阅读说明：本技术 一种海藻糖的制备方法 (Preparation method of trehalose ) 是由 刘功良 杨松光 张敏倩 白卫东 梁景龙 吴玉莹 黄力 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及海藻糖制备技术领域,具体公开了一种海藻糖的制备方法。所述的海藻糖通过蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2发酵制备得到；具体通过如下方法制备得到：将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种在培养液中,在20～30℃下发酵84～108h,得发酵液；然后从发酵液中进行海藻糖的提取即得海藻糖。实验表明,采用蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2来发酵制备海藻糖可以显著提高菌种胞内海藻糖积累量,提高酵母菌发酵海藻糖的产量。(The invention relates to the technical field of trehalose preparation, and particularly discloses a preparation method of trehalose. The trehalose is prepared by fermenting LGL-2 of Zygosaccharomyces mellis; the preparation method specifically comprises the following steps: inoculating honey zygosaccharomyces mellis LGL-2 into a culture solution, and fermenting at 20-30 ℃ for 84-108 h to obtain a fermentation solution; and extracting trehalose from the fermentation liquor to obtain the trehalose. Experiments show that the trehalose prepared by fermenting LGL-2 with honey zygosaccharomyces mellis can obviously improve the intracellular trehalose accumulation of strains and improve the yield of trehalose fermented by yeasts.)

一种海藻糖的制备方法

技术领域

本发明涉及海藻糖制备技术领域，具体涉及一种海藻糖的制备方法。

背景技术

海藻糖是一种非还原性双糖，甜度较低，为蔗糖的45％，因此对牙齿损坏较小；且无毒性，在人体内能被海藻糖酶降解为葡萄糖，为人体提供能量；另外其化学性质稳定，不具有还原性，即使与氨基酸、蛋白质等混合加热也不会发生美拉德反应，是一种良好的食品添加剂。

海藻糖在生物细胞中具有稳定细胞膜和蛋白质结构的特性，能够保护生物细胞和生物活性物质在脱水、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下不遭受破坏，原因是海藻糖与蛋白质或脂质之间形成氢键从而在失水或者某些不利条件下稳定蛋白质或者脂质的构象，同时海藻糖也可以通过影响细胞壁的合成来对细胞的生长和毒力产生影响，这些特性是自然界中蔗糖、葡萄糖等其他糖类均不具备的。

由于海藻糖具有以上功能，在食品领域它不仅可以作为食品添加剂与其他甜味剂混合使用来降低甜味剂产生龋齿的副作用，还可用于防止在干燥或冷冻环境中的食品中的蛋白质发生变性；在化妆品领域海藻被认为是化妆品原料的新秀而广泛应用于皮肤化妆品中，由于其自身所具有的保湿性，可以很好地缓解皮肤的干燥问题，而无水海藻糖则可作为磷脂及酶的脱水剂用于护肤霜中；在医学领域它可作为保护剂用于酶、抗体、抗生素等生物制品中，还可制成衍生物用于抗癌剂、抗肿瘤剂中；在农业领域海藻糖可增强农作物的抗逆性，因此可通过转基因技术培育耐盐碱型农作物、抗冻果蔬等。因此，对海藻糖进行深入研究，提高海藻糖的产量，降低生产成本具有重要意义。

利用微生物发酵生产海藻糖是海藻糖的制备方法之一；如彭郦等(彭郦,曾新安.高糖胁迫对生长期酿酒酵母生理代谢的影响[J].现代食品科技,2011,27(4):397-399.)以酿酒活性干酵母为实验材料，研究了其在高糖环境胁迫下的生长状况及其胞内海藻糖积累代谢的规律，最终得到胞内海藻糖积累量达48.73mg/g。然而，现有的微生物发酵方法生产海藻糖由于发酵菌种的问题，导致菌种胞内海藻糖积累量不高，进而影响了海藻糖的产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种海藻糖的制备方法。所述的制备方法以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2来发酵制备海藻糖；采用蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2来发酵制备海藻糖可以显著提高菌种胞内海藻糖积累量。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

