生物活性肽均具有强酸性。
表9羊血来源生物活性肽对3种菌细胞表面疏水性的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差不显著(P>0.05)。3.5羊血来源生物活性肽对E.coli K88培养液蛋白浓度的影响
羊血来源生物活性肽对血清型E.coli K88、普通大肠杆菌、沙门氏菌培养液中蛋白含量的影响见表10，由表10可知，胃蛋白酶酶解3h生物活性肽蛋白浓度为146.15±2.56μg/mL，生物活性肽可以破坏细胞的完整性，导致E.coli K88、普通大肠杆菌、沙门氏菌菌体中的蛋白质外泄到培养液中，使培养液中的蛋白浓度高于生物活性肽浓度。且随时间的增加，E.coli K88、普通大肠杆菌、沙门氏菌细胞膜被破坏的数量也随之上升，到6h时，培养液中的蛋白质含量分别达到175.77±10.95μg/mL、169.30±0.029μg/mL、173.90±0.057μg/mL。
表10羊血来源生物活性肽对3种菌培养液中蛋白浓度的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同行数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。试验例2羊血来源的复合生物活性肽体外抑菌试验
1.试验材料
生物活性肽、定性滤纸、沙门氏菌、普通大肠杆菌、灭菌的生理盐水、伊红美兰培养基、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、广口瓶、灭菌的镊子、灭菌的枪头
2.试验方法
2.1.药敏纸片的制备
2.1.1复合酶药液的配制
胃蛋白酶酶解生物活性肽与中性蛋白酶酶解生物活性肽按照1：1的体积比组成的混合液：生理盐水＝7：3；
胃蛋白酶酶解生物活性肽与木瓜蛋白酶酶解生物活性肽按照1：1的体积比组成的混合液：生理盐水＝7：3；
木瓜蛋白酶酶解生物活性肽与中性蛋白酶酶解生物活性肽按照1：1的体积比组成的混合液：生理盐水＝7：3；
2.1.2药敏纸片的制备
用打孔器将定性滤纸打成直径为6mm的圆形纸片，将滤纸放入灭菌的广口瓶中，每瓶装入20片，分别将复合酶的药液倒入对应瓶中，将广口瓶放入高压灭菌锅内高压灭菌(121℃，27分钟)。摇床37℃100r/min浸泡18h后，将多余的药液倒掉，放在烘箱中37℃下烘干，放在4℃的冰箱中保存备用。
2.2药敏试验步骤
将已培养好的沙门氏菌和普通大肠杆菌用灭菌的移液枪枪头挑取单个菌落于灭菌的生理盐水试管中，吸取200μl菌悬液(0.5麦式比浊管浓度)置于培养皿中并倾倒山梨醇麦康凯氏琼脂培养基平板，趁培养基尚未凝固时，将菌悬液与液体培养基充分混合。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴药敏纸片，用无菌的镊子将药敏纸片贴在培养基上。每个平皿上贴7张药敏纸片，要将纸片与琼脂表面充分接触，已经贴下就不可再拿起，纸片间距离应不少于24mm，纸片中心距平板边缘不少于15mm。记录各种药敏纸片的位置。将平板置于在37℃恒温培养18-24h后取出，拍照后用ImageJ1.8.0测量抑菌圈的直径，测量三次，计算其平均值即为实验结果。
3.试验结果
通过药敏纸片法初步验证复合蛋白酶酶解的生物活性肽对沙门氏菌和普通大肠杆菌抑菌性。
表11羊血来源生物活性肽(复合酶)体外抗沙门氏菌、大肠杆菌抑菌圈直径(mm)
注：其中数值＝6为没有抑菌圈出现，数值>6为有抑菌圈出现
根据表11以及图4-7的试验结果可见：胃蛋白酶与中性蛋白酶酶解3h、4h、5h、6h的复合生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌均未出现抑菌圈，但在酶解1h、2h出现对沙门氏菌、普通大肠杆菌敏感性较高的抑菌圈，其抑菌圈直径大小分别为11.68mm(1h，沙门氏菌)、13.71mm(2h，沙门氏菌)、10.48mm(1h，大肠杆菌)、12.32mm(2h，大肠杆菌)；胃蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解3h的复合生物活性肽对沙门氏菌、普通大肠杆菌均未出现抑菌圈，但是胃蛋白酶与中性蛋白酶酶解1h、2h、4h、5h、6h的复合生物活性肽出现对沙门氏菌、普通的大肠杆菌高敏感的抑菌圈，其抑菌圈直径为9.36mm(1h，沙门氏菌)、12.85mm(2h，沙门氏菌)、9.21mm(4h，沙门氏菌)、11.86mm(5h，沙门氏菌)、15.06mm(6h，沙门氏菌)、10.86mm(1h，大肠杆菌)、12.38mm(2h，大肠杆菌)、11.84mm(4h，大肠杆菌)、10.01mm(5h，大肠杆菌)、9.89mm(6h，大肠杆菌)；木瓜蛋白酶与中性蛋白酶酶解1h-6h的复合生物活性肽均未出现抑菌圈，可初步判定胃蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解法复合的生物活性肽可制备出具有较好抑菌性能的生物活性肽。
