阅读说明：本技术 一种基于crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法 (Method for directionally genetically modifying aspergillus oryzae gene based on CRISPR technology ) 是由 张哲� 曾斌 龙传南 范俊侠 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体,并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9,定向遗传改造米曲霉基因的方法,该方法消除了载体插入位点和培养基组分对cas9表达的影响,提高了基因编辑效率,并且能够产生无标记(Marker-Free)的米曲霉工程菌,免除对转基因的担忧,提高转基因改造米曲霉的实用性。(The invention provides a method for directionally and genetically modifying an Aspergillus oryzae gene by utilizing a shuttle vector which can autonomously replicate in Aspergillus fungi and starting expression of cas9 through a constitutive promoter PgpdA, which eliminates the influence of a vector insertion site and culture medium components on cas9 expression, improves gene editing efficiency, can generate Marker-Free (Marker-Free) Aspergillus oryzae engineering bacteria, avoids the worry of transgenosis and improves the practicability of transgenic modified Aspergillus oryzae.)

一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法

技术领域

本发明涉及生物技术的基因工程领域，具体涉及利用CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法。

背景技术

米曲霉用于酱油、米酒等食品发酵已有悠久的历史，因此被认为是国际公认的食品安全级的真菌。2005年米曲霉基因组测序工作的完成，为加快遗传改造米曲霉，使其成为高效生产酶制剂、真菌代谢产物的理想菌株奠定了基础。但由于米曲霉多核，表型多变，对常用筛选标记药物不敏感，导致遗传改造米曲霉进展缓慢，工业生产应用受限。

当前米曲霉遗传操作的成功与否依赖于两个因素：第一个是筛选标记的选择；第二个是同源同组的效率问题。由于米曲霉对多种抗性药物不敏感，使得米曲霉遗传转化筛选主要依赖于营养缺陷型菌株的构建，而营养缺陷型菌株的构建费时，工作量大，其效率取决于同源重组的效率。目前研究表明，敲除参与非同源重组途径的基因能够促进同源重组效率，这些基因主要有ku70，ku80，LigD。因此，为了提高米曲霉遗传操作，常常需要构建ku70，ku80，LigD和营养双缺陷菌株。而且，对于工业应用中常需要转化多个基因，这样就需要构建包含多个营养缺陷的菌株，这无疑加大了遗传改造米曲霉的难度。此外，多个营养缺陷筛选标记的构建势必造成宿主菌株表型和代谢的改变，这对于后续利用该遗传改造的菌株造成影响。

利用CRISPR-Cas系统在真菌中进行基因编辑，能够很好的解决上述问题。首先CRISPR-Cas系统敲除基因的效率不依赖于同源同组，这样免去了敲除ku70，ku80，LigD的繁琐；其二，CRISPR-Cas系统可利用一个营养缺陷筛选标记完成对多个基因的遗传改造。这些恰好解决了上述传统的同源重组改造米曲霉的困难。但CRISPR-Cas系统也有一些弊端。例如CRISPR-Cas表达盒若***到异染色质上，引起Cas9表达量低，造成基因编辑效率低；在米曲霉中常利用α淀粉酶诱导型启动子amyB启动表达Cas9，该启动子受培养基中碳源类型诱导表达，而碳源类型对米曲霉的生长影响大，从而影响后续转基因表型鉴定；无法形成无标记(Marker-Free)的工程菌株，引起人们对转基因的担忧。为了解决上述CRISPR-Cas系统的问题，本发明通过利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9，使cas9的表达不受***位点及培养基组分影响，提高基因编辑效率，并能够形成Marker-Free工程菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高效的遗传改造米曲霉基因。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种基于CRISPR技术定向突变米曲霉基因的方法。

本发明所提供的基于CRISPR技术定向突变米曲霉基因的方法中，所包括的步骤如下：

1)以cas9序列(Katayama等人(2016)Biotechnol Lett 38:637–642)为参考，人工合成cas9基因，其核苷酸序列为序列1所示的DNA分子；以上述人工合成的cas9基因为模板，以序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得的cas9 DNA分子重组连接到载体pEX1上(该载体出自于Nguyen等人(2016)World J Microbiol Biotechnol，32:204)。所述重组载体为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体pEX1-cas9。pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA，序列1所示的cas9基因，trpC基因终止子(TtrpC)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒，即PgpdA-cas9-TtrpC。

