一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法
阅读说明：本技术 一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法 (Preparation method of hemoglobin control freeze-dried product ) 是由 莫海飞 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法。该方法,包括如下步骤：(1)向pH值为4.0～8.2的缓冲剂中依次加入多元醇类保护剂、氨基酸保护剂和糖类保护剂,得到血红蛋白质控品稀释液；(2)向步骤(1)得到的血红蛋白质控品稀释液中加入血红蛋白质控品样品,得到血红蛋白质控品溶液,血红蛋白质控品样品与缓冲剂的体积比为0.0005:1；(3)将步骤(2)得到的血红蛋白质控品溶液进行冷冻干燥得到血红蛋白质控品冻干品,冷冻干燥的条件为：温度为-60℃～-30℃,压力为1～30Pa,时间为12～36小时。本发明提出的血红蛋白质控品冻干品的制备方法,操作简单方便；得到的血红蛋白质控品冻干粉质控品瓶间差小于15％,质控品精密性CV小于15％,且血红蛋白质控品可稳定冷藏6个月。(The invention discloses a preparation method of a freeze-dried hemoglobin control product. The method comprises the following steps: (1) sequentially adding a polyol protective agent, an amino acid protective agent and a saccharide protective agent into a buffering agent with the pH value of 4.0-8.2 to obtain a hemoglobin quality control product diluent; (2) adding a hemoglobin quality control sample into the hemoglobin quality control diluent obtained in the step (1) to obtain a hemoglobin quality control solution, wherein the volume ratio of the hemoglobin quality control sample to the buffer is 0.0005: 1; (3) and (3) freeze-drying the hemoglobin control solution obtained in the step (2) to obtain a freeze-dried hemoglobin control product, wherein the freeze-drying conditions are as follows: the temperature is-60 ℃ to-30 ℃, the pressure is 1 Pa to 30Pa, and the time is 12 hours to 36 hours. The preparation method of the hemoglobin control freeze-dried product provided by the invention is simple and convenient to operate; the difference between the quality control product bottles of the obtained hemoglobin control product freeze-dried powder is less than 15 percent, the precision CV of the quality control product is less than 15 percent, and the hemoglobin control product can be stably refrigerated for 6 months.)
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法。
背景技术
在溶液状态下，血红蛋白非常不稳定，在自然条件下，如溶氧、光照、加热等条件下，可发生氧化和自氧化，使血红蛋白结构发生改变，由亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，进而失去携氧能力。研究表明，经真空冷冻干燥的血红蛋白更加稳定，不易被氧化，结构更加稳固，因此可通过真空冷冻干燥的方法使血红蛋白达到长期保存的目的。血红蛋白质控品用于质量控制，对质控品产品自身要求较高，作为质控品，必须具有良好的精密性、瓶间差和稳定性等的特点。目前，在诊断试剂行业，保证诊断试剂的质量是重要的一环，因而质控品成为不可或缺的一部分，因此，市面上对质控品的需求与日俱增。血红蛋白质控品不稳定的同时还要兼顾其精密性、瓶间差，大大增加了血红蛋白质控品制备的技术难度。