试验例3生物活性肽体内抑菌试验
1.试验动物
昆明大鼠购于内蒙古大学试验动物中心，选用体重在180-210g之间，体况健康的大鼠用于动物试验。4.1.2试验试剂及耗材
16号灌胃针、生理盐水、石蜡、甲醛、无水乙醇、二甲苯、RNA Mini-Preps Kit试剂盒、反转录试剂盒、Bouins固定液、苏木精、分化液、伊红、酒精、封片剂、病理级粘附载玻片、盖玻片。
2.试验方法
2.1E.coli K88菌悬液的制备
将保存好的E.coli K88倒入平板内于37℃培养18h后，用移液枪枪头挑取单个菌落并用生理盐水稀释制成浓度为1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL的E.coli K88菌悬液，标记后于4℃保存备用。
2.2腹泻大鼠粪便中菌落数量的测定
收集约0.1g大鼠粪便于无菌EP管中，加入1ml生理盐水混匀，静置30min，吸取澄清的上清液100μL，加入900μL生理盐水稀释，依上述方法稀释3-7次，吸取103-106粪便混合液100μL，倒平板37℃培养18h，用平板计数法测定腹泻大鼠粪便中菌落数量。
2.3大鼠体内抑菌试验
2.3.1试验动物分组
将30只体况良好、体重相当的4周龄昆明大鼠随机分为5个试验组即(空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、试验1组、试验2组)，每组6只大鼠，具体给药方案见表12。其中空白对照组自由采食不作任何处理；阴性对照组灌服3×108CFU/mL浓度的E.coli K88菌悬液；阳性对照组灌服胃蛋白酶生物活性肽；试验1组为生物活性肽治疗组，灌服建立腹泻模型最佳浓度大肠杆菌菌悬液，用生物活性肽治疗大鼠腹泻；试验2组为生物活性肽保健组从试验期开始灌服生物活性肽。饲喂期35d结束后采集粪样、肠道及其他组织的样品进行各项指标的检测。
表12给药方案
2.3.2大鼠采食量的测定试验方法
大鼠每日早9：30称取剩料量及给料量，计算出采食量。
2.3.3大鼠体重的测定试验方法
大鼠每隔5d称重一次。
2.3.4大鼠粪便中菌落数量的测定
收集约0.1g大鼠粪便于无菌EP管中，加入1ml生理盐水混匀，静置30min，吸取澄清的上清液100μL，加入900μL生理盐水稀释，依上述方法稀释3-7次，吸取103-106粪便混合液100μL，倒平板37℃培养18h，用平板计数法测定腹泻大鼠粪便中菌落数量。
2.3.5大鼠血液常规的测定
将大鼠断尾采集血液，测定血常规。
2.3.6取样及样品的处理
屠宰前采集大鼠粪便，将大鼠脱臼致死，从颌下正中剖开，挑断颈部动脉收集全身血液，放入采血管中用于血液常规指标的测定，剖开腹腔，将肠道组织取出，一半置于10％福尔马林固定，用于石蜡切片；另一半置于冻存管中-80℃备用，后续用于TNF-α和IL-6基因表达量的测定。剖开胸腔，取脾脏和胸腺称重计算脏器指数。
2.3.7脾脏、胸腺指数的测定
称取大鼠脾脏、胸腺以及宰前活重计算脏器指数，计算公式如下：
脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(g),
胸腺重量＝胸腺重量(mg)/体重(g)。
2.3.8肠道组织切片
①将大鼠的十二指肠、空肠、回肠取样固定于10％福尔马林溶液中，冲洗修块后包埋，于显微镜下观察肠道的组织型态的变化。
②将采集的大鼠肠道样品在Bouins固定液浸泡38-48h。
将肠道组织切成1.5cm长的组织块，进行梯度脱水，6h梯度脱水乙醇浓度和时间分别为：75％乙醇0.5h、75％乙醇1.5h、80％乙醇1h、85％乙醇1h、95％乙醇1h，无水乙醇1h。
③将脱水后的肠道组织块进行浸蜡，放入事先融化好的液体石蜡中进行组织包埋。待石蜡凝固成形后，修整蜡块后，使用切片机对已包埋好的组织蜡块切片(厚度为7μm)，将切好的石蜡切片在40℃温水中展开，用载玻片粘片，室温晾干备用。
④HE染色：将已经粘好的切片在二甲苯中透明两次，每次各5min，进行脱蜡；按照无水乙醇5min，95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、蒸馏水的顺序依次将已经粘好的切片脱蜡各2min；充分洗掉二甲苯，孵育苏木精染液6min，自来水冲洗10min，分化液中浸泡1min，50℃温水浸泡5min，孵育伊红染液染3-5min。自来水浸泡5min，95％乙醇浸泡两次，每次各1min，无水乙醇浸泡两次，每次各1min，二甲苯中浸泡两次，每次各1min，最终使用中性树胶封片进行显微镜观察并进行图像采集，并使用ImageJ 1.8.0测量小肠绒毛长度及隐窝深度。
2.3.9胃蛋白酶生物活性肽对大鼠小肠TNF-α和IL-6基因表达量的影响