2)以上述cas9蛋白表达盒PgpdA-cas9-TtrpC为模板，以序列SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:4的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得的cas9蛋白表达盒重组连接到载体pPTR II上(日本TaKaRa公司，Code No.3622)。所述重组载体为在载体pPTR II的HindIII多克隆位点上***PgpdA-cas9-TtrpC表达盒，得到重组载体pPTR II-cas9，其中载体pPTR II是一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体。

3)以米曲霉RIB40基因组DNA为模板，以序列SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得序列3所示的U6启动子(U6 promoter)融合靶基因向导序列(guide sequence)，其中SEQ ID NO:6的DNA片段含有靶基因的向导序列(20个碱基)，从而在该融合DNA分子3’端融合了靶基因的向导序列，形成U6 promoter+guide sequence的融合DNA分子；以人工合成向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)和U6终止子序列(Katayama等人(2016)Biotechnol Lett 38:637–642)为参考，人工合成sgRNA融合U6终止子(U6terminator)的融合DNA分子，其核苷酸序列为序列4所示的DNA分子，并以此为模板，以SEQID NO:7，SEQ ID NO:8的DNA片段为引物，执行PCR扩增获得序列4所示的sgRNA融合U6终止子，其中SEQ ID NO:7的DNA片段含有靶基因的向导序列(20个碱基)，从而在该融合DNA分子5’端融合了靶基因的向导序列，形成guide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子；以上述扩增的U6 promoter+guide sequence，guide sequence+sgRNA+U6 terminator融合DNA分子为模板，以SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8的DNA片段为引物，执行重叠PCR扩增获得的U6 promoter+guide sequence+sgRNA+U6terminator表达盒重组连接到载体pPTR II上。所述重组载体为在载体pPTR II的SmalI多克隆位点上***U6 promoter+guidesequence+sgRNA+U6terminator表达盒，得到重组载体pPTR II-cas9-guide sequence。

4)米曲霉(RIB40或3.042)孢子接种到液体DPY培养基中，培养16-20h后收集菌丝，并用无菌水洗2次。用Yatalase酶法裂解上述菌丝，获取原生质体。将提取好的重组载体与原生质体混匀，加上60％PEG 4000进行原生质体转化，室温静置20min后，离心收集原生质体，并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素，0.8％琼脂的MM培养基混匀，平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素，1.5％琼脂MM培养基平板上，30℃培养3-4天。

5)挑取上述MM培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上，进行二次筛选。

6)选取上述长满菌丝的的CD平板，挑取菌丝，以SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10的DNA片段为引物执行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，比对测序结果看是否在靶基因的向导序列上发生突变。

7)为获得无标记(Marker-Free)的阳性菌株，将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的CD培养基上再连续培养四轮，挑取菌丝，以SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12的DNA片段为引物执行PCR扩增，检测米曲霉是否还含有pPTR II-cas9载体，并再次对靶基因的向导序列进行测序。

作为优选，步骤1)中cas9由组成型启动子PgpdA启动表达。

作为优选，步骤2)利用pPTR II载体中的AMA1基因，实现在Aspergillus属真菌内进行自主复制。

作为优选，步骤3)中序列SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7含有互补的20bp重叠序列，该序列恰好为靶基因向导序列。

作为优选，步骤3)中的重叠PCR具体程序为：取PCR产物各2μl，加上Buffer、dNTPs、酶，退火温度为50℃，扩增5次后，再添加引物和补充0.5μl酶，退火温度改为60℃，继续扩增30个循环。

作为优选，步骤4)中的MM培养基的组分为：0.2％NH₄Cl，0.1％(NH₄)₂SO₄，0.05％KCl，0.05％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.002％FeSO₄·7H₂O，2％glucose，0.15％methionine，l.2M sorbitol，pH 5.5

