阅读说明：本技术 一种槐糖脂生物表面活性剂的多级连续流加双相发酵工艺 (Multi-stage continuous fed-batch dual-phase fermentation process of sophorolipid biosurfactant ) 是由 梁生康 李俊峰 王哲 罗成坤 于 2020-04-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种槐糖脂生物表面活性剂的多级连续流加双相发酵工艺,其步骤包括：将多个体积相同的发酵罐依次连通,前一个发酵罐部分发酵液打入其紧连的发酵罐中,该发酵液中不仅其中含有高密度的菌细胞,可以作为接种液快速利用水溶性底物导致菌体细胞快速增殖,而且含有一定量槐糖脂,可以有效乳化增溶新补加的油溶性底物,缩短发酵周期；多个发酵罐相互连通,依次接种,连续补料,形成多级连续流加发酵工艺。本发明的优点在于可以大大缩短槐糖脂的发酵周期,提高发酵效率。同时,各主体发酵罐相互独立操作,单独补料和排放反应物料,可以大大避免相互感染杂菌的机会。(The invention discloses a multi-stage continuous fed-batch dual-phase fermentation process of sophorolipid biosurfactant, which comprises the following steps: a plurality of fermentation tanks with the same volume are communicated in sequence, partial fermentation liquor of the previous fermentation tank is injected into the fermentation tank which is connected with the previous fermentation tank, the fermentation liquor not only contains high-density bacterial cells which can be used as an inoculation liquid to quickly utilize a water-soluble substrate to cause the bacterial cells to quickly proliferate, but also contains a certain amount of sophorolipid, can effectively emulsify and solubilize a newly-supplemented oil-soluble substrate, and shortens the fermentation period; the plurality of fermentation tanks are communicated with each other, and are sequentially inoculated and continuously fed to form a multi-stage continuous fed-batch fermentation process. The invention has the advantages of greatly shortening the fermentation period of sophorolipid and improving the fermentation efficiency. Meanwhile, the main fermentation tanks are operated independently, and the reaction materials are fed and discharged independently, so that the chance of mutual infection of mixed bacteria can be greatly avoided.)

一种槐糖脂生物表面活性剂的多级连续流加双相发酵工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种槐糖脂生物表面活性剂的多级连续流加双相发酵工艺。

背景技术

作为重要的化工产品，表面活性剂素有“工业味精”的美称，在化工、石油、日化等各行业具有广泛用途。槐糖脂是目前被研究最为深入和应用最为广泛的一类生物表面活性剂。已发现多株假丝酵母菌（Candida sp.）可以利用水溶性和油溶性的双相碳源高产槐糖脂。和传统的化学合成表面活性剂相比，槐糖脂类生物表面活性剂具有以下显著特征和优点：（1）高表/界面活性；（2）低毒或无毒，对环境友好；（3）易于生物降解；（4）良好的耐温性、耐盐性和耐酸碱性。基于上述特点，槐糖脂类生物表面活性剂可以部分取代化学合成的表面活性剂而在日用化工、石油开采、纺织印染、食品发酵等行业获得广泛应用。微生物发酵是生产槐糖脂生物表面活性剂的重要途径和方法。目前，限制槐糖脂生物表面活性剂在各工业行业广泛应用的瓶颈是生产成本过高。亟需通过优化槐糖脂发酵工艺，提高槐糖脂生产效能，降低生产成本。

槐糖脂生物表面活性剂发酵动力学研究表明，在假丝酵母菌（Candida sp.）以利用水溶性和油溶性的双相碳源为底物合成槐糖脂生物表面活性剂的过程中，首先利用葡萄糖等水溶性碳源，使得菌体细胞的大量生长繁殖，达到生长稳定期时，菌细胞开始利用油溶性碳源并分泌代谢槐糖脂，菌株由延滞期进入稳定期往往长达4h以上，而整个发酵周期都大都在196h以上。这主要是由于油溶性底物与亲水性的菌细胞表面亲合性较差，往往需要较长时间的诱导产生槐糖脂并将油滴乳化分散后，菌细胞才能大量利用油溶性底物。因此，为缩短发酵周期，应改进发酵工艺流程，减少菌株诱导产生槐糖脂增溶油溶性底物的时间。

