阅读说明：本技术 用于结合mt1-mmp的肽配体 (For combining the peptide ligand of MT1-MMP ) 是由 D·托伊费尔 G·马德 S·帕万 于 2017-12-20 设计创作，主要内容包括：一种MT1-MMP特异的肽配体,其包含多肽,所述多肽含有两个二氨基丙酸(Dap)或N-烷基二氨基丙酸(N-AlkDap)残基,和被至少两个环序列隔开的选自半胱氨酸、Dap或N-AlkDap的第三残基,以及分子支架,当第三残基是半胱氨酸时,肽通过与多肽的Dap或N-AlkDap残基的共价烷基氨基键并通过与半胱氨酸的共价硫醚键连接到支架上,使得在分子支架上形成两个多肽环,其中肽配体包含式(II)的氨基酸序列：-A<Sub>1</Sub>-X<Sub>1</Sub>-U/O<Sub>2</Sub>-X<Sub>3</Sub>-X<Sub>4</Sub>-G<Sub>5</Sub>-A<Sub>2</Sub>-E<Sub>6</Sub>-D<Sub>7</Sub>-F<Sub>8</Sub>-Y<Sub>9</Sub>-X<Sub>10</Sub>-X<Sub>11</Sub>-A<Sub>3</Sub>-(SEQ ID NO:1)(II),或其药学上可接受的盐；其中：A<Sub>1</Sub>、A<Sub>2</Sub>和A<Sub>3</Sub>独立地为半胱氨酸、L-2,3-二氨基丙酸(Dap)、N-β-烷基-L-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)或N-β-卤代烷基-L-2,3-二氨基丙酸(N-HAlkDap),条件是A<Sub>1</Sub>、A<Sub>2</Sub>和A<Sub>3</Sub>中的至少一个是Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap；X代表任何氨基酸残基；U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性不带电荷的氨基酸残基；O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。(A kind of peptide ligand that MT1-MMP is special, it includes polypeptides, the polypeptide is containing there are two diaminopropionic acid (Dap) or N- alkyl diaminopropionic acid (N-AlkDap) residues, cysteine is selected from what is separated by least two ring sequences, the third residue of Dap or N-AlkDap, and molecular scaffold, when third residue is cysteine, peptide passes through the covalent alkyl amino key of the Dap or N-AlkDap residue with polypeptide and is keyed on bracket by the covalent thioether with cysteine, so that forming two polypeptide rings on molecular scaffold, wherein peptide ligand includes the amino acid sequence of formula (II) :-A 1 ‑X 1 ‑U/O 2 ‑X 3 ‑X 4 ‑G 5 ‑A 2 ‑E 6 ‑D 7 ‑F 8 ‑Y 9 ‑X 10 ‑X 11 ‑A 3 (SEQ ID NO:1) (II) or its pharmaceutically acceptable salt；Wherein: A 1 、A 2 And A 3 It independently is cysteine, L-2,3- diaminopropionic acid (Dap), N- β-alkyl-L-2,3- diaminopropionic acid (N-AlkDap) or N- β-halogenated alkyl-L-2,3- diaminopropionic acid (N-HAlkDap), condition is A 1 、A 2 And A 3 At least one of be Dap, N-AlkDap or N-HAlkDap；X represents any amino acid residue；U represents the uncharged amino acid residue of polarity for being selected from N, C, Q, M, S and T；O represents the non-polar aliphatic amino acid residue for being selected from G, A, I, L, P and V.)

用于结合MT1-MMP的肽配体

技术领域

本发明涉及对MT1-MMP显示出高结合亲和力的肽配体。特别地，本发明涉及此类具有新的化学品(chemistries)的肽配体，其在肽和支架分子之间形成两个或更多个键。

背景技术

不同的研究团队先前通过在肽的半胱氨酸残基和支架分子的合适官能团之间形成两个或更多个硫醚键将肽连接到支架部分。例如，WO 2004/077062和WO 2006/078161中公开了通过将含有半胱氨酸的肽与分子支架(例如三(溴甲基)苯)连接来产生候选药物化合物的方法。

利用半胱氨酸硫醇生成共价硫醚键以实现环化的优点在于它们的选择性和双正交(biorthogonal)反应性。含硫醇的线性肽可以与硫醇反应性支架化合物如1,3,5-三溴甲苯(TBMB)环化以形成双环肽，并且所得产物在苄基位置含有三个硫醚。线性肽与TBMB形成具有硫醚键的环状双环肽的总体反应显示在图1中。

需要一种将肽偶联到支架部分以形成环状肽结构的替代化学品，其采用硫醚部分的合适替代物，从而实现与不同肽的相容性、物理化学性质的改变，如改善的溶解度、生物分布的变化和其他优点。

WO2011/018227描述了用于改变第一肽配体或肽配体组的构象的方法，每个肽配体包含至少两个通过环序列隔开的反应基团，所述反应基团与分子支架共价连接，所述分子支架与所述反应基团形成共价键，产生第二肽配体或肽配体组，所述方法包括从所述第一衍生物或衍生物组的肽和支架组装所述第二衍生物或衍生物组，并入以下之一：(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变分子支架的性质；或(c)改变至少一个反应基团与分子支架之间的键；或(a)、(b)或(c)的任何组合。

我们早期公开的申请WO2016/067035和2016年5月4日提交的未决申请GB1607827.1描述了对MT1-MMP具有高结合亲和力的双环肽配体。这些申请进一步描述了肽配体与治疗剂(特别是细胞毒性剂)的缀合物。这些申请的全部公开内容明确地并入本文。

发明内容

本发明人已经发现，通过烷基氨基键取代对MT1-MMP具有亲和力的环状肽中的硫醚键导致环状肽缀合物显示出与全部用硫醚键制备的相应缀合物相似的对MT1-MMP的亲和力。预期通过烷基氨基键取代硫醚键会导致根据本发明的缀合物改善的溶解度和/或改善的氧化稳定性。

因此，在第一方面，本发明提供了一种MT1-MMP特异的肽配体，其包含多肽和分子支架，所述多肽包含选自半胱氨酸、L-2,3-二氨基丙酸(Dap)、N-β-烷基-L-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)和N-β-卤代烷基-L-2,3-二氨基丙酸(N-HAlkDap)的三个残基，所述三个残基被至少两个环序列隔开，当所述三个残基包括半胱氨酸时，肽通过与多肽的Dap或N-AlkDap或N-HAlkDap残基之间的共价烷基氨基键和通过与多肽的半胱氨酸残基之间的硫醚键连接到支架上，使得在分子支架上形成两个多肽环，其中肽配体包含式(II)的氨基酸序列：

-A₁-X₁-U/O₂-X₃-X₄-G₅-A₂-E₆-D₇-F₈-Y₉-X₁₀-X₁₁-A₃-(SEQ ID NO:1) (II)，

或其药学上可接受的盐；

其中：

A₁、A₂和A₃独立地为半胱氨酸、L-2,3-二氨基丙酸(Dap)、N-β-烷基-L-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)或N-β-卤代烷基-L-2,3-二氨基丙酸(N-HAlkDap)，条件是A₁、A₂和A₃中的至少一个是Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap；