作为优选，步骤4)中液体DPY培养孢子，最好不要超过20h，否则影响后续的原生质体转化效率。

作为优选，步骤4)中提取的质粒(重组载体)必须用去内毒素的方法提取纯化，这样有利于提高原生质体转化效率。

作为优选，步骤7)通过多轮筛选，获得无标记(Marker-Free)的米曲霉工程菌。

本发明的有益效果

本发明提供了利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9，定向遗传改造米曲霉基因的方法，该方法消除了载体***位点和培养基组分对cas9表达的影响，提高了基因编辑效率，并且能够产生无标记(Marker-Free)的米曲霉工程菌，免除对转基因的担忧，提高转基因改造米曲霉的实用性。

附图说明

图1为PgpdA-cas9-TtrpC表达盒的构建过程。

图2为pPTR II-cas9载体构建过程。

图3为pPTR II-cas9-AozfpB载体构建过程。

图4筛选培养基生长的转化子。

图5为转化子的鉴定。

图6为无标记(Marker-Free)CRISPR-AozfpB工程菌的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

利用pPTR II-cas9自主复制载体定向敲除米曲霉基因AozfpB

1、自主复制载体pPTR II-cas9-AozfpB的构建

将载体pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的片段替换为序列1所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pEX1-cas9。pEX1-cas9与pEX1的差别仅在于：pEX1-cas9为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体。pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA，序列1所示的cas9基因，trpC基因终止子(TtrpC)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒，即PgpdA-cas9-TtrpC表达盒(图1)。

在自主复制的穿梭载体载体pPTR II的HindIII多克隆位点上***序列2所示的cas9蛋白表达盒(PgpdA-cas9-TtrpC表达盒)，得到重组载体pPTR II-cas9(图2)。

以米曲霉RIB40基因组DNA为模板，利用引物PU6-F：CTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA、PU6-AozfpB-R：TTGCATCTCTGGATCCACTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA，扩增获得序列3所示的U6启动子融合AozfpB的向导序列(U6promoter+AozfpB guidesequence)(图3A)；以序列4所示的DNA分子为模板，利用引物TU6-AozfpB–F：CAGTGGATCCAGAGATGCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA、TU6-R：GAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG扩增获得序列4所示的sgRNA融合U6终止子的DNA分子，并在该融合DNA分子5’端融合了AozfpB的向导序列，形成AozfpB guide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子(图3A)；以上述扩增的U6 promoter+AozfpB guide sequence，AozfpB guide sequence+sgRNA+U6terminator融合DNA分子为模板，以PU6-F，TU6-R为引物，进行重叠PCR扩增，获得U6 promoter+AozfpB guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒(图3B)。在自主复制的穿梭载体载体pPTR II的SmalI多克隆位点上***U6 promoter+AozfpB guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒，得到重组载体pPTR II-cas9-AozfpB(图3C)。

2、米曲霉的原生质体转化

将步骤1的pPTR II-cas9-AozfpB质粒转化米曲霉RIB40，具体方法为：

(1)将米曲霉RIB40的孢子接种到100ml的液体DPY培养基中，200rpm，30℃培养16-20小时；

(2)用灭菌的双层擦镜纸过滤收集上述DPY培养基培养的菌球，并用无菌水洗涤2次，沥干；

(3)将步骤(2)洗涤沥干后的菌丝转移至过滤除菌的10ml Yatalase酶裂解液(Solution I)中，50rpm，30℃裂解3小时；

Yatalase酶裂解液组分：50mM maleic acid(pH 5.5)，1％Yatalase

(TaKaRa)，0.6M(NH₄)₂SO₄；

(4)裂解完毕后，加入等体积的Solution II到步骤(3)的酶裂解中，用手摇晃数次，将上述酶液通过灭菌的双层擦镜纸过滤，用圆底管收集过滤液，1000rpm，8min，4℃，收集沉淀。用Solution II溶液洗涤沉淀一次，再离心收集，放在冰上，备用(图4A)；