发明内容
本发明提供了一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法，本发明旨在提供的血红蛋白质控品冻干品精密性＜15％，瓶间差＜15％，可-20℃条件下储藏6个月以上，为血红蛋白诊断试剂检测提供稳定的和性能良好的质控品。
本发明的目的是提出了一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法，包括如下步骤：
(1)向pH值为4.0～8.2的缓冲剂中依次加入多元醇类保护剂、氨基酸保护剂和糖类保护剂，得到血红蛋白质控品稀释液，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为1％-10％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为1％-10％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为1％-10％；
(2)向步骤(1)得到的血红蛋白质控品稀释液中加入血红蛋白质控品样品，得到血红蛋白质控品溶液，血红蛋白质控品样品与缓冲剂的体积比为0.0005:1；
(3)将步骤(2)得到的血红蛋白质控品溶液进行冷冻干燥得到血红蛋白质控品冻干品，冷冻干燥的条件为：温度为-60℃～-30℃，压力为1～30Pa，时间为12～36小时。
本发明通过加入合适pH值的缓冲剂调整血红蛋白质控品的配方，加入多元醇类保护剂、氨基酸保护剂和糖类保护剂，真空冷冻干燥后得到血红蛋白质控品冻干品。该血红蛋白质控品冻干品质控品瓶间差小于15％；质控品精密性CV小于15％；且血红蛋白质控品可稳定冷藏6个月。上述的血红蛋白质控品样品可以是高值质控品或低值质控品。
优选地，步骤(1)中缓冲剂的pH值为7.0～8.0，所述的缓冲剂选自硼酸、磷酸、三羟基甲氨基甲烷、硼酸盐和磷酸盐中的一种以上。
在本发明中，缓冲剂使血红蛋白质控品的pH值可以稳定地维持在某个范围，在极端的酸或碱条件下可能会破坏血红蛋白的稳定性，因而优选中性范围的pH值。温度是影响pH的重要因素，据研究表明，含钠盐的稀释液为pH 7.0，在-40℃的情况下，pH值仅为5.4，血红蛋白遭到破坏，而钾盐在-40℃的情况下，稀释液的pH相对稳定，缓冲剂优选为磷酸钾。
优选地，步骤(1)所述的缓冲剂的摩尔浓度为10～200mmol/L。
优选地，步骤(1)所述的多元醇类保护剂选自甘油、木糖醇、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇中的一种以上。生物制品的低温预冻、冷冻干燥以及保存过程中，使用较多的是多元醇包括丙三醇(甘油)、山梨醇和甘露醇，由于多元醇的官能团是羟基，它们用作低温保护剂、冷冻干燥保护剂和塑形剂。
优选地，步骤(1)所述的氨基酸保护剂选自甘氨酸、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽中的一种以上。氨基酸的添加有利于血红蛋白活性的维持，由于氨基酸离子具有酸、碱两性，因此能够在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中能抑制溶液的pH变化，从而达到保护活性组分的目的。
优选地，步骤(1)所述的糖类保护剂选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖和麦芽糖中的一种以上。在生物制品的冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤其是二糖作为保护剂，这是因为二糖既能在冻结过程中起到低温保护剂的功能；又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。
优选地，步骤(3)所述的冷冻干燥的条件为：-60℃～-30℃的温度下预冻3～5小时后成型，冷冻抽真空8-15小时，冻干压力1～30pa。
优选地，所述的血红蛋白质控品冻干品瓶间差小于15％，质控品精密性CV小于15％。本发明提出的质控品包含有高值质控品和低值质控品两个浓度，提供应用了上述血红蛋白诊断试剂血红蛋白质控品的免疫学测定方法。作为免疫学测定方法，可以列举例如胶体金凝集反应法、免疫层析法、ELISA法或免疫荧光法等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提出的血红蛋白质控品冻干品的制备方法，操作简单方便；得到的血红蛋白质控品冻干粉质控品瓶间差小于15％，质控品精密性CV小于15％，且血红蛋白质控品可稳定冷藏6个月。
2、本发明通过使缓冲剂、血红蛋白保护剂共存于含有血红蛋白质控品冻干品的样品中，可以稳定地维持血红蛋白不被降解且精密性良好，可以适用于血红蛋白免疫诊断试剂的质量控制。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明使用的设备和试剂为本技术领域常规市购产品。本发明提出的血红蛋白质控品购自sigama公司，lot：SLCC1154。