目前，在槐糖脂发酵工艺方面，已经开发出小试和中试规模上单罐分批式发酵（美国专利：3205150；美国专利：3321648）、单罐分批补料发酵（中国专利：CN101845469A）和单罐连续补料发酵（中国专利：CN 102492605A）三种发酵方式。但仍然存在发酵周期长、发酵效率低等突出问题。目前常用的单罐分批式发酵操作方式都是一次性加入基质并在反应完成后将全部反应物料取出，不仅高浓度油溶性基质会阻碍氧传质速率，而且产物浓度或其他代谢产物会抑制菌株的生长，导致发酵周期较长、底物利用率低，槐糖脂产率低。单罐分批补料发酵通过分批补加油溶性底物，可以提高底物利用率，保持发酵体系较高的溶氧水平；但仍是在发酵完成后一次取出反应物料，不仅会由于高浓度产物限制菌株生长，而且在下次培养周期中，菌株在油溶性底物诱导作用下生成槐糖脂所需时间较长，发酵周期增长，发酵效率降低。而单罐连续补料发酵易于染菌，且过程控制要求较高，难以满足工业化大规模生产的需求。

发明内容

针对假丝酵母菌摄取利用油溶性底物时需要诱导产生槐糖脂生物表面活性剂而导致发酵周期长的突出问题，本发明的目的是，根据槐糖脂发酵菌种生长和产物生成特性和动力学特征，提供一种发酵周期短、发酵效率高的槐糖脂生物表面活性剂多级连续流加双相发酵工艺。

本发明基于假丝酵母菌（Candida sp.）以水溶性和油溶性的双相碳源为底物合成槐糖脂生物表面活性剂发酵动力学特征，在单罐补料分批发酵和单罐连续发酵的基础上，设计和开发槐糖脂生物表面活性剂多级连续流加双相发酵工艺，将多个体积相同的发酵罐依次连通，前一个发酵罐部分发酵液打入其紧连的发酵罐中，该发酵液中不仅其中含有高密度的菌细胞，可以作为接种液快速利用水溶性底物导致菌体细胞快速增殖，而且含有一定量槐糖脂，可以有效乳化增溶新补加的油溶性底物，缩短发酵周期；多个发酵罐相互连通，依次接种，连续补料，形成多级连续流加发酵工艺。

本发明具体的技术方案如下：

本发明依托一套多级串联的发酵设备来完成。该发酵设备的主体由n（n=3-8）个发酵罐相互串联组成，第1个发酵罐连接第2个发酵罐，第2个发酵罐连接第3个发酵罐，依次类推，第n-1个与第n个发酵罐连接，第n个发酵罐又连接第1个发酵罐。每个发酵罐都连通种子罐和补料罐，并与储罐间有独立的连接管道，同时安装温度、pH、溶解氧等实时监测探头，各发酵罐之间依次连通。

本发明具体的工艺流程如下：

一种槐糖脂生物表面活性剂的多级连续流加双相发酵工艺，包括以下步骤：

（1）在种子罐中装入种子培养基，经灭菌后，接入菌种假丝酵母菌(Candida sp.)，保持温度为25-35℃，曝气量为0.4-0.8 vvm、搅拌速率为300-800 rpm、罐压为0.105-0.15兆帕，发酵一段时间后，将种子液全部接种到事先装入已灭菌的新鲜发酵培养基的第1个发酵罐中；

（2）第1个发酵罐中的发酵液接种后，保持温度为25-35℃，曝气量为0.4-0.8 vvm、搅拌速率为300-800 rpm、罐压为0.105-0.15兆帕，将体积比为3%-15%的发酵液打入第2个发酵罐中；然后定时往第1个发酵罐中分批补加浓度60-180g/L葡萄糖溶液和植物油，添加量分别为发酵罐体积的2-10%和1-4%，继续通气、搅拌和发酵，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐中；

（3）第2个发酵罐中重复步骤（2），直至第n个发酵罐；

（4）在第1个发酵罐中通过补料罐加入一定体积的新鲜已灭菌的培养基，将从第n个发酵罐中加入的发酵液作为接种液，继续按步骤（2）进行；

（5）依次类推，在n个发酵罐之间形成多级串联连续流加双相发酵工艺；

（6）储罐中的发酵液静置0.5-10h小时后，槐糖脂自动沉降于发酵液底层，中间层为酵母菌聚集体，上层为发酵上清液；静置分离得到下层的槐糖脂，直接保藏。

所述发酵罐的个数n=3-8。

所述的种子培养基为：每1L的自来水中溶解葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，在115℃下灭菌30min。

所述的发酵培养基为：每1L的自来水中加入酵母粉2.5g，柠檬酸钠5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾1g，葡萄糖100g，在115℃下灭菌30min；植物油100g，单独在115℃下灭菌30min。