Solution II组分：1.2M sorbitol，50mM CaCl₂·2H₂O，35mM NaCl，10mM Tris–HCl(pH 7.5)；

(5)将～3μg质粒与200μl原生质体混匀，放在冰上静置30min；

(6)向上述混合液中依次加入250，250，850μl新鲜制备的PEG溶液，每次加入后都轻轻混匀，最后黑暗条件下室温孵育20min；

PEG溶液组分：60％(W/V)PEG 4000，50mM CaCl₂·2H₂O，10mM Tris–HCl(pH 7.5)

(7)孵育后，缓慢的加入5–10ml Solution II溶液，并轻轻的上下颠倒离心管混匀以终止反应，1000rpm，8min，4℃，收集原生质体；

(8)加入1ml Solution II溶液重悬原生质体，并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素，0.8％琼脂的MM培养基混匀，平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素，1.5％琼脂MM培养基平板上，30℃培养3-4天(图4B)。

MM培养基的组分：0.2％NH₄Cl，0.1％(NH₄)₂SO₄，0.05％KCl，0.05％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.002％FeSO₄·7H₂O，2％glucose，0.15％methionine，l.2Msorbitol，pH 5.5

(9)挑取上述MM培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上，进行二次筛选(图4C)。

3、转化子的鉴定

选取上述长有菌丝的CD平板，挑取菌丝，转到50μl的水中，混匀；微波炉高火加热4min，冰中放置2min；吸取2μl作为模板,以SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10的DNA片段为引物执行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，比对测序结果看是否在向导序列上发生突变，结果如图5所示，米曲霉基因AozfpB的向导序列出现了一个碱基的缺失，该缺失位点恰好位于PAM序列前3bp的位置。

为获得无标记(Marker-Free)的阳性菌株，将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的CD培养基上再连续培养四轮，挑取菌丝，以SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12的DNA片段为引物执行PCR扩增，检测CRISPR-AozfpB工程菌是否还含有pPTR II-cas9-AozfpB载体(是否能够扩增出载体上面的PU6_AozfpB_sgRNA_TU6片段，并以pPTR II-cas9-AozfpB载体为对照)，并再次对AozfpB的向导序列进行测序。结果显示：经过总共六轮的筛选，CRISPR-AozfpB米曲霉工程菌中的pPTR II-cas9-AozfpB载体已检测不到(图6)，而AozfpB的向导序列依然出现了一个碱基缺失(图5)，因此成功获得了Marker-Free的阳性菌株。

序列表

<110> 江西科技师范大学

<120> 一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4218

<212> DNA

<213> 序列1(xulie1)

<400> 1

atggattaca aggatgacga cgataagatc atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt 60