X代表任何氨基酸残基；

U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性不带电荷的氨基酸残基；和

O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。

可以看出，本发明的衍生物包含通过至少一个烷基氨基键和多达两个硫醚键偶联至支架的肽环，其中通过所述烷基氨基键连接至N-HAlkDap残基的Dap或N-AlkDap，通过所述硫醚键连接至半胱氨酸。合适地，A₁、A₂和A₃由一个半胱氨酸和选自Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap的两个残基组成。N-AlkDap和N-HAlkDap中的前缀“烷基”是指具有1-4个碳原子的烷基，优选甲基。前缀“卤代”在该上下文中以其正常含义使用，表示具有一个或多个，合适地一个氟代、氯代、溴代或碘代取代基的烷基。

当存在半胱氨酸时，硫醚键在形成环肽期间提供锚，如下文进一步解释的。在这些实施方案中，硫醚键合适地是双环肽缀合物的中心键，即在肽序列中，形成肽中的烷基氨基键的两个残基与形成硫醚键的半胱氨酸残基间隔开并位于其两侧。因此，环状肽结构是具有中心硫醚键和两个外周烷基氨基键的双环肽缀合物。在替代实施方案中，硫醚键位于肽的N-末端或C-末端，中心键和另一末端键选自Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap。

在本发明的实施方案中，A₁、A₂和A₃中的所有三个可以合适地为Dap或N-AlkDap或N-HAlkDap。在这些实施方案中，本发明的肽配体合适地是具有中心烷基氨基键和两个外周烷基氨基键的双环缀合物，该肽形成共有中心烷基氨基键的两个环。在这些实施方案中，A₁、A₂和A₃合适地全部选自N-AlkDap或N-HAlkDap，最合适地选自N-AlkDap，因为与烷基化Dap的反应动力学良好。

合适地，X₁选自下列氨基酸中的任何一个：Y、M、F或V，如Y、M或F，特别是Y或M，更特别是Y。

适当地，U/O₂选自U，如N，或O，如G。

合适地，X₃选自U或Z，其中U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性不带电荷的氨基酸残基，Z代表选自D或E的极性带负电荷的氨基酸残基，特别是第3位的U选自Q或第3位的Z选自E。

合适地，X₄选自J，其中J代表选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基。

合适地，X₁₀选自Z，其中Z代表选自D或E的极性带负电荷的氨基酸残基，如D。

合适地，X₁₁选自O，其中O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基，如I。

合适地，式(II)的双环是式(IIa)的化合物：

-A₁-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-A₂-E-D-F-Y-Z-O-A₃-(SEQ ID NO:6)(IIa)

其中U、O、J和Z如上所定义；或者

式(IIb)的化合物：

-A₁-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(SEQ ID NO:7)(IIb)；或者

式(IIc)的化合物：

-A₁-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(SEQ ID NO:8)(IIc)；或者

式(IId)的化合物：

-A₁-Y/M-N-E/Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(SEQ ID NO:9)(IId)；或者

式(IIe)的化合物：

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)(IIe)。

合适地，式(II)的双环包含选自以下的序列：

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)；

-A₁-M-N-Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-12)(SEQ ID NO:10)；

-A₁-F-G-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-02)(SEQ ID NO:11)；

-A₁-V-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-03)(SEQ ID NO:12)；

-A₁-F-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-04)(SEQ ID NO:13)；

-A₁-Y-N-E-Y-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃(SEQ ID NO:14)；和

-A₁-Y-N-E-W-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃(SEQ ID NO:15),

如:

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)；和

-A₁-M-N-Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-12)(SEQ ID NO:10),

特别是:

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2),

最特别是：

17-69-07-N241的Dap同源物，命名为SEQ ID 16：((bAla)-Sar10-AA₁(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A₂EDFYD(tBuGly)A₃；

和17-69-07-N268的Dap同源物，命名为SEQ ID 17：AA₁(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A₂EDFYD(tBuGly)A₃。

在所有上述序列中，A₁、A₂和A₃如上文所定义。A₁、A₂和A₃的合适和优选类型和位置如上文所定义。

在实施方案中，本发明的肽配体另外包含选自以下的一个或多个修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基(如用一个或多个电子等排或等电子氨基酸取代一个或多个极性氨基酸残基；用其他非天然电子等排或等电子氨基酸取代一个或多个疏水氨基酸残基)；添加间隔基团；用一个或多个抗氧化氨基酸残基取代一个或多个氧化敏感氨基酸残基；用丙氨酸取代一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基取代一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体内的一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键取代一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，和用合适的胺、硫醇、羧酸和苯酚反应试剂对氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸)进行合成后生物正交修饰。

合适地，这些实施方案可以包括使用合适的氨基反应化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应化学的C-末端修饰。例如，N-末端修饰可包括添加分子间隔基团，其促进效应基团的缀合和双环肽对其靶标的效力的保留。间隔基团合适地是含有约5至约30个氨基酸的寡肽基团，如Ala、G-Sar10-A基团或bAla-Sar10-A基团。或者或另外地，N-末端和/或C-末端修饰包括添加细胞毒性剂。

其他可能的肽修饰包括在氨基酸第1和/或第9位的修饰。

在实施方案中，肽修饰包括用一个或多个非天然氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基。例如，其中在第4位被非天然氨基酸残基取代，选自：1-萘基丙氨酸；2-萘基丙氨酸；3,4-二氯苯基丙氨酸和高苯基丙氨酸，如1-萘基丙氨酸；2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯基丙氨酸，特别是1-萘基丙氨酸。或者或另外地，在第9位和/或第11位被非天然氨基酸残基取代，选自：第9位的4-溴苯基丙氨酸或五氟苯基丙氨酸和/或第11位的叔丁基甘氨酸。在这些实施方案中，所述非天然氨基酸残基，如存在于第9位的那些，可选自：4-溴苯基丙氨酸和/或非天然氨基酸残基，如存在于第11位的那些，选自：叔丁基甘氨酸。

在实施方案中，第1位的氨基酸残基取代D-氨基酸，如D-丙氨酸。在其他实施方案中，第5位的氨基酸残基取代D-氨基酸，如D-丙氨酸或D-精氨酸。

合适地，肽配体可包含多个上述修饰，如2、3、4或5个或更多个以下修饰，如所有以下5个修饰：第1和/或5位的D-丙氨酸、第4位的1-萘基丙氨酸、第9位的4-溴苯基丙氨酸和第11位的叔丁基甘氨酸。

在本文定义的所有肽序列中，一个或多个酪氨酸残基可以被苯基丙氨酸取代。已经发现，其在肽与支架分子的碱催化偶联期间改善了双环肽产物的产率。

合适地，本发明的肽配体是人、小鼠和狗MT1-MMP血红素结合蛋白结构域的高亲和力结合物。合适地，结合亲和力k_i小于约100nM，小于约50nM，小于约25nM，或小于约10nM。

合适地，本发明的肽配体对MT1-MMP具有选择性，但不与MMP-1、MMP-2、MMP-15和MMP-16交叉反应。合适地，与这些配体中的每一种的结合亲和力k_i大于约500nM，大于约1000nM，或大于约10000nM。

合适地，支架包含(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如三-亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地是六元环结构，优选是三取代的，使得支架具有3倍对称轴。因此，在某些优选的实施方案中，支架是1,3,5-三甲苯。在其他优选的实施方案中，支架是1,3,5-三-(乙酰胺基)苯基团，其可以通过将肽偶联到1,3,5-三-(溴乙酰胺基)苯(TBAB)而得到，如下进一步描述的。