本发明提供一种海藻糖的制备方法，所述的海藻糖通过蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2发酵制备得到。

所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2是发明人经大量实验筛选出来的，该菌株已于2016年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址是中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学)；其保藏编号是CCTCC No.M2016787。

所述蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2的主要形态特征如下：细胞形态特征为卵圆形，生殖方式包括芽殖和孢子繁殖；菌落偏厚，凸起较大，菌落颜色呈浅黄色，表面光滑且较湿润，菌落边缘的线条特征明显。所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2通过如下方法筛选得到：

(1)将稀释100倍的百花蜜倒入装有麦芽汁琼脂培养基的培养皿中，在28℃的恒温条件下培养2d，观察菌株的生长情况，挑取单菌落，于显微镜下观察，根据酵母菌的形态特征，筛选出酵母菌；

(2)将经步骤S1.筛选出来的酵母菌，于装有含糖浓度为70％(w/v)麦芽汁琼脂培养基的培养皿中划线，在28℃的恒温条件下培养2d，并观察菌株的生长情况；将长出的菌株挑取单菌落划线分离2次，直至分离出单菌落；再将单菌落置于显微镜下观察，根据蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2的形态特征，筛选出纯的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2。

步骤(2)中所述麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：将葡萄糖、麦芽汁粉、去离子水，以及琼脂粉于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。

步骤(2)中所述的含糖浓度为70％(w/v)的麦芽汁琼脂培养基通过如下方法制备得到：

称取葡萄糖138g，麦芽汁粉13g，去离子水100mL，琼脂粉2g，于沸水浴中溶解并不断搅拌即得。

发明人研究表明，发酵菌种对于菌种胞内海藻糖积累量起着决定性的影响，如果发酵菌种选择不当，即使再优化和调整发酵条件也是无法大幅提高菌种胞内海藻糖积累量的。发明人通过大量的试验研究表明，采用海藻糖通过蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2来发酵制备海藻糖可以显著提高菌种胞内海藻糖积累量；进而提高海藻糖的产量。

发明人对在相关的研究过程中分离得到的6株蜂蜜接合酵母(1～6)，分别将它们进行分子生物学鉴定，具体结果如下：

采用提取的酵母菌总DNA为模板，真菌26SrDNAD1/D2区通用引物NL-1和NL-4作为上下游引物，扩增菌株26S rDNA片段，PCR产物电泳检测结果见图1。酵母核糖体大亚基26SrDNAD1/D2区域序列长约600bp，从图1可看出，PCR扩增出的DNA条带大小均在500～750之间，表明已经获得了26SrDNA D1/D2区的基因片段。

菌株的26SrDNA序列测定结果如表1，基于26SrDNA序列测定结果构建了包括目标菌及对照菌株在内的26SrDNAD1/D2区序列系统发育树，系统发育树以乳源酵母(Pichiafermentans)26SrDNAD1/D2区序列作为外类群，由图2的系统树可以看出菌株2～6聚在以Z.mellis ML343为代表的蜂蜜接合酵母分枝中，菌株1被聚在以Z.mellis ABT401为代表的蜂蜜接合酵母分枝中，6株菌都与蜂蜜接合酵母序列一致性都在99.0％以上，符合Kuttzman等人所定的同种内不同菌株间差异不超过1％的标准。系统发育树结果表明6株菌为蜂蜜接合酵母。其中菌株5为本发明所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2；菌株3为蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-1(保藏编号为CCTCCNo.M2015545)。其它几株菌株还未进行命名与保藏。

表1.菌株的26SrDNA序列测定

优选地，所述的制备方法，具体通过如下方法制备得到：

将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种在培养液中，在20～30℃下发酵84～108h，得发酵液；然后从发酵液中进行海藻糖的提取即得海藻糖。

