具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

一种生物合成昆布二糖的方法，包括：

以纤维糊精为底物，进行三酶级联反应合成昆布二糖；

其中，三酶级联反应液中包括：纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。

在一些实施例中，所述纤维糊精的制备方法为：将微晶纤维素与浓盐酸和浓硫酸混合，进行反应，反应完成后，加水、固液分离，取上清液，加入丙酮，沉淀出可溶性纤维糊精；再用丙酮进行多次洗涤，收集沉淀物；将沉淀物溶解在水中，脱除丙酮，调节上清液至中性，固液分离，得到纤维糊精。

在一些实施例中，采用大肠杆菌表达系统表达纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶。

在一些实施例中，所述纤维糊精磷酸化酶的浓度为1.0～2.0mg/ml，优选地，为1.5mg/ml。

在一些实施例中，所述纤维二糖磷酸化酶的浓度为0.8～1.2mg/ml，优选地，为1mg/ml。

在一些实施例中，所述昆布二糖磷酸化酶的浓度为0.8～1.2mg/mlL，优选地，为1mg/mlL。

在一些实施例中，所述三酶级联反应液还包括：KH₂PO₄、Mg²⁺和柠檬酸缓冲液。

在一些实施例中，所述三酶级联反应的条件为45～55℃反应20～30h，优选地，为50℃反应24h。

实验所需溶液配制：

(1)高效液相色谱流动相溶液：5mM H₂SO₄溶液，用ddH₂O配制。

(2)8％SDS-PAG分离胶(10mL)：Tris-HCl(1.5M,pH 8.8)：2.6mL，丙烯酰胺溶液(30％)：2.6mL，SDS(10％)：0.1mL，APS(10％)：0.1mL，TEMED：6μL，ddH₂O：4.6mL。

(3)5％SDS-PAG浓缩胶(4mL)：Tris-HCl(1.5M,pH 8.8)：0.5mL，丙烯酰胺溶液(30％)：0.67mL，SDS(10％)：40μL，APS(10％)：40μL，TEMED：4μL，ddH₂O：2.7mL。

(4)5×SDS电泳缓冲液(1L)：Tris-HCl：15.1g，Glycine：94g，SDS：5g，ddH₂O定容至1L。

(5)蛋白胶染色液(1L)：无水乙醇：450mL，冰醋酸：100mL，考马斯亮蓝：5g，ddH₂O：450mL。

(6)蛋白胶脱色液(1L)：无水乙醇：50mL，冰醋酸：100mL，ddH₂O：850mL。

(7)蛋白质纯化PBS缓冲液(1L)：NaH₂PO₄ ^.2H₂O：2.46g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O：12.24g，NaCl：1.922g，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(8)LB培养基：称取10g/L蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母粉(Yeast extract)，10g/L氯化钠(NaCl)，使用ddH₂O配制。高压蒸汽灭菌后备用。在实验中，如有需要，向培养基中加入50mg/L的硫酸卡那霉素作为选择抗性。

(9)卡那霉素溶液(100mg/mL)：称取硫酸卡那霉素10g，溶于100mL ddH₂O中。完全溶解后，分装到1.5mL离心管中，冷冻保存备用。

(10)IPTG溶液(1M)：称取IPTG 28.3g，溶于100mL ddH₂O中。完全溶解后，分装到1.5mL离心管中，冷冻保存备用。

(11)50mM Tris-HCl缓冲液：称取6.06g Tris，使用800mL ddH₂O溶解后，用HCl调节至所需pH，定容至1L。

(12)50mM HEPES缓冲液：称取11.92g HEPES，使用800mL ddH₂O溶解后，调节至所需pH，定容至1L。

(13)PBS缓冲液(无咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24g Na₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(14)PBS缓冲液(20mM咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24gNa₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，1.36g咪唑，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(15)PBS缓冲液(40mM咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24gNa₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，2.72g咪唑，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(16)PBS缓冲液(250mM咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24gNa₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，17g咪唑，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(17)菌种保存液：甘油：50％(m/v)，用ddH₂O配制，高温灭菌后备用。

(18)10×SDS-PAGE缓冲液：30g/L Tris，144g/L甘氨酸，10g/L SDS，使用ddH₂O配制。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