在第二方面，本发明提供了一种肽，其包含如上文关于本发明第一方面所定义的式(II)的氨基酸序列。合适地，该肽适合于通过与如下所述的合适支架分子连接而制备根据本发明的肽配体。合适地，肽是线性肽。

另一方面，本发明提供了制备根据本发明第一方面的肽配体的方法，该方法包括：提供根据本发明第二方面的肽；提供具有至少三个反应位点的支架分子，用于与所述半胱氨酸和二氨基丙酸或β-N-烷基二氨基丙酸残基的侧链氨基形成烷基氨基键；和在肽和支架分子之间形成所述烷基氨基键。

在第三残基是半胱氨酸的实施方案中，反应位点也适合与半胱氨酸的-SH基团形成硫醚键。半胱氨酸的-SH基团是高度亲核的，并且在这些实施方案中，预期其首先与支架分子的亲电子中心反应以将肽锚定到支架分子，然后氨基与支架分子的其余亲电子中心反应，形成环状肽配体。

在实施方案中，肽在除旨在用于形成烷基氨基键的氨基和-SH基团(当存在时)以外的亲核基团上具有保护基团。

合适地，本发明的方法包括在亲核取代反应中使如本文所定义的肽与具有三个或更多个离去基团的支架分子反应。

在替代方法中，可以制备本发明的化合物，使肽的两个或更多个侧链基团转化为离去基团，然后使肽在亲核取代反应中与具有两个或更多个氨基的支架分子反应。

可以在碱存在下进行亲核取代反应，例如其中离去基团是常规的阴离子离去基团。本发明人已经发现，通过适当选择用于亲核取代反应的溶剂和碱，可以大大提高环化肽配体的产率，此外，优选的溶剂和碱不同于现有技术中仅参与硫醚键形成的溶剂和碱组合。特别地，本发明人发现当使用三烷基胺碱，即式NR₁R₂R₃的碱时，实现了改善的产率，其中R₁、R₂和R₃独立地是C1-C5烷基，合适地是C2-C4烷基，特别是C2-C3烷基。特别合适的碱是三乙胺和二异丙基乙胺(DIPEA)。这些碱具有仅仅是弱的亲核性的性质，并且认为该性质导致用这些碱观察到的较少的副反应和较高的产率。本发明人进一步发现，用于亲核取代反应的优选溶剂是极性和质子溶剂，特别是MeCN/H₂O(50:50)。

在另一方面，本发明提供药物缀合物，其包含与一种或多种效应物和/或官能团(如细胞毒性剂或金属螯合剂)缀合的本发明肽配体。

合适地，缀合物具有通过可裂解键(如二硫键)与肽配体连接的细胞毒性剂。合适地，细胞毒性剂选自DM1或MMAE。

在实施方案中，药物缀合物具有以下结构：

其中R₁、R₂、R₃和R₄代表氢或C1-C6烷基；

毒素是指任何合适的细胞毒性剂；

双环代表环状肽结构；

n代表选自1至10的整数；和

m代表选自0至10的整数。

适当地，R₁、R₂、R₃和R₄均为H；或R₁、R₂、R₃均为H和R₄＝甲基；或R₁、R₂＝甲基和R₃、R₄＝H；或R₁、R₃＝甲基和R₂、R₄＝H；或R₁、R₂＝H和R₃、R₄＝C1-C6烷基。

毒素和双环肽之间的接头可以包含通过叠氮化物官能化的毒素和炔官能化的双环肽结构之间的点击化学反应(click reaction)形成的***基团(或反之亦然)。在其他实施方案中，双环肽可含有通过羧酸官能化的毒素与双环肽的N-末端氨基之间的反应形成的酰胺键。

毒素和双环肽之间的接头可以包含组织蛋白酶可裂解的基团，以提供靶细胞内毒素的选择性释放。合适的组织蛋白酶可裂解基团是缬氨酸-瓜氨酸。

毒素和双环肽之间的接头可以包含一个或多个间隔基团以提供所需的功能，例如，对缀合物的结合亲和力或组织蛋白酶可裂解性。合适的间隔基团是对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)，其可位于缬氨酸-瓜氨酸基团和毒素部分的中间。

因此，在实施方案中，双环肽-药物缀合物可具有由毒素-PABC-cit-val-***-双环组成的以下结构：

在进一步的实施方案中，双环肽-药物缀合物可具有由毒素-PABC-cit-val-二羧酸-双环组成的以下结构：

其中(alk)是式C_nH_2n的亚烷基，其中n为1-10，可以是直链或支链的，合适的(alk)是正丙烯或正丁烯。

另一方面，本发明还提供了试剂盒，其至少包含根据本发明的肽配体或缀合物。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的肽配体或缀合物，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

此外，本发明提供了使用根据本发明的肽配体、缀合物或组合物治疗疾病的方法。适当地，该疾病是肿瘤疾病，如癌症。

在另一方面，本发明提供了诊断方法，包括使用根据本发明的肽配体或组合物诊断疾病。因此，通常可以利用分析物与肽配体的结合来置换试剂，这导致在置换时产生信号。例如，分析物(第二靶标)的结合可以置换与肽配体结合的酶(第一靶标)，为结合测定法提供了基础，特别是如果酶通过其活性位点保持在肽配体上。

附图说明

图1显示了根据现有技术制备硫醚连接的双环肽配体的反应方案；

图2显示了根据现有技术的硫醚连接的双环肽配体；命名为17-69-07-N241；

图3显示了根据本发明的第一仲氨基连接的双环肽配体；

图4显示了根据本发明的叔N-甲基氨基连接的双环肽配体；

图5显示了根据本发明的第三仲氨基连接的双环肽配体，其是17-69-07-N241的Dap类似物；

图6显示了用TBAB支架环化的根据本发明的第四仲氨基连接的双环肽配体；

图7显示了图3衍生物针对MT1-MMP的竞争性亲和结合测定法的数据；

图8显示了图4衍生物针对MT1-MMP的竞争性亲和结合测定法的数据；和

图9显示了根据本发明的另一衍生物针对MT1-MMP的竞争性亲和结合测定法的数据；

图10显示了根据本发明的某些双环肽-TBMB衍生物的示意性结构；

图11显示了根据本发明的其他双环肽-TBMB衍生物的示意性结构；

图12显示了根据本发明的其他双环肽-TBMB衍生物的示意性结构；

图13显示了根据本发明的其他双环肽-TBMB衍生物的示意性结构；

图14显示了通过点击化学反应制备根据本发明的双环肽-药物缀合物以形成***键的反应方案；

图15显示了通过具有酰氨键制备根据本发明的双环肽-药物缀合物的反应方案；

图16显示了用根据本发明的双环肽-药物缀合物处理后具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸鼠的肿瘤体积和体重随时间的变化；

图17显示了用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸鼠的肿瘤体积和体重随时间的变化；

图18显示了用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸鼠的肿瘤体积和体重随时间的变化；

图19显示了用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸鼠的肿瘤体积和体重随时间的变化；

图20显示了用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸鼠的肿瘤体积和体重随时间的变化。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义，如在肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。标准技术用于分子生物学、遗传学和生物化学方法(参见Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版John Wiley&Sons,Inc.)，其通过引用并入本文。