所述的植物油为大豆油、花生油、菜籽油、玉米油、橄榄油、棉籽油、油酸中的一种或几种。

本发明的优点在于，槐糖脂生物表面活性剂的连续发酵工艺中由多个体积相同的发酵罐依次连通组成，不仅可以通过批次补料以维持较高底物利用率和较高溶氧水平；同时，前一发酵罐的部分发酵液作为种子液，不仅含有高密度的菌体细胞，而且含有前一发酵周期所生成的槐糖脂，可以有效乳化增溶新补加的油溶性底物，提高了菌体细胞对油溶性底物的吸收转化速率，从而大大缩短了发酵周期。二者相辅相成，可以大大缩短槐糖脂的发酵周期，提高发酵效率。同时，各主体发酵罐相互独立操作，单独补料和排放反应物料，可以大大避免相互感染杂菌的机会。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1：

本发明的槐糖脂生物表面活性剂多级串联连续流加双相发酵工艺流程如图1所示。

（1）在10L种子罐中装入5L种子培养基，经灭菌后，按照10%（体积比）的接种量接种接入菌种假丝酵母菌(Candida.bombicola) ATCC 22214，在温度为30℃下、曝气量为0.8vvm、搅拌速率为400rpm，发酵20小时，将种子液接种到第1个100L发酵罐中，该罐中已经装入45L已灭菌的发酵培养基。

（2）控制第1个发酵罐温度为30℃，曝气量为0.6vvm、搅拌速率为400rpm、罐压为0.11兆帕，发酵24h时，将5L的发酵液打入第2个发酵罐中，并分别在第1发酵罐发酵的48、72和96h时分别往第1发酵罐中补加已经灭菌的浓度为120g/L的葡萄糖溶液3L和1.2L花生油，继续通气搅拌和发酵，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（3）第2个发酵罐中通过补料罐加入45L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第1个发酵罐打入5L的发酵液作为接种液，控制温度为30℃、曝气量为0.6vvm、搅拌速率为400rpm、罐压为0.11兆帕，发酵24h，将5L的发酵液打入第3个发酵罐中，然后分别在第2个罐发酵的48、72和96h时，往其中补加已经灭菌的浓度为120g/L的葡萄糖溶液3L和1.2L花生油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（4）第3个发酵罐中通过补料罐加入45L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第2个发酵罐打入5L的发酵液作为接种液，控制温度为30℃、曝气量为0.6vvm、搅拌速率为400rpm、罐压为0.11兆帕，发酵24h，将5L的发酵液打入第4个发酵罐中，然后分别在发酵的48、72和96h时，往第3个发酵罐中补加已经灭菌的浓度为120g/L的葡萄糖溶液3L和1.2L花生油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（5）第4个发酵罐中通过补料罐加入45L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第3个发酵罐打入5L的发酵液作为接种液，控制温度为30℃、曝气量为0.6vvm、搅拌速率为400rpm、罐压为0.11兆帕，发酵24h，将5L的发酵液打入第1个发酵罐中，然后分别在第4个发酵罐发酵的48、72和96h时，往其中补加已经灭菌的浓度为120g/L的葡萄糖溶液3L和1.2L植物油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（6）第1个发酵罐中通过补料罐加入45L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第4个发酵罐打入5L的发酵液作为接种液，控制温度为30℃，曝气量为0.6vvm、搅拌速率为400rpm时发酵24h，将5L的发酵液打入第2个发酵罐中，然后分别在第1个罐发酵的48、72和96h时，往其中补加已经灭菌的浓度为120g/L的葡萄糖溶液3L和1.2L植物油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。依次类推，在4个发酵罐之间可以形成多级串联连续流加发酵工艺。

（7）储罐中的发酵液静止10h后，槐糖脂沉降于发酵液底层，分离得到纯度在95%以上槐糖脂。发酵产率为180g/L。

实施例2：

（1）在125L种子罐中装入75L种子培养基，经灭菌后，按照10%（体积比）的接种量接种接入菌种假丝酵母菌(Candida.bombicola) ATCC 22214，在温度为28℃、曝气量为0.6vvm、搅拌速率为500rpm，发酵24小时，将种子液接种到第1个1000L发酵罐中，该罐中已经装入425L已灭菌的发酵培养基。