以下实施例中，CBP、LBP和CDP的表达菌株为大肠杆菌(E.coli)，CBP的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，LBP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，CDP的氨基酸序列如SEQ IDNo:3所示。

实施例1利用大肠杆菌表达系统表达CBP、LBP和CDP。

CBP基因和自于Clostridium thermocellum，LBP基因来自于Paenibacillussp,CDP基因来Clostridium thermocellumYM4(Acetivibriothermocellus)

I.引物设计

选择PET-28a质粒，利用Snapgene软件将CBP、LBP基因插入PET-28a质粒中，进行引物设计，设计引物如下表所示。

表1扩增CBP和LBP基因的引物

II.细菌基因组的提取

取clostridium thermocellum和Paenibacillus sp.菌液各5毫升，分别置于15mL离心管中，13000×g的离心力下室温离心2min，弃上清，用1mL无菌水重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，13000×g的离心力下室温离心1min，弃上清，加入500μL抽提缓冲液，及1g石英砂，旋涡剧烈震荡3min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃水浴30min，将液体转移到新的1.5ml离心管。加入500μL三氯甲烷，旋涡剧烈震荡30s，在13000×g的离心力下室温离心10min。转移300μL上清液到另一无菌1.5ml离心管，加入0.1倍体积的3M NaAc(pH4.8)溶液，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，4℃下在13000×g的离心力下离心10min，去上清。加入700μL的70％乙醇，洗涤2次(在13000×g的离心力下，2min)后倒掉，离心5min，待乙醇完全挥发后，用20μL ddH₂O溶解基因组。

III.CBP和LBP基因扩增以及与质粒连接

用高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以CBP-F/CBP-R为引物，clostridium thermocellum基因组为模板扩增带有15bp PET-28a同源臂的CBP片段，以PET28a-CBP-F/PET28a-CBP-R为引物，以PET28a空质粒为模板扩增带有15bp CBP同源臂的PET-28a片段。以LBP-F/LBP-R为引物，Paenibacillus sp.基因组为模板扩增带有15bpPET-28a同源臂的LBP片段，以PET28a-LBP-F/PET28a-LBP-R为引物，以PET28a空质粒为模板扩增带有15bp LBP同源臂的PET-28a片段。PCR反应扩增结束后，用胶回收试剂盒回收每个片段，保证每个DNA片段的浓度较高以保证后续试验的成功。然后用MultiF SeamlessAssembly Mix试剂盒进行质粒和片段的连接，获得PET28a-CBP质粒和PET28a-CBP质粒。

其中，PCR反应体系如下:

IV.PET28a-CBP、PET28a-CBP和PET28a-CDP质粒的转化

PET28a-CDP质粒由金唯智公司合成，PET28a-CBP、PET28a-CBP质粒由上述所述过程构建。Rosetta(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25min。42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min，晃动会降低转化效率。向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。5000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含卡那霉素抗性的LB培养基上。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

V.菌落验证

对过夜培养的平板挑取单菌落，置于1.5mL带有卡那霉素抗性的LB液体培养基的EP管中，37℃，200rpm培养3h至浑浊，进行菌液PCR。PCR进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否能获得与CBP、LBP和CDP基因相同大小的条带，若有，则说明片段和质粒连接成功且质粒导入成功，可以进行下一步蛋白表达。

VI.CBP、LBP和CDP的表达和纯化

(1)配置LB液体培养基，高温蒸汽灭菌30min。温度选择121℃。

(2)待上述溶液冷却后，取出﹣20℃保存的菌株和100mg/mL的卡那霉素溶液，待其完全溶化后摇匀，先向300mL锥形瓶中加入50μL卡那霉素溶液，摇匀；加入50μL菌种保藏液，摇匀。37℃，200rpm过夜培养活化。活化后可见颜色明显变为不透明的蛋黄色。

(3)先从2L的锥形瓶中取出约5mL液体，作为后续吸光度测定的参比。向2L的锥形瓶中每个加入1mL卡那霉素溶液，摇匀后，各加入10mL已活化的大肠杆菌培养液。37℃，200rpm培养。

(4)约4-5小时后，从一瓶培养液中取约3mL液体，600nm测吸光度。如果OD值不在0.4-0.6之间，则继续培养一段时间，再次测量，直至OD值到达0.4-0.6时，每个锥形瓶加入250μL完全融化后的1M浓度的IPTG溶液，并将摇床温度降至16℃，200rpm培养约16h(或者过夜)。