实施例1
分别配制摩尔浓度为100mM pH7.4缓冲剂硼酸钾、磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷。硼酸钾、磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷各取10mL分别依次编号为1#，2#，3#，其中以10mL纯化水为缓冲剂作为对照试验组，编号为4#。向上述溶液1#、2#、3#、4#中依次加入多元醇类保护剂、氨基酸保护剂和糖类保护剂，分别得到血红蛋白质控品稀释液1#、2#、3#、4#，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％。多元醇类保护剂为山梨醇和聚乙二醇的混合物，山梨醇和聚乙二醇的质量比为1:1，氨基酸保护剂为甘氨酸，糖类保护剂为蔗糖。向血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#分别加入0.005mL血红蛋白质控品样品形成血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#。
按照预设定的冻干程序对上述得到血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#进行冷冻干燥，预设冻干程序为：-40℃先预冻5小时，再以-40℃冷冻抽真空3小时，-20℃冷冻抽真空3小时，0℃冷冻抽真空2小时，10℃冷冻抽真空2小时；分别检测冻干前后的质控品的差异，计算残存率。
血红蛋白质控品的浓度使用免疫学血红蛋白测定试剂，使用粪便血红蛋白检测试剂盒，用干式免疫荧光分析仪进行测定，得到的测定结果如表1所示。
表1
缓冲剂
血红蛋白质控品冻干前(μg/g)
血红蛋白质控品冻干后(μg/g)
残存率(％)
硼酸钾
63.56
7.5
18.8
磷酸钾
123.73
109.81
88.75
三羟甲基氨基甲烷
112.90
87.35
77.37
纯化水
85.27
8.9
10.44
由表1得出，对于上述血红蛋白质控品溶液，与对照试验组相比较，添加100mMpH7.4的硼酸钾、磷酸钾、三羟甲基氨基甲烷作为血红蛋白质控品的缓冲剂，血红蛋白质控品冻干品的保护效果显著；其中，血红蛋白质控品冻干后，硼酸钾残存率为18.8％、磷酸钾残存率为88.75％、三羟甲基氨基甲烷残存率为77.37％。可知，磷酸缓冲剂在实施例1条件下对血红蛋白质控品的保护效果显著，磷酸钾为最优选缓冲剂。
实施例2
取10mL 100mM pH7.4磷酸钾五份，五份磷酸钾溶液依次编号为1#，2#，3#，4#，5#。
分别向上述1#，2#，3#，4#溶液依次加入多元醇类保护剂、氨基酸保护剂和糖类保护剂，得到血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％。其中1#磷酸钾溶液中加入甘油；2#磷酸钾溶液中加入木糖醇；3#磷酸钾溶液中加入甘露醇；4#磷酸钾溶液中加入山梨醇和聚乙二醇混合物，山梨醇和聚乙二醇的质量比为1:1；向5#磷酸钾溶液中依次加入纯化水、氨基酸保护剂和糖类保护剂作为对照组，得到血红蛋白质控品稀释液5#，血红蛋白质控品稀释液5#中纯化水在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％。
血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，5#中氨基酸保护剂为甘氨酸，糖类保护剂为蔗糖。向1#，2#，3#，4#，5#血红蛋白质控品稀释液分别加入0.005mL血红蛋白质控品样品形成血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#，5#。
按照设定的冻干程序对上述得到的血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#，5#进行冷冻干燥，预设冻干程序为：预冻5小时，-40℃冷冻抽真空3小时，-20℃冷冻抽真空3小时，0℃冷冻抽真空2小时，10℃冷冻抽真空2小时；分别检测冻干前后的质控品的差异，计算残存率。
血红蛋白质控品的浓度使用免疫学血红蛋白测定试剂，使用粪便血红蛋白检测试剂盒,用干式免疫荧光分析仪进行测定，测定结果如表2所示。
表2
多元醇保护剂
血红蛋白质控品冻干前(μg/g)
血红蛋白质控品冻干后(μg/g)
残存率(％)
甘油
114.90
77.62
67.55
木糖醇
112.54
92.13
81.87
甘露醇
114.80
100.49
87.53
山梨醇+聚乙二醇
123.73
109.81
88.75
纯化水
115.67
37.94
32.80