atccacggag tcccagcagc cgacaagaag tactccatcg gtctcgacat cggtaccaac 120

tccgtcggtt gggccgtcat caccgacgag tacaaggtcc cctccaagaa gttcaaggtc 180

ctcggtaaca ccgaccgtca ctccatcaag aagaacctca tcggtgccct cctcttcgac 240

tccggtgaga ccgccgaggc cacccgtctc aagcgtaccg cccgtcgtcg ttacacccgt 300

cgtaagaacc gtatctgcta cctccaggag atcttctcca acgagatggc taaggtcgat 360

gactccttct tccaccgtct cgaggagtcc ttcctcgtcg aggaggataa gaagcacgag 420

cgtcacccca tcttcggtaa catcgtcgac gaggtcgcct accacgagaa gtaccccacc 480

atctaccacc tccgtaagaa gcttgtcgac tctactgata aggctgacct tcgtctcatc 540

tacctcgccc tcgcccacat gatcaagttc cgtggtcact tcctcatcga gggtgacctc 600

aaccctgaca actccgatgt cgacaagctc ttcatccagc tcgttcagac ttacaaccag 660

ctcttcgaag agaaccccat caacgcttcc ggtgttgacg ccaaggccat cctctccgct 720

cgtctctcca agtcccgtcg tctcgagaac ctcatcgctc agctccctgg tgagaagaag 780

aacggtctct tcggtaacct tatcgccctc tctctcggtc tcacccccaa cttcaagtcc 840

aacttcgacc tcgccgagga tgccaagctt cagctctcca aggacaccta cgatgacgat 900

ctcgacaacc tcctcgccca gatcggtgac cagtacgctg acctcttcct tgccgctaag 960

aacctctccg acgccatcct cctctccgat atcctccgtg tcaacaccga gatcaccaag 1020

gctcccctct ccgcttctat gatcaagcgt tacgatgagc accaccagga cctcactctt 1080

ctcaaggccc ttgtccgtca gcagctccct gagaagtaca aggagatctt cttcgatcag 1140

tccaagaacg gttacgccgg ttacatcgac ggcggtgctt cccaggagga gttctacaag 1200

ttcatcaagc ccatcctcga gaagatggac ggtaccgagg agctcctcgt caagctcaac 1260

cgtgaggatc tcctccgtaa gcagcgtact ttcgacaacg gttccatccc ccaccagatc 1320

caccttggcg aactccacgc tatcctccgt cgtcaggagg acttctaccc cttcctcaag 1380

gacaaccgtg agaagatcga gaagatcctc accttccgta tcccctacta cgttggcccc 1440

ctcgcccgtg gtaactcccg tttcgcctgg atgactcgta agtccgaaga gaccatcact 1500

ccctggaact tcgaggaagt cgtcgataag ggtgcctctg cccagtcctt catcgagcgt 1560

atgactaact tcgacaagaa cctccctaac gagaaggtcc ttcctaagca ctctctcctt 1620

tacgagtact tcactgttta caacgagctc accaaggtca agtacgtcac cgaaggtatg 1680

cgtaagcccg ccttcctctc tggtgagcag aagaaggcta tcgtcgacct cctcttcaag 1740

accaaccgta aggttaccgt caagcagctc aaggaagact acttcaagaa gatcgagtgc 1800

ttcgactccg ttgagatctc cggtgtcgag gatcgtttca acgcttccct cggtacctac 1860

cacgatctcc tcaagatcat caaggacaag gacttcctcg acaacgagga gaacgaggac 1920

atccttgagg acatcgtcct cacccttacc ctcttcgagg atcgtgagat gatcgaagaa 1980

cgtctcaaga cttacgctca cctcttcgac gacaaggtca tgaagcagct caagcgtcgt 2040

cgttacactg gttggggccg tctctcccgt aagctgatca acggcatccg tgacaagcag 2100

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aagcccgaga acatcgttat cgagatggcc cgtgagaacc agactaccca gaagggtcag 2400

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atccttaagg agcaccccgt cgagaacacc cagcttcaga acgagaagct ctacctctac 2520

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gactctccca ctgtcgctta ctccgtcctc gttgtcgcca aggtcgagaa gggtaagtct 3540

aagaagctca agtccgtcaa ggagctcctc ggcatcacca tcatggagcg ttcctccttc 3600

gagaagaacc ccatcgactt cctcgaggcc aagggttaca aggaggtcaa gaaggacctc 3660

atcatcaagc ttcccaagta ctccctcttc gagcttgaga acggtcgtaa gcgtatgctc 3720

gcttccgccg gtgagctcca gaagggtaac gagctcgctc tcccctccaa gtacgtcaac 3780

ttcctctacc tcgcctccca ctacgagaag ctcaagggtt ctcccgaaga caacgagcag 3840

aagcagctct tcgtcgagca gcacaagcac taccttgatg agatcatcga gcagatctcc 3900

gagttctcca agcgtgtcat cctcgccgac gctaacctcg ataaggtcct ctccgcttac 3960

aacaagcacc gtgacaagcc catccgtgag caggctgaga acatcatcca cctcttcact 4020

ctcaccaacc ttggtgcccc tgctgccttc aagtacttcg acaccaccat cgaccgtaag 4080

cgttacacct ctaccaagga ggtcctcgac gccactctca tccaccagtc cattaccggt 4140

ctctacgaga ctcgtatcga cctctctcag ctcggtggtg actcccgtgc tgaccccaag 4200

aagaagcgta aggtctga 4218

<210> 2

<211> 5919

<212> DNA

<213> 序列2(xulie2)

