阅读说明：本技术 一种产2’-岩藻基乳糖菌株最佳发酵条件的构建方法 (Construction method of optimal fermentation condition of strain for producing 2' -fucosyllactose ) 是由 胡学超 史静 于 2019-08-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及大肠杆菌菌株技术领域,本发明首先采用单因素水平实验,从发酵的转速,接种量,装液量,时间,温度,氮源,碳源,pH值以及乳糖浓度因素进行实验分析,得到最佳的单因素水平,然后选择有代表性的水平组合进行正交实验,分析,确定最佳发酵条件,发酵后,获得的2’-岩藻基乳糖的含量提高了2.5％,产量为3.5g/L,所得的2’-岩藻基乳糖与人乳中低聚寡糖2’-岩藻基乳糖结构以及性质相同,它作为营养强化剂,作为益生元类物质的来源之一,常用于婴儿配方食品,较大婴儿和幼儿配方食品,特殊医学用途婴儿配方食品。(The invention relates to the technical field of escherichia coli strains, firstly, a single-factor level experiment is adopted, the experiment analysis is carried out on the factors of the fermentation rotating speed, the inoculation amount, the liquid loading amount, the time, the temperature, the nitrogen source, the carbon source, the pH value and the lactose concentration to obtain the optimal single-factor level, then, a representative level combination is selected to carry out an orthogonal experiment and analysis to determine the optimal fermentation condition, the content of the obtained 2 '-fucosyllactose is improved by 2.5 percent after the fermentation, the yield is 3.5g/L, the structure and the property of the obtained 2' -fucosyllactose are the same as those of the oligosaccharide 2 '-fucosyllactose in human milk, and the 2' -fucosyllactose is used as a nutrition enhancer and is one of sources of prebiotic substances and is commonly used for infant formula foods, infant formula foods for larger infants and children and infant formula foods.)

一种产2’-岩藻基乳糖菌株最佳发酵条件的构建方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌菌株技术领域，具体是指一种产2’-岩藻基乳糖菌株最佳发酵条件的构建方法。

背景技术

母乳为婴儿营养的重要的来源，婴儿的营养品中，奶粉作为第三大最丰富的固体营养物质，其中所含 有的人乳低聚糖(HMO)对婴儿的健康起关键作用，岩藻糖基化的HMO，包括2‘-岩藻糖乳糖(2’-FL)， 3-岩藻糖(3-FL)，乳糖新N-四糖(LNnT)等，这些物质可选择性地刺激双歧杆菌的生长，这些岩藻糖基化 的人乳低聚糖能够形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿抵抗肠道病原体的感染，如肠道致病性大肠杆 菌、霍乱弧菌和沙门氏菌。此外，岩藻糖基化的HMO类似于Lewis抗原糖链结构在炎症和肿瘤转移中起 着关键作用。能够识别肿瘤细胞的结构并将其转移，在岩藻糖化HMOs，2’-FL能够抑制细菌或病毒粘附 在上皮细胞上，这些功能性糖由于它们在营养保健方面的潜在应用而引起了制药业极大的关注。

有公司已经通过基因工程的方法获得了能够产2‘-岩藻糖乳糖的方法，但是其产量较低，限制了其生 产，并且增加了成本。

代谢工程和发酵微生物学的发展为提高微生物合2‘-岩藻糖乳糖提供了可能性，通过对发酵条件以及 过程进行控制，并且对发酵过程的染菌进行防止，从而提高了2‘-岩藻糖乳糖的含量的研究。

发明内容

以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种产2’-岩藻基乳糖菌株最佳发酵条件 的构建方法，为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，可以大幅度降低生产成本。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种产2’-岩藻基乳糖菌株最佳发酵条件的构建方 法，由以下方法制备而成：(1)初始发酵培养基：10g/L甘油、12g/LK2HPO4、3g/L KH2PO4、5g/L (NH4)2SO4、0.1g/L NaCl、MgSO4·7H2O 0.3g/L CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O/柠檬酸钠、 15ml/L(7.5g/LFeSO4·7H2O加100g/L柠檬酸钠)、7.5μg/L硫胺素、1g/L酵母粉、1mL/L金属元 素(10g/L MnSO4·nH2O，4g/L CoCl2，2g/L Na2MoO4·2H2O，2g/L ZnSO4·7H2O，1g/L CuCl2·2H2O， 0.5g/L H3BO3，pH 7.2.)；

(2)菌种活化：取-80℃冰箱里的保存菌种E.coli K-12 ZK-2，接到LB培养基中，过夜活化；

(3)发酵：取大肠杆菌E.coli K-12 ZK-2菌液接种到培养基中，然后在发酵摇瓶中发酵，当OD600 值达到0.6时，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷和乳糖，诱导表达；

(4)单因素多水平实验：A、转速

分别选取140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm5个转速水平，采用初始发酵培养基进行发酵 实验，其他因素不变，发酵24小时后测定其2’-FL的产量；

B、接种量

分别选取0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％5个接种量水平，采用初始发酵培养基进行发酵实验，每隔 一个小时测定其OD600测定其生长状况，发酵24小时后测定其2’-FL的产量；

C、装液量

分别选取10％、20％、30％、40％、50％5个装液量水平，采用初始发酵培养基进行发酵实验，转速 选择上述最佳转速条件，接种量选择上述最佳接种量，其他因素不变。每隔一个小时测定其OD600测定 其生长状况，发酵24小时后测定其2’-FL的产量；