进一步优选地，培养液的糖浓度为300～500g/L。

最优选地，培养液的糖浓度为400g/L。

进一步优选地，所述的制备方法，在24～28℃下发酵84～96h。

最优选地，在24℃下发酵96h。

进一步优选地，蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2是以接种液形式接种在培养液中；所述接种液的接种量为培养液重量的8～12％。

最优选地，所述接种液的接种量为培养液重量的10％。

进一步优选地，所述的接种液通过如下方法制备得到：取1～3环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到8～15mL糖浓度为300～500g/L的培养液中于25～30℃下恒温培养36～60h，然后添加至80～150mL糖浓度为300～500g/L的培养液中于25～30℃下继续恒温培养36～60h，即得接种液。

最优选地，所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到10mL糖浓度为400g/L的培养液中于28℃下恒温培养48h，然后添加至90mL糖浓度为400g/L的培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液。

发明人进一步研究表明，以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2制备海藻糖，菌种接种量、培养液的糖浓度、发酵温度以及时间等因素对蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2菌种胞内海藻糖积累量有着重要的影响，菌种接种量、培养液的糖浓度、发酵温度以及时间等因素在上述范围内，可以获得最高的海藻糖积累量。

进一步优选地，从发酵液中进行海藻糖的提取的具体方法为：将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入烘箱中处理，处理完后加入去离子水，在40～45℃下水浴15～40min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

更优选地，从发酵液中进行海藻糖的提取的具体方法为：将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入80～100℃烘箱中处理40～80min，处理完后以固液质量体积比1g：8～15mL加入去离子水，在40～45℃下水浴15～40min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

有益效果：本发明首次以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2来发酵制备海藻糖，采用蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2来发酵制备海藻糖可以显著提高菌种胞内海藻糖积累量。

附图说明

图1为菌株26S rDNA PCR扩增产物电泳结果图。

图2为基于26S rDNAD1/D2区域序列的蜂蜜接合酵母系统发育树。

图3为蒽酮-硫酸比色法测海藻糖含量的标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

本发明中培养液参照如下方法配制：称取13g麦芽汁，分别添加54g、78g、98g、118g、138g葡萄糖，然后再各自溶于100mL去离子水，配制成糖浓度分别为300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L的培养液。

本发明中斜面培养基参照如下方法配制：用电子秤称取13g麦芽汁，138g葡萄糖，2g琼脂粉，溶于100mL去离子水，制成斜面培养基。

本发明中0.2％的蒽酮硫酸试剂参照如下方法配制：称取0.2g蒽酮，用98％的硫酸溶解于100mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，置于棕色瓶。

本发明中菌种的活化方法为：从超低温冰箱中取出蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2，28℃培养箱中放置30min；挑取一环酵母在斜面培养基划线培养96h，直至出现菌落，得到活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2。

本发明中测海藻糖含量采用蒽酮-硫酸比色法测定：取待测溶液2mL，加入0.2％的蒽酮-硫酸试剂4mL，混匀后沸水浴加热5min，用自来水冷却，以水作对照测OD₆₂₅，根据图3所示的标准曲线测定海藻糖含量。

实施例1海藻糖的制备

(1)将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种液(接种量为培养液重量的10％)接种在糖浓度为400g/L的培养液中，在24℃下发酵96h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后添加至90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

经测定，在实施例1条件下蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2中海藻糖积累量达356.33mg/g(干重)；由此可见，以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2为发酵对象，在实施例1发酵条件下，蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2可以代谢产生大量的海藻糖，该方法可以大幅提高酵母菌发酵制备海藻糖的产量。

实施例2海藻糖的制备

(1)将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种液(接种量为培养液重量的12％)接种在糖浓度为300g/L的培养液中，在28℃下发酵84h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后倒入90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

经测定，在实施例2条件下蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2中海藻糖积累量达321.47mg/g(干重)；由此可见，以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2为发酵对象，在实施例2发酵条件下，蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2可以代谢产生大量的海藻糖，该方法可以大幅提高酵母菌发酵制备海藻糖的产量。

