阅读说明：本技术 一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法 (bionic method for evaluating allergenicity of crustacean aquatic products ) 是由 刘光明 刘萌 韩天娇 刘庆梅 刘思寒 刘红 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法,该方法包括：(1)仿生消化：利用体外胃肠液连续消化法处理甲壳类水产品可食用部分得到连续消化产物；(2)仿生转运：将连续消化产物加入含有小肠上皮粘膜Caco-2细胞的转运小室进行肠道细胞吸收转运；(3)体外评估：采用LAD2人肥大细胞脱颗粒模型,评估甲壳类水产品经仿生消化吸收后的致敏性；本发明采用体外胃肠液连续消化结合肠道上皮细胞吸收转运的方法,仿生处理甲壳类水产品；通过检测处理后样品诱导免疫细胞产生过敏介质的情况,以评估甲壳类水产品的致敏性；该方法简单易操作,通用性强。(The invention relates to a bionic method for evaluating the sensitization of crustacean aquatic products, which comprises the following steps: (1) bionic digestion: treating edible part of shellfish aquatic product by in vitro gastrointestinal fluid continuous digestion method to obtain continuous digestion product; (2) bionic transfer: adding the continuous digestion product into a transport chamber containing small intestinal epithelial mucosa Caco-2 cells for intestinal cell absorption and transport; (3) in vitro evaluation: evaluating the allergenicity of the crustacean aquatic products after bionic digestion and absorption by adopting an LAD2 human mast cell degranulation model; the method adopts a method of combining in-vitro gastrointestinal fluid continuous digestion with intestinal epithelial cell absorption and transportation to perform biomimetic treatment on the crustacean aquatic products; detecting the condition that the treated sample induces immune cells to generate allergic media so as to evaluate the allergenicity of the crustacean aquatic products; the method is simple and easy to operate, and has strong universality.)

一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种仿生评估甲类类水产品致敏性的方法。

背景技术

甲壳类水产品因其丰富的蛋白含量和鲜美的味道，始终在人类餐桌上占据一席之地。***粮农组织在2009年的一项调查报告中显示全球人均甲壳类消费量达到1.7kg/年。我国甲壳类水产品消费及加工量也逐年稳步递增，2017年水产加工品总量达到2196.3万吨。然而丰富的蛋白质储备中除了供给机体能量的优质蛋白，还包含相当种类的过敏蛋白。

国际上通常采用对胃蛋白酶的耐受性、过敏患者血清结合能力及细胞或小鼠过敏模型来评价一种新型蛋白质的致敏性，并被用作鉴别食物变应原的标准。但在实际生活中，机体摄入的是完整的食物而非单独的某种蛋白质；整个食物包括碳水化合物、蛋白及脂类等其它成分，食品热加工处理过程中组分之间会发生复杂的相互作用，例如蛋白的降解、聚合等现象。处理后的食物进入机体经胃肠道的一系列酶消化后，大的免疫原性肽和完整的蛋白能够经由小肠的管腔吸收，触发粘膜的免疫细胞，进而启动整个过敏反应发生机制，而导致机体出现呕吐、腹泻、荨麻疹甚至休克等多系统症状。

因此，复杂的机体内环境及免疫细胞的参与致使国际公认的这种单一的纯化蛋白的研究模式出现了很大的局限性，无法全面再现机体胃肠道消化吸收情况；也无法衡量消化后的食品对机体免疫细胞的影响，对准确衡量复杂甲壳类水产品基质中多组分摄入后的致敏状况也会产生一定影响。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法，通过检测食物摄入机体后的消化吸收转运及刺激免疫细胞产生过敏介质的情况来评估甲壳类水产品的致敏性。本方法简单易操作，通用性强。

为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法，包括以下步骤：

(1)仿生消化：利用体外胃肠液连续消化法处理甲壳类水产品的可食用部分，获得连续消化产物；

(2)仿生转运：将所述连续消化产物加入含有小肠上皮粘膜Caco-2细胞的转运小室进行肠道细胞吸收转运，获得转运液；

(3)体外评估：采用LAD2人肥大细胞脱颗粒试验评估所述转运液的致敏性。

根据本发明的一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法，在国内外公认的胃肠道消化模型之外，创新性地结合了肠道上皮细胞模型及免疫细胞模型，再现了食物中过敏组分进入机体后所经历的消化道屏障、细胞屏障，进而引起机体致敏的整个过程；相对于常规的单个蛋白或组分消化及致敏性检测模型，本方法可准确衡量甲壳类水产品基质中多组分摄入后的致敏状况；本方法也同样适用于整个食品被机体摄入后的致敏性评估。

另外，根据本发明上述实施例提出的一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，在步骤(1)中，所述体外胃肠液连续消化法包括：

