阅读说明：本技术 2，6-二羧基吡啶的应用 (Application of 2,6-dicarboxy pyridine ) 是由 拉博德·佩德罗 王苏妍 宋雪歌 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供2,6-二羧基吡啶在制备拮抗植物病原真菌的药物上的应用；所述植物病原真菌包括梨树腐烂病病菌、链格孢菌、葡萄座腔菌或立枯丝核菌的一种或多种；本发明还提供2,6-二羧基吡啶在梨树腐烂病的预防或治疗药物方面的应用；本发明还提供一种拮抗植物病原真菌的药物,其组成成分中至少包含2,6-二羧基吡啶。本发明还提供一种梨树腐烂病预防或治疗药物,其组成成分中至少包含2,6-二羧基吡啶。本发明的2,6-二羧基吡啶所制备药物具有能够非可逆性杀死梨树腐烂病病菌的作用；其中的2,6-二羧基吡啶能够渗透树皮和韧皮部,3mM的2,6-二羧基吡啶能完全抑制梨树腐烂病病菌的生长。(The invention provides application of 2,6-dicarboxy pyridine in preparing medicine for antagonizing plant pathogenic fungi; the plant pathogenic fungi comprise one or more of pear tree rot disease bacteria, alternaria alternate, grape cavity bacteria or rhizoctonia solani; the invention also provides the application of the 2,6-dicarboxy pyridine in the aspect of preventing or treating the pear tree rot; the invention also provides a drug for antagonizing plant pathogenic fungi, which at least comprises 2,6-dicarboxy pyridine. The invention also provides a medicament for preventing or treating the pear tree rot, which comprises at least 2,6-dicarboxy pyridine in the components. The medicine prepared from the 2, 6-dicarboxylpyridine has the effect of irreversibly killing the pathogens of the pear tree rot disease; wherein the 2, 6-dicarboxylpyridine can permeate bark and phloem, and 3mM of the 2, 6-dicarboxylpyridine can completely inhibit the growth of the pyricularia piricola.)

2，6-二羧基吡啶的应用

技术领域

本发明属于生物农业领域，具体涉及2，6-二羧基吡啶的应用。

背景技术

梨产业是中国果树生产的重要产业。近年来随着梨树种植规模扩大，梨树病害也越发严重，其中梨树腐烂病是危害梨产业最严重的真菌性病害之一，被称为梨树的“癌症”。该病一旦发生就会造成大量死树甚至毁园，给果农造成极大的损失。梨树腐烂病是一种真菌性病害，可通过分生孢子从树皮伤口部位入侵，在韧皮部大量聚集，导致韧皮部细胞死亡后逐步侵染形成层和木质部，最终导致梨树枯死。该病的最佳防治时期是在菌丝体未到达形成层之前，防治难点在于缺乏可有效穿透树皮到达致病部位的高效杀真菌剂。

目前为止，市场上没有防治该病的专用药剂。生产上常采用刮除病斑后涂抹化学药剂(如石硫合剂、腐殖酸铜水剂等)的方法。这些方法虽然获得较好的防治效果，但需要手工刮除病斑，耗时费力，且化学药剂的使用导致农药残留和环境污染问题日益凸显。因此，开发低毒、环保的杀真菌剂，对于防治梨树腐烂病、推进梨产业稳定发展，具有重要意义。

2，6-二羧基吡啶(2,6-dicarboxypyridine,DPA，结构式为

2，6-二羧基吡啶作为一种天然产物，是维生素、辅酶、生物碱的氧化降解产物，也是富里酸的重要组成成分，还是色氨酸降解途径的中间体和NAD辅酶的前体物质，具有环境兼容性好的特点。少量文献报道了关于2，6-二羧基吡啶与铜络合拮抗念珠菌的研究(Journal of Thermal Analysis&Calorimetry 2014,115:2191-2201；Polyhedron 2009,28:3526-3532)，但用2，6-二羧基吡啶防治植物病原真菌的研究仍是空白。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供2，6-二羧基吡啶的应用。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供2，6-二羧基吡啶在制备拮抗植物病原真菌的药物上的应用。

进一步的，所述植物病原真菌包括梨树腐烂病病菌、链格孢菌、葡萄座腔菌或立枯丝核菌的一种或多种。

本发明的实施例还提供2，6-二羧基吡啶在制备梨树腐烂病预防或治疗药物方面的应用。

本发明的实施例还提供一种拮抗植物病原真菌的药物，其特征在于，其组成成分中至少包含2，6-二羧基吡啶。

本发明的实施例还提供一种梨树腐烂病预防或治疗药物，其特征在于，其组成成分中至少包含2，6-二羧基吡啶。

进一步的，一种梨树腐烂病预防或治疗药物，包括Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺与2，6-二羧基吡啶。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的2，6-二羧基吡啶所制备药物具有能够非可逆性杀死梨树腐烂病病菌的作用；其中的2，6-二羧基吡啶能够渗透树皮和韧皮部，在其中的半衰期分别为15天和10天；对光照射不敏感，日光照射15天后，仍然稳定存在；3mM的2，6-二羧基吡啶能完全抑制梨树腐烂病病菌的生长；2，6-二羧基吡啶溶液在pH 1.0至3.0溶液中对梨树腐烂病病菌的抑制能力强于pH 4.0至7.0；2，6-二羧基吡啶与Zn²⁺、Co^{2 +}、Cu²⁺离子制备成的药物能增强梨树腐烂病病菌的抑制能力。