实施例3海藻糖的制备

(1)将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种液(接种量为培养液重量的8％)接种在糖浓度为500g/L的培养液中，在20℃下发酵108h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后倒入90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

经测定，在实施例3条件下蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2中海藻糖积累量达315.36mg/g(干重)；由此可见，可见以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2为发酵对象，在实施例2发酵条件下，蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2可以代谢产生大量的海藻糖，该方法可以大幅提高酵母菌发酵制备海藻糖的产量。

对比例1海藻糖的制备

(1)将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-1接种液(接种量为培养液重量的10％)接种在糖浓度为400g/L的培养液中，在24℃下发酵96h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-1加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后倒入90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1采用了蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-1(发明人前期分离得到的，可以从中国典型培养物保藏中心获得，其保藏编号是CCTCC No.M 2015545)；而实施例1则是采用蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2。

经测定，在对比例1条件下蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-1中海藻糖积累量为85.41mg/g(干酵母)；远远小于实施例1蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomycesmellis)LGL-2中的海藻糖积累量。这说明菌种对海藻糖积累量其决定性作用，采用本发明所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2可以大幅提高菌种中的海藻糖积累量。

对比例2海藻糖的制备

(1)将安琪耐高糖高活性干酵母接种液(接种量为培养液重量的10％)接种在糖浓度为400g/L的培养液中，在24℃下发酵96h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的安琪耐高糖高活性干酵母加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后倒入90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

对比例2与实施例1的区别在于，对比例2采用了安琪耐高糖高活性干酵母；而实施例1则是采用蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2。

经测定，在对比例2条件下安琪耐高糖高活性干酵母中海藻糖积累量为38.32mg/g(干酵母)；远远小于实施例1蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2中的海藻糖积累量。这说明菌种对海藻糖积累量其决定性作用，采用本发明所述的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2可以大幅提高菌种中的海藻糖积累量。

对比例3海藻糖的制备

(1)将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种液(接种量为培养液重量的15％)接种在糖浓度为600g/L的培养液中，在32℃下发酵120h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后倒入90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

对比例3和实施1的区别在于，蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2发酵过程中菌种的接种量、培养液中的糖浓度、发酵温度以及发酵时间与实施例1不同。

经测定，在对比例3条件下蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2中海藻糖积累量为98.21mg/g(干重)；由此可见，以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2为发酵对象，只有在本发明所述的菌种的接种量、培养液中的糖浓度、发酵温度以及发酵时间等条件下才能使得蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2大幅代谢产生海藻糖，发酵条件选择不当会抑制蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2代谢产生海藻糖。

对比例4海藻糖的制备

(1)将蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2接种液(接种量为培养液重量的5％)接种在糖浓度为300g/L的培养液中，在24℃下发酵60h，得发酵液；

所述的接种液通过如下方法制备得到：取2环活化好的蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2加入到10mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下恒温培养48h，然后倒入90mL糖浓度为400g/L培养液中于28℃下继续恒温培养48h，即得接种液；

(2)将发酵液进行离心得酵母泥，然后将酵母泥放入90℃烘箱中处理60min，处理完后以固液质量体积比1g：10mL加入去离子水，在42℃下水浴20min后离心，取液体浓缩干燥后即得海藻糖。

对比例4和实施1的区别在于，蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2发酵过程中菌种的接种量、培养液中的糖浓度以及发酵时间与实施例1不同。

经测定，在对比例4条件下蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2中海藻糖积累量为85.36mg/g(干重)；由此可见，以蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2为发酵对象，只有在本发明所述的菌种的接种量、培养液中的糖浓度、发酵温度以及发酵时间等条件下才能使得蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2大幅代谢产生海藻糖，发酵条件选择不当会抑制蜂蜜接合酵母(Zygosaecharomyces mellis)LGL-2代谢产生海藻糖。