本发明提供如权利要求1所述的环状肽结构，其包含在分子支架上三个键之间相对的(subtend)两个肽环，中心键是两个环共同的。中心键合适地是与肽的半胱氨酸残基形成的硫醚键，或者是与肽的Dap或N-AlkDap残基形成的烷基氨基键。两个外侧键合适地是与肽的Dap或N-AlkDap残基形成的烷基氨基键，或者外侧键之一可以是与肽的半胱氨酸残基形成的硫醚键。

本领域技术人员可以理解，式(II)的第1、3、4、10和11位的X可以代表丙氨酸扫描结果和选择输出之后的任何氨基酸，其允许在这些位置处的良好耐受的取代。

在一个实施方案中，式(II)的第1位的X选自以下氨基酸中的任一个：Y、M、F或V。在另一个实施方案中，式(II)的第1位的X选自Y、M或F。在另一个实施方案中，式(II)的第1位的X选自Y或M。在又一个实施方案中，式(II)的第1位的X选自Y。

在一个实施方案中，式(II)的第2位的U/O选自U，如N。在一个替代实施方案中，式(II)的第2位的U/O选自O，如G。

在一个实施方案中，式(II)的第3位的X选自U或Z，其中U代表选自N、C、Q、M、S和T的极性不带电荷的氨基酸残基，Z代表选自D或E的极性带负电荷的氨基酸残基。在另一个实施方案中，式(II)的第3位的U选自Q。在一个替代实施方案中，式(II)的第3位的Z选自E。

在一个实施方案中，式(II)的第4位的X选自J，其中J代表选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基。在另一个实施方案中，式(II)的第4位的J选自F。在一个替代实施方案中，式(II)的第4位的J选自Y。在一个替代实施方案中，式(II)的第4位的J选自W。

在一个实施方案中，式(II)的第10位的X选自Z，其中Z代表选自D或E的极性带负电荷的氨基酸残基。在一个实施方案中，式(II)的第10位的Z选自D。

在一个实施方案中，式(II)的第11位的X选自O，其中O代表选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。在一个实施方案中，式(II)的第11位的O选自I。

在一个实施方案中，式(II)的化合物为式(IIa)的化合物：

-A₁-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-A₂-E-D-F-Y-Z-O-A₃-(SEQ ID NO:6)(IIa)；

其中U、O、J和Z如上所定义。

在一个实施方案中，式(II)的化合物为式(IIb)的化合物：

-A₁-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(SEQ ID NO:7)(IIb)。

在一个实施方案中，式(II)的化合物为式(IIc)的化合物：

-A₁-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(SEQ ID NO:8)(IIc)。

在一个实施方案中，式(II)的化合物为式(IId)的化合物：

-A₁-Y/M-N-E/Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(SEQ ID NO:9)(IId)。

在一个实施方案中，式(II)的化合物为式(IIe)的化合物：

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)(IIe)。

在又一个实施方案中，式(II)的肽包含选自以下的序列：

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)；

-A₁-M-N-Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-12)(SEQ ID NO:10)；

-A₁-F-G-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-02)(SEQ ID NO:11)；

-A₁-V-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-03)(SEQ ID NO:12)；

-A₁-F-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-04)(SEQ ID NO:13)；

-A₁-Y-N-E-Y-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07-N057)(SEQ ID NO:14)；和

-A₁-Y-N-E-W-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-44-N002)(SEQ ID NO:15)。

在针对MT1-MMP的血红素结合蛋白结构域的亲和力成熟后，该实施方案的肽被鉴定为有效的候选物。

在又一个实施方案中，式(II)的肽包含选自以下的序列：

-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)；和

-A₁-M-N-Q-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-12)(SEQ ID NO:10)。

在针对MT1-MMP的血红素结合蛋白结构域的亲和力成熟、核心双环序列的合成以及使用竞争实验的亲和力的定量测量之后，该实施方案的肽被鉴定为最高亲和力候选物。

在又一个实施方案中，式(II)的肽包含选自-A₁-Y-N-E-F-G-A₂-E-D-F-Y-D-I-A₃-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)的序列。该实施方案的肽被鉴定为式(II)中肽配体家族的最有效和稳定的成员。

在又一个实施方案中，式(II)的肽包含分别地选自以下的序列：

(bAla)-Sar10-AA₁(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A₂EDFYD(tBuGly)A₃)；或者

AA₁(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A₂EDFYD(tBuGly)A₃)，

其中N-末端适合地作为游离氨基存在，并且C-末端适合地被酰胺化。

在所有上述序列中，A₁、A₂和A₃如上文所定义。A₁、A₂和A₃的合适和优选的类型和位置如上文所定义。

在一个实施方案中，式(II)的某些肽与鼠、狗、食蟹猴和人MT1-MMP完全交叉反应。在进一步的实施方案中，本发明的具体示例的肽配体与鼠、狗、食蟹猴和人MT1-MMP完全交叉反应。例如，非稳定和稳定的17-69-07衍生物(即17-69-07-N219、17-69-07-N241和17-69-07-N268)都是完全交叉反应的。

在又一个实施方案中，式(II)的肽对MT1-MMP具有选择性，但不与MMP-1、MMP-2、MMP-15和MMP-16交叉反应。17-69-07核心序列和稳定的变体17-69-07-N258对MT1-MMP具有独特的选择性。合适地，对MT1-MMP的结合亲和力k_i小于约100nM，小于约50nM，小于约25nM，或小于约10nM。合适地，与MMP-1、MMP-2、MMP-15和MMP-16的结合亲和力k_i大于约500nM，大于约1000nM，或大于约10000nM。

应理解，如本文所定义的肽配体的修饰衍生物也在本发明的范围内。这种合适的修饰衍生物的示例包括选自以下的一种或多种修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基(如用一个或多个电子等排或等电子氨基酸取代一个或多个极性氨基酸残基；用其他非天然电子等排或等电子氨基酸取代一个或多个非极性氨基酸残基)；添加间隔基团；用一个或多个抗氧化氨基酸残基取代一个或多个氧化敏感氨基酸残基；用丙氨酸取代一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基取代一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体内的一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键取代一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，用适当的胺、硫醇、羧酸和苯酚反应试剂修饰氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸，以官能化所述氨基酸，和引入或取代引入适合官能化的正交反应氨基酸，例如带有叠氮基或炔基的氨基酸，其分别允许用带有炔或叠氮的部分进行官能化。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包含在氨基酸第1和/或第9位的修饰。这些位置，尤其是存在酪氨酸的位置，最易受蛋白水解的降解。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端和/或C-末端修饰。在进一步的实施方案中，其中修饰的衍生物包含使用合适的氨基反应化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应化学的C-末端修饰。在进一步的实施方案中，所述N-末端或C-末端修饰包括添加效应基团，包括但不限于细胞毒性剂、放射性螯合剂或发色团。

在进一步的实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端修饰。在进一步的实施方案中，N-末端修饰包含N-末端乙酰基。在该实施方案中，N-末端半胱氨酸基团(本文中称为C_i的基团)在肽合成期间用乙酸酐或其他合适的试剂封端，产生N-末端乙酰化的分子。该实施方案提供了去除氨肽酶的潜在识别点的优点，避免双环肽降解的可能性。