模拟胃中消化0.5～1.5h；

模拟肠中消化2～6h。

根据本发明的实施例，所述模拟胃中消化为：将甲壳类水产品的可食用部分按照蛋白酶：蛋白＝1:25～1:100(w/w)的比例加入pH为1.0～2.0的胃蛋白酶液中，置于37℃摇床中消化0.5～1.5h，调节pH为7.2～7.4，终止胃中消化，获得胃消化产物；所述模拟肠中消化为：将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物按照蛋白酶：蛋白＝1:100～1:300(w/w)的比例加入所述胃消化产物中，置于37℃摇床中消化，2～6h后取出，沸水浴5min灭活酶，获得所述连续消化产物。

根据本发明的实施例，所述步骤(2)包括：将人小肠上皮粘膜细胞Caco-2接种至24孔板转运小室，预先培养至跨膜电阻大于500Ω/cm²，构建肠上皮单层细胞转运模型；再从顶侧内室加入所述连续消化产物，基底侧加入无细胞缓冲液，于37℃细胞培养箱孵育2～6h，收集基底侧转运液，即获得所述转运液。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，将所述转运液加入已被甲壳类过敏患者血清敏化的LAD2细胞中，孵育，离心，收集上清并裂解细胞，检测细胞脱颗粒情况，以评估转运液的致敏性。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，孵育的时间为0.5～2.0h。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为实施例1的LAD2细胞模型评价南美白对虾的致敏性；

图2为实施例2的LAD2细胞模型评价拟穴青蟹的致敏性。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

根据本发明的实施例，本发明提出了一种仿生评估甲壳类水产品致敏性的方法，包括以下步骤：

(1)仿生消化：利用体外胃肠液连续消化法处理甲壳类水产品的可食用部分得到连续消化产物。甲壳类水产品可直接生鲜食用或经热处理至熟食用；其可食部分，包括但不局限于去头、去壳等处理方式。甲壳类水产品的可食用部分照蛋白酶：蛋白＝1:25～1:100(w/w)的比例加入pH为1.0～2.0的胃蛋白酶液中，置于37℃摇床中消化0.5～1.5h，调节pH为7.2～7.4，终止胃中消化，获得胃消化产物；然后，将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物按照蛋白酶：蛋白＝1:100～1:300(w/w)的比例加入所述胃消化产物中，置于37℃摇床中消化，2～6h后取出，沸水浴5min灭活酶，获得所述连续消化产物。

(2)仿生转运：将所述连续消化产物加入含有小肠上皮粘膜Caco-2细胞(该细胞购买于ATCC)的转运小室进行肠道细胞吸收转运，获得转运液。将人小肠上皮粘膜细胞Caco-2接种至24孔板转运小室，预先培养至跨膜电阻大于500Ω/cm²，构建紧密的肠上皮单层细胞转运模型；再从顶侧内室加入胃肠液连续消化产物，基底侧加入无细胞缓冲液，于37℃细胞培养箱孵育2～6h以完成吸收转运，收集基底侧转运液，即获得所述转运液。

3)体外评估：采用LAD2人肥大细胞脱颗粒试验，评估甲壳类水产品经仿生消化、转运吸收后的致敏性。肥大细胞是人体重要的免疫细胞，在过敏反应的发生过程中具有重要作用。该步骤以人肥大细胞LAD2(该细胞购买于ATCC)作为免疫细胞代表，建立脱颗粒模型，将经胃肠液连续消化、肠上皮细胞转运后的基底侧外液，加入已被甲壳类过敏患者血清敏化的LAD2细胞中，于37℃细胞培养箱孵育刺激0.5～2.0h，检测肠上皮吸收转运液刺激LAD2细胞产生过敏介质的情况。

由此，通过体外胃肠液连续消化结合肠道上皮细胞吸收转运的方法，仿生处理甲壳类水产品；再通过检测处理后样品诱导免疫细胞产生过敏介质的情况，以评估甲壳类水产品的致敏性，可准确衡量甲壳类水产品基质中多组分摄入后的致敏状况。本发明完全模拟了人体在摄入热加工甲壳类水产品之后，机体经历的一系列生理生化反应，综合考虑复杂食品中多组分间的相互作用，及体内特殊微环境下的致敏性的评估，为全食品基质致敏性检测提供科学依据，也为低致敏性食品的生产加工提供理论基础。本方法简单易操作，通用性强。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

一种仿生评估南美白对虾致敏性的方法，包括：

仿生消化：利用体外胃肠液连续消化法处理南美白对虾可食用部分得到连续消化产物。市售鲜活南美白对虾，清洗干净后置于蒸馏水中煮制15min，去头去壳去虾线，取可食部分虾肉于10倍体积冰蒸馏水捣碎，得南美白对虾可食部分悬浊液。将南美白对虾可食部分悬浊液虾按照胃蛋白酶：蛋白＝1：50(w/w)的比例加入pH为2.0的胃蛋白酶液中，置于37℃摇床中消化，1h后，添加NaHCO₃调节pH为7.2，终止胃中消化；然后，将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物加入胃消化产物中，按照蛋白酶：蛋白＝1：200(w/w)的比例加入，置于37℃摇床中消化，4h后取出，沸水浴5min灭活消化酶，得南美白对虾胃肠液连续消化产物。