附图说明

图1为本发明实施例中2，6-二羧基吡啶对植物病原真菌的抗真菌活性检测图；

其中，图1A为不同浓度2，6-二羧基吡啶对梨树腐烂病病菌(Valsa ambiensvar.pyri和Valsa mali var.pyri)、链格孢菌(Alternaria alternata)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝体生长的影响图；图1B为Valsa mali var.pyri在含有0mM、1mM、3mM和5mM的2，6-二羧基吡啶的PDA固体培养基上的生长情况图；

图2为本发明的实施例中不同pH的2，6-二羧基吡啶溶液对Valsa mali var.pyri生长抑制的影响图；

图3为不同络合金属离子(Fe²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺)对2，6-二羧基吡啶抗Valsamali var.pyri活性的影响图；

图4为2，6-二羧基吡啶在梨树树枝中的稳定性及穿透性检测图；其中，图4A为树皮中的2，6-二羧基吡啶的稳定性曲线图，图4B为韧皮部中2，6-二羧基吡啶的稳定性曲线图；

图5为2，6-二羧基吡啶对梨树腐烂病的预防及治疗作用；其中，图5A为2，6-二羧基吡啶对梨树腐烂病的预防及治疗作用的统计学数据分析图；图5B为2，6-二羧基吡啶对梨树腐烂病的预防或治疗后的事例图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1

本发明的实施例1提供2，6-二羧基吡啶在制备拮抗植物病原真菌的药物上的应用。

在进一步的实施例中，所述植物病原真菌包括梨树腐烂病病菌、链格孢菌、葡萄座腔菌或立枯丝核菌的一种或多种。

实施例2

本发明的实施例2提供关于2，6-二羧基吡啶在制备梨树腐烂病预防或治疗药物方面的应用。

实施例3

本发明的实施例3提供一种拮抗植物病原真菌的药物，其组成成分中至少包含2，6-二羧基吡啶。

实施例4

本发明的实施例4提供一种梨树腐烂病预防或治疗药物，其组成成分中至少包含2，6-二羧基吡啶。

在进一步的实施例中，一种梨树腐烂病预防或治疗药物，包括Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺与2，6-二羧基吡啶。

验证1、2，6-二羧基吡啶对植物病原真菌的抗真菌活性检测

菌饼制备：将斜面保存的梨树腐烂病病菌(Valsa ambiens var.pyri和Valsamali var.pyri)、链格孢菌(Alternaria alternata)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌株接种于PDA固体培养基中，于25℃避光培养3天，用直径3mm的打孔器于菌落边缘切取，制备成菌饼备用。PDA培养基配方如表1所示，按配方准备好后先煮沸约30min，待各组分溶解，然后121℃湿热法灭菌15min。

表1 PDA培养基配方(1L)

试剂	质量
		马铃薯	200g
葡萄糖	20g
		琼脂粉	20g

。

制备含有0mM、1mM、3mM和5mM的2，6-二羧基吡啶的PDA培养基，将菌饼接种于PDA培养基中心位置，于25℃避光培养，当不含2，6-二羧基吡啶培养基中的菌落边缘接***板边缘时，测定各平板中的菌落直径，计算2，6-二羧基吡啶对5种植物病原真菌的抑制活性，每个处理设置3个平行。

结果如图1所示，2，6-二羧基吡啶对梨树腐烂病病菌(Valsa ambiens var.pyri和Valsa mali var.pyri)的抑制效果最好，1mM的2，6-二羧基吡啶对这两种菌株的抑制率分别为13％和65％，3mM和5mM的2，6-二羧基吡啶可完全抑制菌丝生长。抑制效果次之的是链格孢菌(Alternaria alternata)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，1mM的2，6-二羧基吡啶的抑制率分别为11％和8％，3mM的2，6-二羧基吡啶的抑制率分别为达44％和52％，5mM的2，6-二羧基吡啶可以完全抑制菌丝生长。5mM的2，6-二羧基吡啶对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抑制率达67％。

验证2、不同pH的2，6-二羧基吡啶溶液对Valsa mali var.pyri生长抑制的影响

Valsa mali var.pyri菌饼制备同上。

诱导分生孢子产生：将新鲜的菌饼接种于50mL大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基中，25℃，150rpm震荡培养24h。

大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方如表2所示，各组分溶于20mL超纯水后于121℃湿热法灭菌1h。