在一个替代实施方案中，N-末端修饰包括添加分子间隔基团，其促进效应基团的缀合和双环肽对其靶标的效力的保留。间隔基团合适地是含有约5至约30个氨基酸的寡肽基团，如Ala、G-Sar10-A或bAla-Sar10-A基团。在一个实施方案中，间隔基团选自bAla-Sar10-A(即17-69-07-N241)。向双环肽17-69-07中添加这些间隔基团不改变对靶蛋白的效力。

在进一步的实施方案中，修饰的衍生物包含C-末端修饰。在进一步的实施方案中，C-末端修饰包含酰胺基团。在该实施方案中，在肽合成期间合成C-末端半胱氨酸基团(本文中称为C_iii的基团)作为酰胺，产生C-末端酰胺化的分子。该实施方案提供了去除羧肽酶的潜在识别点的优点，降低双环肽蛋白水解降解的可能性。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，可以选择具有电子等排/等电子侧链的非天然氨基酸，其既不被降解蛋白酶识别，也不对靶效力具有任何不利影响。

或者，可以使用具有受限制的氨基酸侧链的非天然氨基酸，使得附近肽键的蛋白水解在构象上和空间上受到阻碍。特别地，这些涉及脯氨酸类似物、庞大的侧链、C-二取代的衍生物(例如，氨基异丁酸、Aib)和环氨基酸，简单的衍生物是氨基-环丙基羧酸。

在一个实施方案中，在第4位被非天然氨基酸残基取代。许多非天然氨基酸残基在该位置耐受良好。在进一步的实施方案中，非天然氨基酸残基，如存在于第4位的那些，选自：1-萘基丙氨酸；2-萘基丙氨酸；环己基甘氨酸，苯基甘氨酸；叔丁基甘氨酸；3,4-二氯苯基丙氨酸；环己基甘氨酸；和高苯基丙氨酸。

在又一个实施方案中，非天然氨基酸残基，如存在于第4位的那些，选自：1-萘基丙氨酸；2-萘基丙氨酸；和3,4-二氯苯基丙氨酸。与未修饰的野生型序列相比，这些取代增强了亲和力。

在又一个实施方案中，非天然氨基酸残基，如存在于第4位的那些，选自：1-萘基丙氨酸。与野生型相比，这种取代提供了最大水平的亲和力增强(大于7倍)。

在一个实施方案中，在第9和/或第11位引入非天然氨基酸残基。许多非天然氨基酸残基在这些位置耐受良好。

在另一个实施方案中，非天然氨基酸残基，如存在于第9位的那些，选自：4-溴苯基丙氨酸、五氟-苯基丙氨酸，如4-溴苯基丙氨酸。

在又一个实施方案中，非天然氨基酸残基，如存在于第11位的那些，选自：叔丁基甘氨酸。通过空间阻碍实现活性的增强和强保护邻近的氨基酸骨架免受蛋白水解。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包含多个上述修饰，如2、3、4或5个或更多个修饰。在进一步的实施方案中，修饰的衍生物包含2、3、4或5个或更多个以下修饰，如以下所有5个修饰：第1位和第5位的D-丙氨酸、第4位的1-萘基丙氨酸、第9位的4-溴苯基丙氨酸和第11位的叔丁基甘氨酸。这种多重取代是耐受的，与优于野生型的效力一致。在又一个实施方案中，修饰的衍生物包含以下修饰：第1和第5位的D-丙氨酸、第4位的1-萘基丙氨酸和第11位的叔丁基甘氨酸。这种多重取代是耐受的，与优于野生型的效力一致。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包括添加间隔基团。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个抗氧化氨基酸残基取代一个或多个氧化敏感氨基酸残基。在进一步的实施方案中，修饰的衍生物包含用萘基丙氨酸或丙氨酸残基取代色氨酸残基。该实施方案提供了改善所得双环肽配体的药物稳定性特征的优点。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个疏水氨基酸残基取代一个或多个带电荷的氨基酸残基。在一个替代实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个带电荷的氨基酸残基取代一个或多个疏水氨基酸残基。带电荷与疏水氨基酸残基的正确平衡是双环肽配体的重要特征。例如，疏水氨基酸残基影响血浆蛋白结合的程度，从而影响血浆中游离的可用部分浓度，而带电荷的氨基酸残基(特别是精氨酸)可影响肽与细胞表面上的磷脂膜的相互作用。这两者组合可以影响肽药物的半衰期、分布体积和暴露，并且可以根据临床终点进行定制。此外，带电荷氨基酸残基与疏水氨基酸残基的正确组合和数量可以减少注射部位的刺激(如果肽药物已经皮下施用)。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个D-氨基酸残基取代一个或多个L-氨基酸残基。据信该实施方案通过空间位阻和D-氨基酸稳定转角构象的倾向来增加蛋白水解稳定性(Tugyi等人(2005)PNAS，102(2)，413-418)。

在本文定义的所有肽序列中，一个或多个酪氨酸残基可以被苯丙氨酸取代。已经发现，这在碱催化的肽与支架分子偶联期间改善了双环肽产物的产率。

在进一步的实施方案中，第1位的氨基酸残基取代为D-氨基酸，如D-丙氨酸。这种取代实现了效力的保留而没有随之发生的降解。

在进一步的实施方案中，第5位的氨基酸残基取代为D-氨基酸，如D-丙氨酸或D-精氨酸。这种取代实现了效力的保留而没有随之发生的降解。

在一个实施方案中，修饰的衍生物包括去除任何氨基酸残基和用丙氨酸取代。该实施方案提供了去除潜在的蛋白水解攻击位点的优点。

应注意，上述每个修饰用于有意地改善肽的效力或稳定性。可以通过以下机制实现基于修饰的进一步的效力改善：

-并入疏水部分，其利用疏水效应并降低解离率，从而获得更高的亲和力；

-并入带电荷的基团，其利用长程离子相互作用，导致更快的结合率和更高的亲和力(参见例如Schreiber等人，Rapid,electrostatically assisted association ofproteins(1996),Nature Struct.Biol.3,427-31)；和

-向肽中并入额外的限制，例如通过正确地限制氨基酸的侧链使得在靶标结合时熵的损失最小，限制骨架的扭转角使得在靶标结合时熵的损失最小，以及出于同样的原因在分子中出引入额外的环化。

(综述参见Gentilucci等人，Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,3185-203,和Nestor等人，Curr.Medicinal Chem(2009),16,4399-418)。

本发明包括本发明的所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的化合物，即式(II)的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子取代，和式(II)的化合物，其中连接金属螯合基团(称为“效应物”)，其能够保持相关的(放射性)同位素，和式(1)的化合物，其中某些官能团被相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团共价取代。

适合包含在本发明化合物中的同位素的示例包括氢的同位素，如²H(D)和³H(T)；碳，如¹¹C、¹³C和¹⁴C；氯，如³⁶Cl；氟，如¹⁸F；碘，如¹²³I、¹²⁵I和¹³¹I；氮，如¹³N和¹⁵N；氧，如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O；磷，如³²P；硫，如³⁵S；铜，如⁶⁴Cu；镓，如⁶⁷Ga或⁶⁸Ga；钇，如⁹⁰Y；和镏，如¹⁷⁷Lu；和铋，如²¹³Bi。