<400> 2

gtgaccggtg actctttctg gcatgcggag agacggacgg acgcagagag aagggctgag 60

taataagcgc cactgcgcca gacagctctg gcggctctga ggtgcagtgg atgattatta 120

atccgggacc ggccgcccct ccgccccgaa gtggaaaggc tggtgtgccc ctcgttgacc 180

aagaatctat tgcatcatcg gagaatatgg agcttcatcg aatcaccggc agtaagcgaa 240

ggagaatgtg aagccagggg tgtatagccg tcggcgaaat agcatgccat taacctaggt 300

acagaagtcc aattgcttcc gatctggtaa aagattcacg agatagtacc ttggtgtata 360

gccgtcggcg aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag tccaattgct tccgatctgg 420

taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag agcgagtacc cggcgcgtaa 480

gctccctaat tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa atatcgtgcc tctcctgctt 540

tgcccggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg ccagcggcgc agaccgggaa 600

cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga cctgctgagg tccctcagtc 660

cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt cggcggggtt gacaaggtcg 720

ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct ccccaccagc tgctcttttc 780

ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc catccaagaa cctttatttc 840

ccctaagtaa gtactttgct acatccatac tccatccttc ccatccctta ttcctttgaa 900

cctttcagtt cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact aacagctacc ccgcttgagc 960

agacatcacc ctcgagatgg attacaagga tgacgacgat aagatcatgg ccccaaagaa 1020

gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac aagaagtact ccatcggtct 1080

cgacatcggt accaactccg tcggttgggc cgtcatcacc gacgagtaca aggtcccctc 1140

caagaagttc aaggtcctcg gtaacaccga ccgtcactcc atcaagaaga acctcatcgg 1200

tgccctcctc ttcgactccg gtgagaccgc cgaggccacc cgtctcaagc gtaccgcccg 1260

tcgtcgttac acccgtcgta agaaccgtat ctgctacctc caggagatct tctccaacga 1320

gatggctaag gtcgatgact ccttcttcca ccgtctcgag gagtccttcc tcgtcgagga 1380

ggataagaag cacgagcgtc accccatctt cggtaacatc gtcgacgagg tcgcctacca 1440

cgagaagtac cccaccatct accacctccg taagaagctt gtcgactcta ctgataaggc 1500

tgaccttcgt ctcatctacc tcgccctcgc ccacatgatc aagttccgtg gtcacttcct 1560

catcgagggt gacctcaacc ctgacaactc cgatgtcgac aagctcttca tccagctcgt 1620

tcagacttac aaccagctct tcgaagagaa ccccatcaac gcttccggtg ttgacgccaa 1680

ggccatcctc tccgctcgtc tctccaagtc ccgtcgtctc gagaacctca tcgctcagct 1740

ccctggtgag aagaagaacg gtctcttcgg taaccttatc gccctctctc tcggtctcac 1800

ccccaacttc aagtccaact tcgacctcgc cgaggatgcc aagcttcagc tctccaagga 1860

cacctacgat gacgatctcg acaacctcct cgcccagatc ggtgaccagt acgctgacct 1920

cttccttgcc gctaagaacc tctccgacgc catcctcctc tccgatatcc tccgtgtcaa 1980

caccgagatc accaaggctc ccctctccgc ttctatgatc aagcgttacg atgagcacca 2040

ccaggacctc actcttctca aggcccttgt ccgtcagcag ctccctgaga agtacaagga 2100

gatcttcttc gatcagtcca agaacggtta cgccggttac atcgacggcg gtgcttccca 2160

ggaggagttc tacaagttca tcaagcccat cctcgagaag atggacggta ccgaggagct 2220

cctcgtcaag ctcaaccgtg aggatctcct ccgtaagcag cgtactttcg acaacggttc 2280

catcccccac cagatccacc ttggcgaact ccacgctatc ctccgtcgtc aggaggactt 2340

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caaccgtaac ttcatgcagc tcatccacga cgactctctc accttcaagg aggacatcca 3180