根据Y-R(Y-R,Jiang,J-Y.miRNA-130a improves cardiac function by down-regulating TNF-αexpression in a rat model of heart failure[J].European Reviewfor Medical&Pharmacological Sciences,2018(22):8454-8461.)在MicroRNA(miRNA)-130α对大鼠心脏功能对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响的研究和Gwenaelle(Gwenaelle Begue,Aymeric Douillard,Olivier Galbes,et al.Early Activation ofRat Skeletal Muscle IL-6/STAT1/STAT3 Dependent Gene Expression in ResistanceExercise Linked to Hypertrophy[J].PLoS ONE,2013,(2):1-12.)在大鼠骨骼肌IL-6/STAT1/STAT3依赖性基因表达的早期激活与肥大相关基因的表达,目的基因引物序列见表13。
表13目的基因的引物序列
2.3.9.1大鼠小肠总RNA的提取与鉴定
取适量大鼠小肠组织于液氮中研磨；使用RNA Mini-Preps Kit裂解小肠组织，提取总RNA；Nanodrop直接检测RNA浓度及OD值在1.8-2.0之间，RNA完整性好，适于进行后续试验。
2.3.9.2 Q-PCR测定大鼠小肠TNF-α和IL-6基因表达量
将上述提取RNA逆转录为cDNA；充分混匀，在实时定量PCR仪中进行扩增反应，反应体系见表16。反应条件为：95℃预变性30sec，95℃变性5sec，600C延伸30sec，40个循环；60℃延伸退火。基因定量都采用相对定量(2-△△Ct法)计算表达水平。
表14Realtime反应
3数据分析
用Excel 2007软件进行数据整理，SAS 9.2对数据进行分析整合，使用Prism 6对RT-PCR的结果进行分析。
4试验结果
4.1大鼠采食量测定试验结果
试验期大鼠采食量由表15可得，0-5d时5个试验组单只平均采食量无显著性差异(P>0.05)；6-10d时5个试验组单只平均采食量无显著性差异(P>0.05)；11-15d时5个试验组单只平均采食量无显著性差异(P>0.05)；16-20d时5个试验组单只平均采食量无显著性差异(P>0.05)；21-25d时试验2组单只采食量显著高于其他4个试验组。
表15试验期采食量
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)
4.2大鼠体重的测定试验结果
试验期大鼠体重由表16可得，大鼠在35d试验期内的体重变化。5个试验组大鼠体重均随时间的延长而增高，在实验初期5个试验组大鼠体重保持一致，且在第35d都达到了最高，且各试验组之间无显著差异(P>0.05)。
表16试验期体重
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。4.3大鼠粪便中菌落数量的测定
试验期大鼠粪便中的菌落数由表17可得，试验期第10d粪便菌落数量5个处理组差异极显著(P＜0.01)，阴性对照组和试验1组最高分别为32.50±1.94、29.00±3.27，且无显著性差异(P>0.05)，阳性对照组和试验2组分别为4.61±1.53、12.00±3.33，且无显著性差异(P>0.05)，空白对照组与阴性对照组和试验1组、阳性对照组和试验2组相比较差异极显著(P＜0.01)；在试验的第15d与第10d差异性相同。在试验的第25d与第35d时，阴性对照组与其他4个试验组差异极显著(P＜0.01)。这是由于试验1组和阴性对照组前15d灌服浓度为3×108CFU/mL的E.coli K88菌悬液，导致粪便中的菌落数较多，与其它3个试验组组差异极显著(P＜0.01)，阳性对照组与实验2组灌服羊血来源生物活性肽，差异不显著，空白对照组进行自由采食肠道菌群完善，导致粪便中菌落数最低。15d之后只有阴性对照组灌服浓度为3×108CFU/mL的E.coli K88菌悬液，故与其他不灌服菌悬液的试验组相比差菌落数异极显著(P＜0.01)。
表17大鼠粪便中菌落数量的测定
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
4.4血常规测定结果
15d内采集大鼠血液进行血常规检测，结果见表18，在第0d时，因为在试验起始点，血常规各项数值无差异；随着试验的进行，在第15d，血常规各项指标数值上均有上升的趋势，但试验组之间的血常规数值无显著差异(P>0.05)，说明灌服E.coli K88菌悬液对大鼠的血常规指标无显著影响。
表18血常规测定结果
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同行数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，无肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。4.5脾脏和胸腺指数的测定结果