某些同位素标记的式(II)化合物，例如并入放射性同位素的化合物，可用于药物和/或底物组织分布的研究中，并用于临床评估患病组织(如肿瘤和其他部位)MT1-MMP靶标的存在和/或不存在。式(II)化合物还可具有有价值的诊断性质，因为它们可用于检测或鉴定标记化合物与其他分子、肽、蛋白质、酶或受体之间复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用标记有标记试剂的化合物，如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶)等。鉴于其易于并入和现成的检测手段，放射性同位素氚，即³H(T)和碳-14，即¹⁴C，特别适用于此目的。

用较重的同位素如氘(即²H(D))取代可以提供某些治疗优势，这是由于更高的代谢稳定性，例如体内半衰期延长或剂量需求减少，因此在某些情况下可能是优选的。

用正电子发射同位素(如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查靶标占有率。

将同位素并入金属螯合效应基团(如⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga和¹⁷⁷Lu)中，可用于使用PET或SPECT成像可视化肿瘤特异性抗原。

将同位素并入金属螯合效应基团，如但不限于⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu和²¹³Bi，可以提供靶向放射疗法的选择，其中具有金属螯合剂的式(II)化合物携带针对靶蛋白和作用部位的治疗性放射性核素。

同位素标记的式(II)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些类似的方法、使用适当的同位素标记的试剂代替先前使用的未标记试剂来制备。

在本文中，特异性是指配体与其同源靶标(排除与靶标相似的实体)结合或以其他方式相互作用的能力。例如，特异性可以指配体抑制人酶相互作用、但不抑制来自不同物种的同源酶的能力。使用本文所述的方法，可以调节特异性，即增加或减少特异性，以使配体或多或少地能够与预期靶标的同源物或旁系同源物相互作用。特异性不旨在与活性、亲和力或亲合力同义，并且配体对其靶标的作用效力(例如，结合亲和力或抑制水平)不一定与其特异性相关。

如本文所用，结合活性是指从结合测定法获得的定量结合测量，例如如本文所述。因此，结合活性是指以给定的靶标浓度结合的肽配体的量。

多特异性是结合两个或更多靶标的能力。通常，由于其构象特性，结合肽能够结合单个靶标，如抗体情况下的表位。然而，可以开发可结合两个或更多个靶标的肽；例如，如上所述的本领域已知的双特异性抗体。在本发明中，肽配体能够结合两个或更多个靶标，因此是多特异性的。适当地，其结合两个靶标，是双特异性的。结合可以是独立的，这意味着肽上的靶标结合位点在结构上不受靶标中的一个或另一个结合的阻碍。在这种情况下，两个靶标可以独立地结合。更一般地，预期一个靶标的结合将至少部分地阻碍另一个靶标的结合。

双特异性配体和具有包括两个相关靶标的特异性的配体之间存在根本区别。在第一种情况下，配体对两个靶标独立地具有特异性，并且以特定方式与每个靶标相互作用。例如，配体中的第一环可以与第一靶结合，第二环可以与第二靶结合。在第二种情况下，配体是非特异性的，因为它不区分两个靶标，例如与两个靶标共有的靶标表位相互作用。

在本发明的上下文中，对例如靶标和直系同源物具有活性的配体可能是双特异性配体。然而，在一个实施方案中，配体不是双特异性的，但具有不太精确的特异性，使得其结合靶标和一种或多种直系同源物。通常，由于缺乏对双特异性的选择压力，未针对靶标及其直系同源物进行选择的配体不太可能是双特异性的。在提供定制的结合表面方面，双环肽中的环长度可能是决定性的，使得可以获得良好的靶标和直系同源物交叉反应性，同时保持对较不相关的同源物的高选择性。

如果配体是真正的双特异性的，在一个实施方案中，配体靶特异性中至少一种在所选择的配体中是常见的，并且该特异性的水平可以通过本文公开的方法调节。不需要共有第二或更多特异性，并且不需要是本文所述方法的主旨。

分子支架是能够在多个点连接肽以赋予肽一种或多种结构特征的任何分子。优选地，分子支架包含至少三个肽的连接点，称为支架反应基团。这些基团能够与Dap或N-AlkDap或半胱氨酸(当存在时)残基反应(在肽上，以形成稳定的共价烷基氨基和硫醚键。分子支架优选的结构如下所述。

因此，本发明化合物包含与分子支架共价结合的肽、基本上由其组成或由其组成。术语“支架”或“分子支架”在本文中是指本发明化合物中的化学部分，其以烷基氨基键和硫醚键(当第三残基是半胱氨酸时)与肽键合。术语“支架分子”或“分子支架分子”在本文中是指能够与肽或肽配体反应的分子，以形成具有烷基氨基的，在某些实施方案中还具有硫醚键的本发明衍生物。因此，除了分子的各个反应基团(如离去基团)被支架部分中肽的烷基氨基和硫醚键取代以外，支架分子具有与支架部分相同的结构。

分子支架分子是能够在多个点连接肽以形成与肽的硫醚和烷基氨基键的任何分子。其不是交联剂，因为其通常不连接两个肽；相反，其为单个肽提供了两个或多个连接点。分子支架分子包含肽的至少三个连接点，称为支架反应基团。这些基团能够与肽上的-SH和氨基反应形成硫醚和烷基氨基键。因此，分子支架代表支架部分，其延及至(up to)但不包括本发明缀合物中的硫醚和烷基氨基键。支架分子具有支架的结构，但在本发明缀合物中的硫醚和烷基氨基键的位置处具有反应基团。

合适地，支架包含(杂)芳香族或(杂)脂环族部分、基本上由(杂)芳香族或(杂)脂环族部分组成或由(杂)芳香族或(杂)脂环族部分组成。

如本文所用，“(杂)芳基”意指包括芳环，例如，具有4至12个成员的芳环，如苯环。这些芳环可任选地含有一个或多个杂原子(例如N、O、S和P中的一个或多个)，如噻吩基环、吡啶基环和呋喃基环。芳环可任选被取代。“(杂)芳基”还意指包括与一个或多个其他芳环或非芳环稠合的芳环。例如，出于本申请的目的，萘基、吲哚基、噻吩并噻吩基、二噻吩并噻吩基和5,6,7,8-四氢-2-萘基(各自可任选被取代)是芳基。如上所述，芳环可以是任选取代的。合适的取代基包括烷基(可任选被取代)、其他芳基(其本身可被取代)、杂环(饱和或不饱和)、烷氧基(其意指包括芳氧基(例如，苯氧基)、羟基、醛基、硝基、胺基(例如，未取代的、或被芳基或烷基单-或二-取代)、羧酸基团、羧酸衍生物(例如羧酸酯、酰胺等)、卤素原子(例如，Cl、Br和I)等。

如本文所用，“(杂)脂环族”是指同环或杂环饱和环。环可以是未取代的，或者可以被一个或多个取代基取代。取代基可以是饱和的或不饱和的、芳香族的或非芳香族的，合适的取代基的示例包括上面讨论的与烷基和芳基上的取代基有关的取代基。此外，两个或更多个环取代基可以组合形成另一个环，因此如本文所用，“环”意指包括稠环系统。