由表2得出，对于上述的血红蛋白质控品溶液，与试验对照组相比较，添加甘油、木糖醇、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇混合物作为冻干稀释液的血红蛋白保护剂，血红蛋白质控品的保护效果显著；其中，血红蛋白质控品冻干后，甘油保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为67.55％、木糖醇保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为81.87％、甘露醇保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为87.53％、山梨醇和聚乙二醇混合物保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为88.75％、含纯化水保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为32.80％。可知，多元醇类血红蛋白保护剂山梨醇在实施例2条件下对血红蛋白质控品的保护效果显著，山梨醇和聚乙二醇的混合物为最优选多元醇保护剂。
实施例3
取10mL 100mM pH7.4磷酸钾五份，各磷酸钾溶液依次编号为1#，2#，3#，4#，5#。
分别向上述1#，2#，3#，4#溶液依次加入多元醇保护剂、氨基酸保护剂和糖类保护剂，得到血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％。其中1#磷酸钾溶液中加入甘氨酸，2#磷酸钾溶液中加入半胱氨酸，3#磷酸钾溶液中加入N-乙酰半胱氨酸，4#磷酸钾溶液中加入谷胱甘肽，向5#磷酸钾溶液中依次加入多元醇保护剂、纯化水和糖类保护剂作为对照组，得到血红蛋白质控品稀释液5#，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，纯化水在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％。
血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，5#中多元醇保护剂为山梨醇和聚乙二醇混合物，山梨醇和聚乙二醇的质量比为1:1，糖类保护剂为蔗糖。向血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，5#分别加入0.005mL血红蛋白质控品样品形成血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#，5#。
按照设定的冻干程序对上述得到的血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#，5#进行冷冻干燥，预设冻干程序为：预冻5小时，-40℃冷冻抽真空3小时，-20℃冷冻抽真空3小时，0℃冷冻抽真空2小时，10℃冷冻抽真空2小时；分别检测冻干前后的质控品的差异，计算残存率。
血红蛋白质控品的浓度使用免疫学血红蛋白测定试剂，使用粪便血红蛋白检测试剂盒,用干式免疫荧光分析仪进行测定，测定结果如表3所示。
表3
氨基酸保护剂
血红蛋白质控品冻干前(μg/g)
血红蛋白质控品冻干后(μg/g)
残存率(％)
甘氨酸
123.73
109.81
88.75
半胱氨酸
111.58
96.44
86.43
N-乙酰半胱氨酸
115.33
88.26
76.53
谷胱甘肽
110.81
85.35
77.02
纯化水
78.49
14.36
18.29
由表3得出，对于上述的血红蛋白质控品溶液，与试验对照组相比较，添加甘氨酸、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽作为冻干稀释液的保护剂，血红蛋白质控品的保护效果显著；其中，血红蛋白质控品冻干后，甘氨酸保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为88.75％、半胱氨酸保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为86.43％、N-乙酰半胱氨酸保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为76.53％、谷胱甘肽保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为77.02％、纯化水保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为18.29％。可知，氨基酸类血红蛋白保护剂甘氨酸在实施例3条件下对血红蛋白质控品的保护效果显著，甘氨酸为最优选氨基酸保护剂。
实施例4
取10mL 100mM pH7.4磷酸钾六份，各溶液依次编号为1#，2#，3#，4#，5#，6#。
分别向上述1#，2#，3#，4#，5#溶液依次加入多元醇保护剂、氨基酸类保护剂和糖类保护剂，得到血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，5#，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％，糖类保护剂在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为2％。其中1#磷酸钾溶液中加入蔗糖；2#磷酸钾溶液中加入葡萄糖；3#磷酸钾溶液中加入海藻糖；4#磷酸钾溶液中加入乳糖；5#磷酸钾溶液中加入麦芽糖；向6#磷酸钾溶液中依次加入多元醇保护剂、氨基酸类保护剂和纯化水作为对照组，得到血红蛋白质控品稀释液6#，多元醇类保护剂在血红蛋白质控品稀释液6#中质量分数为2％，氨基酸保护剂在血红蛋白质控品稀释液6#中质量分数为2％，纯化水在血红蛋白质控品稀释液6#中质量分数为2％。