诱导产生的分生孢子用不同pH的M3S溶液(pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)或含有0.5mM的2，6-二羧基吡啶、不同pH的M3S溶液重悬，于25℃，180rpm孵育12h后在显微镜下对菌丝体进行计数。M3S溶液配方如表3所示。

表2大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方(20mL)

试剂	质量
		大麦	700mg
蜂蜜	200mg
		胰蛋白胨	100mg

。

表3 M3S溶液配方(1L)

试剂	质量
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.5g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	2.7g
		蛋白胨	1g
酵母提取物	1g
		葡萄糖	10g

。

结果如图2所示，由阴性对照可知，酸性及中性培养基中，Valsa mali var.pyri的生长不受pH值的影响，碱性培养基(pH 8.0)中，Valsa mali var.pyri的生长受到抑制。在含2，6-二羧基吡啶的培养基中，随着培养基pH值的降低，2，6-二羧基吡啶对Valsa malivar.pyri的生长抑制能力增加。

验证3、不同络合金属离子对2，6-二羧基吡啶抗Valsa mali var.pyri活性的影响

Valsa mali var.pyri菌饼制备同上。分生孢子的诱导同验证2中步骤。诱导产生的分生孢子用含0.5mM金属离子的M3S溶液或含有0.5mM的2，6-二羧基吡啶及0.5mM金属离子的M3S溶液重悬，于25℃，180rpm孵育12h后在显微镜下对菌丝体进行计数。其中，金属离子有FeCl₂、NiCl₂、ZnCl₂、CoCl₂、CuCl₂，M3S所用pH为3.0。

结果如图3所示，由阴性对照可知，各金属离子单独存在时不影响Valsa malivar.pyri的生长，Fe²⁺与2，6-二羧基吡啶混合后不改变2，6-二羧基吡啶的抗菌活性，Ni²⁺与2，6-二羧基吡啶混合后减弱了2，6-二羧基吡啶抗Valsa mali var.pyri的活性，而Zn²⁺、Co^{2 +}和Cu²⁺与2，6-二羧基吡啶混合后能增强2，6-二羧基吡啶抗Valsa mali var.pyri的活性。

验证4、2，6-二羧基吡啶在梨树树枝中的稳定性及穿透性检测

将3条翠冠梨树枝条浸于含有0.1M，pH 5.0的2，6-二羧基吡啶溶液中，3min后将枝条取出沥干，室温下保存于透明、密闭盒子中。于第0天，1天，3天，5天，10天，15天，用小刀取2mm×10mm面积树皮、韧皮部、形成层及木质部，并记录重量。将切取的植物组织投入含有200μL甲醇的Eppendorf管中，于500rpm震荡15min，经0.22μm滤膜过滤后用HPLC检测2，6-二羧基吡啶浓度。

HPLC方法为，液质仪器为Agilent 1200(California,USA)，采用C18色谱柱(250mm×4.6mm,Phenomenex)，紫外检测波长为283nm，以0.06N H₂SO₄为流动相，0.3mL/min横流洗脱，洗脱时间为30min，柱温箱60℃。2，6-二羧基吡啶洗脱时间为9.8min。采用外标法对2，6-二羧基吡啶进行定量。

结果如图4所示，2，6-二羧基吡啶可以渗透进入树皮和韧皮部，树皮部位的2，6-二羧基吡啶浓度略高于韧皮部。2，6-二羧基吡啶处理后15天内，树皮中的2，6-二羧基吡啶的浓度基本保持稳定。在韧皮部，处理后的前5天内，2，6-二羧基吡啶浓度基本保持不变，随后浓度逐渐降低，第10天，浓度降低至一半，15天后浓度减少90％。

验证5、2，6-二羧基吡啶对梨树的保护作用及治疗作用

菌饼制备同上。选用树龄、树势相同的2年生翠冠梨树进行试验。2，6-二羧基吡啶溶液配置：用去离子水配置3mM的2，6-二羧基吡啶溶液，调节pH为5.0。

保护作用：将2，6-二羧基吡啶溶液均匀喷洒至3枝梨树枝条上。设置水喷洒为阴性对照。3h后用无菌手术刀在枝条表面挖5mm²的小孔，每个枝条上2个小孔。每个小孔塞入3个菌饼，用保鲜膜缠绕固定24h后去除菌饼。4天后测量病斑直径。

治疗作用：用无菌手术刀在3枝梨树枝条表面挖5mm²的小孔，每个枝条上2个小孔。每个小孔塞入3个菌饼，用保鲜膜缠绕固定24h后去除菌饼。将2，6-二羧基吡啶溶液均匀喷洒至3枝梨树枝条上。用水喷洒代替2，6-二羧基吡啶喷洒，设为阴性对照。3天后测量病斑直径。

结果如图5所示，与阴性对照相比，在感染梨树腐烂病病菌前喷洒2，6-二羧基吡啶，能保护梨树免受病菌侵害。对于感染梨树腐烂病的梨树，喷洒2，6-二羧基吡啶能有效控制病害扩散。

本发明的实施例中，单位符号mM为mmol/L，M为mol/L。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。