合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如三-亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地是六元环结构，优选三取代的，使得支架具有3倍对称轴。

在实施方案中，支架是三-亚甲基(杂)芳基部分，例如1,3,5-三亚甲基苯部分。在这些实施方案中，相应的支架分子合适地在亚甲基碳上具有离去基团。然后亚甲基形成如本文所定义的烷基氨基键的R₁部分。在这些亚甲基取代的(杂)芳香族化合物中，芳环的电子可以在亲核取代期间稳定过渡态。因此，例如，苄基卤化物对亲核取代的反应性比未与(杂)芳香族基团连接的烷基卤化物的反应性高100-1000倍。

在这些实施方案中，支架和支架分子具有通式：

其中LG代表如下文针对支架分子进一步描述的离去基团，或LG(包括形成烷基氨基的R₁部分的相邻亚甲基)代表连接至本发明缀合物中的肽的烷基氨基键。

在实施方案中，上述基团LG可以是卤素，如但不限于溴原子，在这种情况下，支架分子是1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)。另一种合适的分子支架分子是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。其类似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但另外含有三个与苯环连接的甲基。在该支架的情况下，额外的甲基可以与肽形成进一步的接触，因此增加了额外的结构限制。因此，与1,3,5-三(溴甲基)苯相比，实现了不同的多样性范围。

用于通过亲核取代与肽反应形成支架的另一优选分子是1,3,5-三(溴乙酰胺基)苯(TBAB)：

在其他实施方案中，分子支架可具有四面体几何形状，使得编码肽的四个官能团与分子支架的反应产生不超过两种产物异构体。其他几何形状也是可能的；实际上，几乎无限数量的支架几何形状是可能的，导致肽配体多样化的更大可能性。

用于形成本发明配体的肽包含Dap或N-AlkDap或N-HAlkDap残基，用于形成至支架的烷基氨基键。二氨基丙酸的结构与现有技术中那些其中半胱氨酸被用于与支架形成硫醚键的结构类似，且与其电子等排，其中用-NH₂取代半胱氨酸的末端-SH基团：

术语“烷基氨基”在本文中以其正常化学意义使用，表示由键合至两个碳原子的NH或N(R ₃)组成的键，其中碳原子独立地选自烷基、亚烷基或芳基碳原子且R₃为烷基。合适地，本发明的烷基氨基键包含与两个饱和碳原子键合的NH部分，最合适地是亚甲基(-CH₂-)碳原子。本发明的烷基氨基键具有通式：

S–R₁–N(R₃)–R₂–P

其中：

S代表支架核心，例如(杂)芳香族或(杂)脂环族环，如下面进一步解释的；

R₁是C1至C3亚烷基，合适地是亚甲基或亚乙基，最合适地是亚甲基(CH₂)；

R₂是Dap或N-AlkDap侧链的亚甲基；

R₃是C1-4烷基，包括支链烷基和环烷基，例如甲基或H；和

P代表肽骨架，即上述键的R₂部分与Dap或N-AlkDap残基的羧基碳相邻的肽骨架中的碳原子连接。

某些式(II)的双环肽具有许多有利的性质，使得它们能够被认为是用于注射、吸入、鼻、眼、口或局部施用的合适的药物样分子。这些有利的特性包括：

-物种交叉反应。这是临床前药效学和药代动力学评估的典型要求；

-蛋白酶稳定性。双环肽配体理想地应表明对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。应在不同物种之间保持蛋白酶稳定性，以便可以在动物模型中开发、并对人类有信心地施用的双环先导候选物；

-理想的溶解度曲线。这是带电荷的亲水残基与疏水残基的比例和分子内/分子间H键的函数，其对于配制和吸收目的是重要的；和

-循环中的最佳血浆半衰期。根据临床适应症和治疗方案，可能需要在急性疾病管理环境中开发双环肽用于短期暴露，或开发在循环中具有增强保留的双环肽，从而对于更慢性疾病状态的管理是最佳的。驱动所需血浆半衰期的其他因素是为了最大治疗效率而要求持续暴露，与由于药剂持续暴露引起的伴随毒理学。

应理解，盐形式在本发明的范围内，并且对式(II)的双环肽化合物的提及包括所述化合物的盐形式。

本发明的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成，如Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑),Camille G.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,Hardcover,第388页,2002年8月中描述的方法。通常，可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水中、或在有机溶剂中、或在两者的混合物中反应来制备这些盐。

酸加成盐(单盐或二盐)可以与多种酸(无机酸和有机酸)形成。酸加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙基磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟碱、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸、以及酰化氨基酸和阳离子交换树脂。

一组特别的盐由以下形成的盐组成：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙基磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖酸。一种具体的盐是盐酸盐。另一种具体的盐是乙酸盐。

如果化合物是阴离子化合物，或具有可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO^-)，则可以与有机或无机碱形成盐，产生合适的阳离子。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子如Li⁺、Na⁺和K⁺，碱土金属阳离子如Ca²⁺和Mg²⁺，和其他阳离子如Al³⁺或Zn⁺。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH₄ ⁺)和取代的铵离子(例如NH₃R⁺、NH₂R₂ ⁺、NHR₃ ⁺、NR₄ ⁺)。一些合适的取代铵离子的示例是衍生自以下的那些：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例是N(CH₃)₄ ⁺。

当式(II)化合物含有胺官能团时，这些可以形成季铵盐，例如通过根据本领域技术人员熟知的方法与烷化剂反应。这种季铵化合物在式(II)的范围内。

根据本发明，几种缀合的肽可以一起并入相同的分子中。例如，具有相同特异性的两种这样的肽缀合物可以通过分子支架连接在一起，增加衍生物对其靶标的亲合力。或者，在另一个实施方案中，组合多种肽缀合物以形成多聚体。例如，组合两种不同的肽缀合物以形成多特异性分子。或者，可以组合三种或更多种可以相同或不同的肽缀合物以形成多特异性衍生物。在一个实施方案中，可以通过将分子支架连接在一起来构建多价复合物，所述分子支架可以相同或不同。

在另一方面，本发明提供了制备根据本发明的肽配体的方法，该方法包括：提供根据本发明的肽和支架分子；形成肽和支架分子之间的硫醚(当第三残基是半胱氨酸时)和烷基氨基键。

支架分子和肽的细节适当地如上文关于本发明的第一方面所述。

可以使用常规固相合成从氨基酸起始材料制备用于本发明方法的肽，其可以包括如本文所述的适当保护基团。这些制备肽的方法是本领域熟知的。

合适地，肽在除-SH和用于形成烷基氨基键的胺基之外的亲核基团上具有保护基团。针对氨基酸侧链的亲核性已经进行了多项研究，按降序列出：半胱氨酸中的硫醇盐、赖氨酸中的胺、组氨酸和色氨酸中的仲胺、精氨酸中的胍基胺、丝氨酸/苏氨酸中的羟基、以及最后是天冬氨酸和谷氨酸中的羧酸盐。因此，在某些情况下，可能需要将保护基团应用于肽上的更亲核的基团以防止与这些基团的不希望的副反应。