（2）控制第1个发酵罐温度为28℃，曝气量为0.5vvm、搅拌速率为500rpm，罐压为0.105兆帕，发酵28h时，将75L的发酵液打入第2个发酵罐中，并分别在第1发酵罐发酵的56、84、112和140h时分别往第1发酵罐中补加已经灭菌的浓度为180g/L的葡萄糖溶液25L和15L大豆油，继续通气搅拌和发酵，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（3）第2个发酵罐中通过补料罐加入450L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第1个发酵罐打入75L的发酵液作为接种液，控制温度为28℃，曝气量为0.5vvm、搅拌速率为500rpm、罐压为0.105兆帕，发酵28h，将75L的发酵液打入第3个发酵罐中，然后分别在第2个罐发酵的56、84、112、140h时，往其中补加已经灭菌的浓度为180g/L的葡萄糖溶液25L和15L大豆油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（4）第3个发酵罐中通过补料罐加入425L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第2个发酵罐打入75L的发酵液作为接种液，控制温度为28℃，曝气量为0.5vvm、搅拌速率为500rpm、罐压为0.105兆帕，发酵28h，将75L的发酵液打入第4个发酵罐中，然后分别在发酵的56、84、112、140h时，往第3个发酵罐中补加已经灭菌的浓度为180g/L的葡萄糖溶液25L和15L大豆油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（5）第4个发酵罐中通过补料罐加入425L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第3个发酵罐打入75L的发酵液作为接种液，控制温度为28℃，曝气量为0.5vvm、搅拌速率为500rpm时发酵28h，将75L的发酵液打入第1个发酵罐中，然后分别在第4个罐发酵的56、84、112、140h时，往其中补加已经灭菌的浓度为180g/L的葡萄糖溶液25L和15L大豆油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（5）第5个发酵罐中通过补料罐加入425L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第4个发酵罐打入75L的发酵液作为接种液，控制温度为28℃，曝气量为0.5vvm、搅拌速率为500rpm时发酵28h，将75L的发酵液打入第1个发酵罐中，然后分别在第5个罐发酵的56、84、112、140h时，往其中补加已经灭菌的浓度为180g/L的葡萄糖溶液25L和15L大豆油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（6）第1个发酵罐中通过补料罐加入425L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第5个发酵罐打入75L的发酵液作为接种液，控制温度为28℃，曝气量为0.5vvm、搅拌速率为500rpm时发酵28h，将75L的发酵液打入第2个发酵罐中，然后分别在第1个罐发酵的56、84、112和140h时，往其中补加已经灭菌的浓度为180g/L的葡萄糖溶液25L和15L大豆油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。依次类推，在5个发酵罐之间可以形成多级串联连续流加发酵工艺。

（7）储罐中的发酵液静止4h后，槐糖脂沉降于发酵液底层，分离得到纯度在95%以上槐糖脂。发酵产率为225g/L。

实施例3：

（1）在50L种子罐中装入25L种子培养基，经灭菌后，按照10%（体积比）的接种量接种接入菌种假丝酵母菌(Candida.bombicola) ATCC 22214，在温度为32℃、曝气量为0.8vvm、搅拌速率为350rpm，发酵20小时，将种子液接种到第1个500L发酵罐中，该罐中已经装入225L已灭菌的发酵培养基。

（2）控制第1个发酵罐温度为32℃，曝气量为0.7vvm、搅拌速率为350rpm，罐压为0.115兆帕，发酵20h时，将25L的发酵液打入第2个发酵罐中，并分别在第1发酵罐发酵的40和60h时分别往第1发酵罐中补加已经灭菌的浓度为80g/L的葡萄糖溶液20L和5L玉米油，继续通气搅拌和发酵，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（3）第2个发酵罐中通过补料罐加入225L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第1个发酵罐打入25L的发酵液作为接种液，控制温度为32℃，曝气量为0.7vvm、搅拌速率为350rpm、罐压为0.115兆帕，发酵20h，将25L的发酵液打入第3个发酵罐中，然后分别在第2个发酵罐发酵的40和60h时，往其中补加已经灭菌的浓度为80g/L的葡萄糖溶液20L和5L玉米油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（4）第3个发酵罐中通过补料罐加入225L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第2个发酵罐打入25L的发酵液作为接种液，控制温度为32℃，曝气量为0.7vvm、搅拌速率为350rpm、罐压为0.115兆帕，发酵20h，将25L的发酵液打入第1个发酵罐中，然后分别在发酵的40、60h时，往第3个发酵罐中补加已经灭菌的浓度为80g/L的葡萄糖溶液20L和5L玉米油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。

（5）第1个发酵罐中通过补料罐加入225L的新鲜已灭菌的发酵培养基，将从第3个发酵罐打入25L的发酵液作为接种液，控制温度为32℃，曝气量为0.7vvm、搅拌速率为350rpm时发酵20h，将25L的发酵液打入第2个发酵罐中，然后分别在第1个罐发酵的40和60h时，往其中补加已经灭菌的浓度为80g/L的葡萄糖溶液20L和5L玉米油，直至发酵结束并将发酵液排放入储罐。在3个发酵罐之间可以形成多级串联连续流加发酵工艺。

（7）储罐中的发酵液静止4h后，槐糖脂沉降于发酵液底层，分离得到纯度在95%以上槐糖脂。发酵产率为145g/L。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是有可能的，其都没有超出本发明的保护范围。