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gaagctctac ctctactacc tccagaacgg ccgtgacatg tacgttgatc aggagctcga 3540

catcaaccgt ctctccgact acgacgtcga tcacatcgtc ccccagtcct tcctcaagga 3600

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caagctcatc acccagcgta agttcgataa cctcactaag gctgaacgtg gtggcctctc 3780

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caacgctgtc gttggcactg ctcttatcaa gaagtacccc aagcttgagt ccgagttcgt 4080

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cggtaaggcc accgctaagt acttcttcta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga 4200

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tatcctcccc aagcgtaact ccgacaagct catcgctcgc aagaaggact gggaccccaa 4440

gaagtacggc ggtttcgact ctcccactgt cgcttactcc gtcctcgttg tcgccaaggt 4500

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ggagcgttcc tccttcgaga agaaccccat cgacttcctc gaggccaagg gttacaagga 4620

ggtcaagaag gacctcatca tcaagcttcc caagtactcc ctcttcgagc ttgagaacgg 4680

tcgtaagcgt atgctcgctt ccgccggtga gctccagaag ggtaacgagc tcgctctccc 4740

ctccaagtac gtcaacttcc tctacctcgc ctcccactac gagaagctca agggttctcc 4800

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catcgagcag atctccgagt tctccaagcg tgtcatcctc gccgacgcta acctcgataa 4920

ggtcctctcc gcttacaaca agcaccgtga caagcccatc cgtgagcagg ctgagaacat 4980

catccacctc ttcactctca ccaaccttgg tgcccctgct gccttcaagt acttcgacac 5040

caccatcgac cgtaagcgtt acacctctac caaggaggtc ctcgacgcca ctctcatcca 5100

ccagtccatt accggtctct acgagactcg tatcgacctc tctcagctcg gtggtgactc 5160

ccgtgctgac cccaagaaga agcgtaaggt ctgaggatcc acttaacgtt actgaaatca 5220

tcaaacagct tgacgaatct ggatataaga tcgttggtgt cgatgtcagc tccggagttg 5280

agacaaatgg tgttcaggat ctcgataaga tacgttcatt tgtccaagca gcaaagagtg 5340

ccttctagtg atttaatagc tccatgtcaa caagaataaa acgcgtttcg ggtttacctc 5400

ttccagatac agctcatctg caatgcatta atgcattgga cctcgcaacc ctagtacgcc 5460

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cgagatcaag cagatcaacg gtcgtcaaga gacctacgag actgaggaat ccgctcttgg 5580

ctccacgcga ctatatattt gtctctaatt gtactttgac atgctcctct tctttactct 5640

gatagcttga ctatgaaaat tccgtcacca gcccctgggt tcgcaaagat aattgcactg 5700

tttcttcctt gaactctcaa gcctacagga cacacattca tcgtaggtat aaacctcgaa 5760

aatcattcct actaagatgg gtatacaata gtaaccatgc atggttgcct agtgaatgct 5820

ccgtaacacc caatacgccg gccgaaactt ttttacaact ctcctatgag tcgtttaccc 5880

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tggttcactt ctctttagaa atcaactgtg ggttttgctt tttgcttcat tctctttgtc 120

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gttttctatt tttattattt ctttttcttt tgaaatgtga ttaacaacca gtccgttata 240

tatcttgtac ccagattacg cccaactcgt gctcctcagc cacaaagata ctcaattgat 300

agccaagata catacatacc acaaagtaag gactccatgc attgagtatt actcatcgta 360

ttctagacta ctccaaaact cagcacatag acaaacaata cgaacctcgt ctaggggtga 420

ttcagaggcg gcaaagcggg gttttcgcat ttgatgttcc tggcacttat gtaagcccac 480

gcttcccgct caactaaacc atcagccaat cagactgctc agatttatct tttgaagggt 540

aaataaatca ttgtaaagaa gaacaagt 568

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gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt tttttgagca tttatcagct tgatatagag gtaggaatgt 120

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cagtggatcc agagatgcaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaa 48

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aattcgagct cggtacccgg gagcagctct atatcacgtg acg 43

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agcagctcta tatcacgtga cgta 24