仿生转运：将南美白对虾胃肠液连续消化产物加入含有小肠上皮粘膜Caco-2细胞的转运小室进行肠道细胞吸收转运。将人小肠上皮粘膜细胞Caco-2接种至24孔板转运小室，预先培养至跨膜电阻大于500Ω/cm²，构建紧密的肠上皮单层细胞转运模型，表明紧密的肠上皮单层细胞的形成。再从顶侧内室加入南美白对虾胃肠液连续消化产物，基底侧外室加入无细胞缓冲液，于37℃细胞培养箱孵育2h，收集基底侧转运液。

体外评估：采用LAD2细胞脱颗粒试验，评估南美白对虾经仿生消化吸收后的致敏性。以人肥大细胞LAD2建立脱颗粒模型，将经胃肠道连续消化、肠上皮细胞吸收转运后的外液(上述的基底侧转运液)，加入已被虾类过敏患者血清敏化的LAD2细胞中，于37℃细胞培养箱孵育1h，离心，收集上清并裂解细胞，检测免疫细胞脱颗粒情况。

结果如图1所示，图1中，PBS：阴性对照；C48/80：建模成功标记物；生鲜虾：市售鲜活南美白对虾经去壳去虾线后的虾肉样品；压力处理虾-仿生处理前：经家用高压锅115℃，0.08MPa，15min处理后，去壳后的虾肉样品；压力处理虾-仿生处理后：经家用高压锅115℃，0.08MPa，15min处理后，去壳后的虾，再经上述的仿生消化、仿生转运后的虾肉样品。**：p＜0.01，有显著差异。结果说明，相对生鲜虾，经压力处理后的虾致敏性显著下降；经压力处理后和仿生处理后的虾致敏性进一步显著下降。

实施例2

一种仿生评估拟穴青蟹致敏性的方法，包括：

仿生消化：利用体外胃肠液连续消化法处理南美白对虾可食用部分得到连续消化产物。市售鲜活拟穴青蟹，清洗干净后置于蒸馏水中煮制15min，去头去壳去膜，取可食部分蟹肉于10倍体积冰蒸馏水捣碎，得拟穴青蟹可食部分悬浊液。将拟穴青蟹可食部分悬浊液虾按照胃蛋白酶：蛋白＝1：50(w/w)的比例加入pH为2.0的胃蛋白酶液中，置于37℃摇床中消化，1h后，添加NaHCO₃调节pH为7.2，终止胃中消化；然后，将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物加入胃消化产物中，按照蛋白酶：蛋白＝1：200(w/w)的比例加入，置于37℃摇床中消化，4h后取出，沸水浴5min灭活消化酶，得拟穴青蟹胃肠液连续消化产物。

仿生转运：将拟穴青蟹胃肠液连续消化产物加入含有小肠上皮粘膜Caco-2细胞的转运小室进行肠道细胞吸收转运。将人小肠上皮粘膜细胞Caco-2接种至24孔板转运小室，预先培养至跨膜电阻大于500Ω/cm²，构建紧密的肠上皮单层细胞转运模型，表明紧密的肠上皮单层细胞的形成。再从顶侧内室加入南美白对虾胃肠液连续消化产物，基底侧外室加入无细胞缓冲液，于37℃细胞培养箱孵育2h，收集基底侧转运液。

体外评估：采用LAD2细胞脱颗粒试验，评估拟穴青蟹经仿生消化吸收后的致敏性。以人肥大细胞LAD2建立脱颗粒模型，将经胃肠道连续消化、肠上皮细胞吸收转运后的外液(上述的基底侧转运液)，加入已被蟹类过敏患者血清敏化的LAD2细胞中，于37℃细胞培养箱孵育1h，离心，收集上清并裂解细胞，检测免疫细胞脱颗粒情况。

结果如图1所示，图1中，PBS：阴性对照；C48/80：建模成功标记物；生鲜蟹：市售鲜活拟穴青蟹经去壳去膜后的蟹肉样品；煮制蟹-仿生处理前：经沸水煮制15min后，去壳取肉后的蟹肉样品；煮制蟹-仿生处理后：经沸水煮制15min后，去壳取肉后的蟹肉，再经仿生消化、仿生转运后的蟹肉样品。**：p＜0.01，有显著差异。结果说明，相对生鲜蟹，经煮制后的蟹致敏性显著下降；经煮制后和仿生处理后的蟹致敏性进一步显著下降。

综上所述，本发明通过体外胃肠液连续消化结合肠道上皮细胞吸收转运的方法，仿生处理甲壳类水产品；再通过检测处理后样品诱导免疫细胞产生过敏介质的情况，以评估甲壳类水产品的致敏性，可准确衡量甲壳类水产品基质中多组分摄入后的致敏状况。本发明完全模拟了人体在摄入热加工甲壳类水产品之后，机体经历的一系列生理生化反应，综合考虑复杂食品中多组分间的相互作用，及体内特殊微环境下的致敏性的评估，为全食品基质致敏性检测提供科学依据，也为低致敏性食品的生产加工提供理论基础。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。