(5)将大肠杆菌培养液倒入1L的离心杯中，四个离心杯配平后，4000×g离心10min(4℃)。离心结束，直接倒出上清，沉淀倒入50mL离心管，加少量含有20mM咪唑的PBS溶液(含有10％甘油)，涡旋振荡重悬细胞，此时可以﹣20℃保存。

(6)菌液倒入100mL烧杯中，加入千分之一体积的PMSF溶，混匀。利用超声破碎仪进行细胞破碎。破碎后，超速离心，13000×g，4℃离心50min。

(7)利用AKTA和Ni柱对蛋白进行纯化，纯化后脱盐，获得较纯的CBP、LBP和CDP酶蛋白。

采用SDS-PAGE凝胶分析纯化后的CBP、LBP和CDP，结果如图2所示。

实施例2以纤维素为底物三酶级联催化合成昆布二糖

I.纤维糊精的制备

称取2g微晶纤维素放入300mL锥形瓶中，加入16mL冰冷的浓盐酸和4mL冰冷的浓硫酸，加入硫酸时注意少量多次加，以防发生喷液。22℃，100rpm摇床混合4h，然后缓慢加入20mL ddH2O。在10000×g离心10min后，弃去沉淀，使用180mL冰冷的丙酮从上清液中沉淀出可溶性纤维糊精。10000×g离心，沉淀再用40mL冰冷的丙酮洗涤两次，保留沉淀。将沉淀物溶解在20mL ddH₂O中，置于通风橱中过夜挥干丙酮。然后使用Ba(OH)₂将上清液中和至pH7.0，离心去除沉淀，以获得纯的纤维糊精。

II.一锅法合成昆布二糖

以纤维糊精为底物通过三酶级联反应合成昆布二糖。反应条件如下：10mg/mL纤维糊精，30mMKH₂PO₄，5mM Mg²⁺，1.5mg/mlCDP，1mg/mlCBP，1mg/mlLBP，柠檬酸缓冲液(pH 7.0)补充至1mL，50℃反应24h。同时做不加酶对照。利用TLC进行检测。

表2本实施例中所涉及的酶

我们分别于反应2h、4h、6h、8h和10h取样，使用HPLC检测反应液中昆布二糖的含量。实验结果表明，CDP、CBP和LBP所介导的三酶级联反应可催化纤维糊精生产昆布二糖，但是产量较少。反应在8h可达到平衡，可获得0.23g/L的昆布二糖(图3)。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 大学, 山东

山东, 大学

<120> 一种生物合成昆布二糖的方法

<130> 2021.08.20

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

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Met Thr Asn Phe Gln Arg Asn Phe Ser Thr Gly Glu Val Glu Ile Glu

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<213> 人工合成

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Pro Lys Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Arg Gly Ser Phe Arg Ser His

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Ala Ala Thr Gln Val Leu Ala Thr Arg Phe Asp Met Arg Gln Glu Glu

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Asn Gly Phe Pro Ala Asn Arg Gln Phe Tyr Leu Tyr Glu Asp Gly Lys

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Gln Ile Phe Tyr Ser Ala Leu Ile Asp Asp Asn Ile Val Glu Ala Thr

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Cys Lys His Ser Cys Asn Arg Thr Val Ile Lys Tyr Lys Thr Ala Cys

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Asn Leu Glu Ile Thr Arg Thr Ile Phe Leu Val Pro His Lys Lys Gly

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Phe Pro Leu Ala Thr Glu Leu Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asn Ala Ser

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Asp Lys Ala Arg Asn Leu Ser Ile Thr Tyr Thr Gly Met Phe Gly Thr

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Gly Ala Val His Ala Ile Phe Glu Asp Val Thr Tyr Thr Asn Val Ile

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Thr Pro Asp Tyr Tyr Pro Glu Glu Phe Lys Gln Asp Thr Arg Phe Val

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Thr Met Ile Val Arg Asn Gly Asp Glu Lys Ser Phe Pro Gln Ser Phe

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Ala Ala Asp Val Ile Glu Gln Gln Ala Glu Pro Gln Arg Ser Gly Ile

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980