D、pH值

利用NaOH和HCI将培养基的pH分别调至3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 5个pH值，采用初始发酵培养基 进行发酵实验，转速选择上述最佳转速条件，接种量选择上述最佳接种量，装液量选择上述最佳装液量， 其他因素不变。初始生长阶段，每隔一个小时测定其OD600测定其生长状况，然后产物生成阶段，发酵 24小时后测定其2’-FL的产量；

E、发酵时间

转速选择上述最佳转速条件，接种量选择上述中最佳接种量，装液量选择上述中最佳装液量，pH值 选择上述最佳pH值，其他因素不变，每隔10、20、30、40、50小时进行取样测定其2’-FL的产量；

F、碳源

选择葡萄糖，蔗糖，甘油三种碳源，按照10g/L的添加量进行分别发酵，转速选择上述中最佳转速条 件，接种量选择上述中最佳接种量，装液量选择上述中最佳装液量，pH值选择上述中最佳pH值，其他因 素不变。每隔一个小时测定其OD600测定其生长状况，发酵最佳时间后测定其2’-FL的产量；

G、氮源

NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、蛋白胨、酵母粉6种氮源，按照5g/L的添加量进行分别发酵， 转速选择上述中最佳转速条件，接种量选择上述中最佳接种量，装液量选择上述中最佳装液量，pH值选 择上述中最佳pH值，碳源选择上述中最佳碳源，其他因素不变，每隔一个小时测定其OD600测定其生长 状况，发酵最佳时间后测定其2’-FL的产量；

H、温度

分别选取16℃，22℃、28℃、34℃、40℃5个温度梯度，转速选择上述中最佳转速条件，接种量选择 上述中最佳接种量，装液量选择上述中最佳装液量，pH值选择上述中最佳pH值，碳源选择上述中最佳碳 源，氮源选择上述中最佳氮源，其他因素不变，发酵最佳时间后取样，测定其2’-FL的产量；

I、乳糖浓度

分别选取1g/L，2g/L、3g/L、4g/L、5g/L5个温度梯度，转速选择上述中最佳转速条件，接种量选择 上述中最佳接种量，装液量选择上述中最佳装液量，pH值选择上述中最佳pH值，碳源选择上述中最佳碳 源，氮源选择上述中最佳氮源，温度选择上述最佳温度，其他因素不变，发酵最佳时间后取样，测定其2’ -FL的产量。

(5)多因素多水平实验：选择影响因素比较大的四个因素A氮源，B时间，C温度，D乳糖浓度， 设计三个水平1，2，3，进行一组正交试验，最终确定最佳组分。

作为改进，所述的步骤(1)的E.coli K-12 ZK-2菌株发酵时的培养基装液量控制在10％。

作为改进，所述的步骤(1)的E.coli K-12 ZK-2菌株发酵时的培养基pH值控制在7.2。

作为改进，所述的步骤(2)的E.coli K-12 ZK-2菌种活化的温度控制在37℃以内。

作为改进，所述步骤(3)E.coli K-12 ZK-2菌株在其DO600达到0.6前温度控制在在37℃以内。

作为改进，所述的步骤(3)的发酵菌液按照1％的接种量接种至培养基中。

作为改进，所述步骤(3)中的大肠杆菌菌株E.coli K-12 ZK-2发酵时，需要添加的乳糖的终浓度设 置在2g/L，就能实现2’-岩藻基乳糖的生成。

作为改进，所述步骤(3)中大肠杆菌菌株E.coli K-12 ZK-2发酵时间控制在24小时内。

作为改进，所述的步骤(3)中的大肠杆菌菌株E.coli K-12 ZK-2发酵时，转速调至120rpm。

作为改进，所述的步骤(4)中的大肠杆菌菌株E.coli K-12 ZK-2发酵时，所指的初始发酵培养基以 及培养条件与步骤(3)一致。

本发明的有益效果是：本发明采用大肠杆菌菌株E.coli K-12 ZK-2制备2’-岩藻基乳糖，通过发酵条 件的优化，使得摇瓶产量从1g/L，提高到3.5g/L，为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，可以大幅度 降低生产成本。

附图说明

图1是本发明多因素多水平实验的实验分组。

具体实施方式

下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。

实施例一

大肠杆菌E.coli K-12 ZK-2发酵优化的制备方法：接种上述大肠杆菌E.coli K-12 ZK-2菌种的新鲜培 养物至发酵培养基中，34℃培养24h。

培养基配比为：10g/L甘油，12g/L K2HPO4，3g/L KH2PO 4，5g/L蛋白胨，0.1g/LNaCl， MgSO4·7H2O 0.3g/L CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O/柠檬酸钠15ml/L(7.5g/LFeSO4·7H2O 加100g/L柠檬酸钠)7.5μg/L硫胺素，1g/L酵母粉，1mL/L金属元素(10g/L MnSO4·nH2O， 4g/L CoCl2，2g/L Na2 MoO4·2H2O，2g/L ZnSO4·7H2O，1g/LCuCl2·2H2O，0.5g/L H3BO3，pH 7.2.)。

菌液接种量为培养基体积的2.5％，装液量为10％，起始pH值为7.2，充分混匀后装入发酵摇瓶中， 在37℃，220rpm条件下，待OD600值达到0.6时，将转速调至190rpm，加入0.1mM的IPTG在34℃诱 导表达和加入10g/L lactose，诱导表达5d。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领 域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都 应涵盖在本发明的保护范围之内。