由表19可知，空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、试验1组与试验2组的脾脏、胸腺重量和指数无显著性差异(P＞0.05)，表明为大鼠灌服生物活性肽对大鼠的脏器指数无显著影响。
表19脾脏、胸腺的重量和指数测定结果
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
4.6肠道组织切片观察结果
肠道组织切片观察结果如图8、9、10所示，在低倍镜(10×40)下，空白对照组的空肠绒毛长度正常，且形态结构完整；阴性对照组由于灌服E.coli K88菌悬液导致肠绒毛较其他处理组长度偏短，绒毛变细并且出现明显的缺失、变形以及断裂的情况；阳性对照组由于灌服生物活性肽，十二指肠、空肠、回肠绒毛结构完整、绒毛没有缺失和明显的断裂情况；但是试验1组的空肠绒毛变短肠壁变薄、试验2组的空肠绒毛长度与空白对照组长度一致，形态结构也无损伤的现象。这些切片结果表明，生物活性肽就小肠整体来说有治疗作用，可以提高肠绒毛的长度和结构的完整程度，对于E.coli K88导致的肠绒毛结构断裂有治疗作用。
羊血来源生物活性肽对大鼠小肠绒毛长度的影响如表20所示，由于阴性对照组灌服菌悬液对肠道绒毛具有一定破坏作用，十二指肠绒毛长度显著低于其他4个处理组(P<0.05)，空白对照组不作任何处理，阳性对照组与试验2组前15d均灌服羊血来源生物活性肽，生物活性肽对肠道绒毛具有一定的保护作用，所以3个组之间无显著性差异(P>0.05)；，由于阴性对照组灌服菌悬液对肠道绒毛具有一定破坏作用，空肠与回肠绒毛长度显著低于其他其他4个处理组(P<0.05)，空白对照组不作任何处理，空肠与回肠绒毛长度显著高于其他4个处理组(P<0.05)，阳性对照组与试验2组前15d均灌服羊血来源生物活性肽，空肠与回肠绒毛长度无显著性差异(P>0.05)。
表20羊血来源生物活性肽对大鼠小肠绒毛长度的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
羊血来源生物活性肽对大鼠小肠隐窝深度的影响如表21所示，其中十二指肠的隐窝深度阴性对照组显著高于其他4个处理组(P<0.05)，阳性对照组数值上最低但与试验1组和试验2组无显著性差异(P>0.05)；空肠与回肠的隐窝深度阴性对照组显著高于其他4个处理组(P<0.05)，阳性对照组显著低于其他4个处理组(P>0.05)，这说明为大鼠灌服生物活性肽可提高细胞的分泌功能及细胞成熟度，为大鼠灌服菌悬液则反之。
表21羊血来源生物活性肽对大鼠小肠隐窝深度的影响
注：表中数据用(Mean±Sd)表示，同列数字肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。4.7生物活性肽对大鼠小肠TNF-α和IL-6基因表达量的影响
由图11可知，阴性对照组TNF-α表达量显著高于空白对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组(P<0.05)，而空白对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组组间差异不显著(P＞0.05)，这表明为大鼠灌服生物活性肽可降低大鼠小肠内的炎症，从而使小肠内TNF-α的表达量降低。IL-6是炎症性疾病及感染程度的检测指标,由图12可知阴性对照组TNF-α表达量显著高于空白对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组(P<0.05)，而空白对照组、阳性对照组、试验1组和试验2组组间差异不显著(P＞0.05)这表明为大鼠灌服生物活性肽可降低大鼠小肠内的炎症，从而使小肠内IL-6的表达量降低。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古农业大学
<120> 具有抑菌功能的生物活性肽、复合生物活性肽及其制备方法和用途
<130> NM-1001-200907A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
cagaccctca cactcagatc atc 23
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<212> DNA
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cggagtcaac ggatttggtc gtat 24
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<400> 6
agccttctcc atggtggtga agac 24