各稀释液多元醇保护剂为山梨醇和聚乙二醇混合物，山梨醇和聚乙二醇的质量比为1:1，氨基酸保护剂为甘氨酸。向血红蛋白质控品稀释液1#，2#，3#，4#，5#，6#分别加入0.005mL血红蛋白质控品样品形成血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#，5#，6#。
按照设定的冻干程序对上述得到的血红蛋白质控品溶液1#，2#，3#，4#，5#，6#进行冷冻干燥，预设冻干程序为：预冻5小时，-40℃冷冻抽真空3小时，-20℃冷冻抽真空3小时，0℃冷冻抽真空2小时，10℃冷冻抽真空2小时；分别检测冻干前后的质控品的差异，计算残存率。
血红蛋白质控品的浓度使用免疫学血红蛋白测定试剂，使用粪便血红蛋白检测试剂盒,用干式免疫荧光分析仪进行测定，测定结果如表4所示。
表4
由表4得出，对于上述得到的血红蛋白质控品溶液，与试验对照组相比较，添加蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖作为糖类保护剂，血红蛋白质控品的保护效果显著；其中，血红蛋白质控品冻干后，蔗糖保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为88.75％、葡萄糖保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为78.86％、海藻糖保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为75.58％、乳糖保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为76.60％、麦芽糖保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为79.38％、纯化水保护剂的血红蛋白质控品溶液的血红蛋白残存率为52.27％。可知，糖类血红蛋白保护剂蔗糖在实施例4条件下对血红蛋白质控品的保护效果显著，蔗糖为最优选蔗糖保护剂。
实施例5
取10mL 100mM pH7.4磷酸钾，依次加入山梨醇和聚乙二醇混合物、甘氨酸和蔗糖，得到血红蛋白质控品稀释液，山梨醇和聚乙二醇混合物在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为1％，甘氨酸在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为1％，蔗糖在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为1％，山梨醇和聚乙二醇的质量比为1:1。向血红蛋白质控品稀释液中加入0.005mL血红蛋白质控品样品，得到血红蛋白质控品溶液。
按照设定的冻干程序对上述得到的血红蛋白质控品溶液进行冷冻干燥，预设冻干程序为：预冻5小时，-40℃冷冻抽真空3小时，-20℃冷冻抽真空3小时，0℃冷冻抽真空2小时，10℃冷冻抽真空2小时；分别检测冻干前后的质控品的差异，计算残存率。
血红蛋白质控品的浓度使用免疫学血红蛋白测定试剂，使用粪便血红蛋白检测试剂盒,用干式免疫荧光分析仪进行测定。测定结果如表5所示。
表5
冻干稀释液
血红蛋白质控品冻干前(μg/g)
血红蛋白质控品冻干后(μg/g)
残存率(％)
保护剂低浓度
100.52
64.37
64.04
实施例6
取10mL 100mM pH7.4磷酸钾依次加入山梨醇和聚乙二醇混合物、甘氨酸和蔗糖，得到血红蛋白质控品稀释液，山梨醇和聚乙二醇混合物在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为10％，甘氨酸在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为10％，蔗糖在血红蛋白质控品稀释液中质量分数为10％，山梨醇和聚乙二醇的质量比为1:1。向血红蛋白质控品稀释液中加入0.005mL血红蛋白质控品样品，得到血红蛋白质控品溶液。
按照设定的冻干程序对上述得到的血红蛋白质控品溶液进行冷冻干燥，预设冻干程序为：预冻5小时，-40℃冷冻抽真空3小时，-20℃冷冻抽真空3小时，0℃冷冻抽真空2小时，10℃冷冻抽真空2小时；分别检测冻干前后的质控品的差异，计算残存率。
血红蛋白质控品的浓度使用免疫学血红蛋白测定试剂，使用粪便血红蛋白检测试剂盒,用干式免疫荧光分析仪进行测定。测定结果如表6所示。
表6
冻干稀释液
血红蛋白质控品冻干前(μg/g)
血红蛋白质控品冻干后(μg/g)
残存率(％)
保护剂高浓度
92.55
61.28
66.21
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。