在实施方案中，本发明的方法包括：合成这样的肽，其在除了用于形成烷基氨基键的胺基之外，在亲核基团上具有保护基团，并且在用于形成烷基氨基键的胺基上具有第二保护基团，其中可在不同于用于其他亲核基团上的保护基团的条件下，除去用于形成烷基氨基键的胺基上的保护基团，然后在所选条件下处理肽以使用于形成烷基氨基键的胺基脱保护而不使其他亲核基团脱保护。然后进行与支架的偶联反应，然后去除剩余的保护基团，得到肽缀合物。

合适地，本发明的方法包括在亲核取代反应中使具有反应侧链-SH和胺基的肽与具有三个或更多个离去基团的支架分子反应。

本文的术语“离去基团”以其正常的化学意义使用，意指能够通过胺基进行亲核取代的部分。这里可以使用任何这样的离去基团，条件是其易于通过胺的亲核取代而除去。合适的离去基团是pKa小于约5的酸的共轭碱。用于本发明的离去基团的非限制性示例包括卤素，如溴、氯、碘、O-甲苯磺酸酯(OTos)、O-甲磺酸酯(OMes)、O-三氟甲磺酸酯(OTf)或O-三甲基硅烷基(OTMS)。

亲核取代反应可以在碱存在下进行，例如其中离去基团是常规的阴离子离去基团。本发明人发现，通过适当选择用于亲核取代反应的溶剂和碱(和pH)，可以大大提高环化肽配体的产率，此外，优选的溶剂和碱不同于现有技术中仅涉及形成硫醚键的溶剂和碱组合。特别地，本发明人发现当使用三烷基胺碱时实现了改善的产率，所述三烷基胺碱即为式NR₁R₂R₃的碱，其中R₁、R₂和R₃独立地是C1-C5烷基，合适地是C2-C4烷基，特别是C2-C3烷基。特别合适的碱是三乙胺和二异丙基乙胺(DIPEA)。这些碱仅具有弱的亲核性的性质，并且认为该性质导致用这些碱观察到的较少的副反应和较高的产率。本发明人进一步发现，用于亲核取代反应的优选溶剂是极性和质子溶剂，特别是含有MeCN和H₂O的MeCN/H₂O，MeCN和H₂O体积比为1:10至10:1，合适地为2:10至10:2，更合适地为3:10至10:3，特别是4:10至10:4。

可以将另外的结合或功能活性连接到与分子支架共价连接的肽的N或C末端。该官能团例如选自：能够结合在体内延长肽配体半衰期的分子的基团，和在体内延长肽配体半衰期的分子。这样的分子可以是例如HSA或细胞基质蛋白，并且能够结合在体内延长肽配体半衰期的分子的基团是对HSA或细胞基质蛋白特异的抗体或抗体片段。这种分子也可以是带有高分子量PEG的缀合物。

在一个实施方案中，官能团是结合分子，其选自包含与分子支架共价连接的肽的第二肽配体，和抗体或抗体片段。2、3、4、5或更多种肽配体可以连接在一起。这些衍生物中任何两种或多种的特异性可以相同或不同；如果它们相同，将形成多价结合结构，与单价结合分子相比，其对靶标具有增加的亲合力。此外，分子支架可以相同或不同，并且可以使相同或不同数量的环相对。

此外，官能团可以是效应基团，例如抗体Fc区。

可以在肽与分子支架结合之前或之后进行N或C末端的连接。因此，可以(合成地、或通过生物学衍生的表达系统)产生其中已经存在N或C末端肽基团的肽。然而，优选地，在肽与分子骨架组合形成缀合物之后，向N或C末端添加。例如，芴基甲氧基羰基氯可用于在肽的N-末端引入Fmoc保护基。Fmoc以高亲和力结合包括HSA的血清白蛋白，并且Fmoc-Trp或Fmoc-Lys以增加的亲和力结合。可以在保留Fmoc保护基团的情况下合成肽，然后通过烷基氨基与支架偶联。另一种选择是棕榈酰基部分，其也结合HSA并且例如已经用于利拉鲁肽(Liraglutide)以延长该GLP-1类似物的半衰期。

或者，可以制备肽与支架的缀合物，然后在N-末端修饰，例如用胺和巯基反应接头N-e-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)。通过该接头，肽缀合物可以与其他肽连接，例如抗体Fc片段。

结合功能可以是与分子支架结合产生多聚体的另一种肽；另一种结合蛋白，包括抗体或抗体片段；或任何其他所需实体，包括血清白蛋白或效应基团，如抗体Fc区。

此外，额外的结合或功能活性可以直接与分子支架结合。

在实施方案中，支架可以进一步包含可以结合额外活性的反应基团。优选地，该基团相对于分子支架上的其他反应基团是正交的，以避免与肽的相互作用。在一个实施方案中，可以保护反应基团，并在必要时脱保护以结合另外的活性。

因此，在本发明的另一方面，提供了药物缀合物，其包含与一种或多种效应物和/或官能团缀合的如本文所定义的肽配体。

效应物和/或官能团可以连接到例如多肽的N或C末端，或连接到分子支架上。

适当的效应基团包括抗体及其部分或片段。例如，效应基团可包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域、或其任何组合，除此之外，还有一个或多个恒定区结构域。效应基团还可以包含抗体的铰链区(通常在IgG分子的CH1和CH2结构域之间发现这种区域)。

在本发明该方面的另一个实施方案中，根据本发明的效应基团是IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团包含肽配体Fc融合体或由其组成，所述肽配体Fc融合体具有1天或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或更长的tβ半衰期。最有利地，根据本发明的肽配体包含具有1天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合体或由其组成。

功能基团通常包括结合基团、药物、用于连接其他实体的反应基团、有助于将大环肽摄取到细胞中的官能团等。

肽穿透到细胞中的能力将使肽有效针对细胞内的靶标。具有穿透到细胞中能力的肽可以接近的靶标包括转录因子、细胞内信号传导分子如酪氨酸激酶和参与凋亡途径的分子。能够穿透细胞的官能团包括已经添加到肽或分子支架中的肽或化学基团。如衍生自VP22、HIV-Tat、果蝇的同源盒蛋白(触角蛋白)等的肽，例如，如Chen和Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)第35卷,第4部分,第821页；Gupta等人，Advanced Drug Discovery Reviews(2004)第57卷9637所述。已显示有效通过质膜易位的短肽的示例包括来自果蝇触角蛋白的16个氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)JBiol.Chem.第269卷，第10444页)、18个氨基酸的“模型两亲性肽”(Oehlke等人(1998)Biochim Biophys Acts第1414卷，第127页)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非肽方法包括使用可以容易地附着于生物分子的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)NatureMethods第4卷第153页)。将胍基团添加到分子中的其他化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)J Biol Chem第282卷，第13585页)。可以将小分子量分子(如类固醇)添加到分子支架中以增强细胞的摄取。

可与肽配体连接的一类官能团包括抗体及其结合片段，如Fab、Fv或单结构域片段。特别地，可以使用抗体，与能够在体内增加肽配体半衰期的蛋白结合。

还可以并入与存在于许多细胞上的整联蛋白结合的RGD肽。

在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应基团具有选自下的tβ半衰期：12小时或更长、24小时或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、7天或更长、8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长或20天或更长。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团或组合物具有12至60小时的tβ半衰期。在进一步的实施方案中，其具有一天或更长的tβ半衰期。在另一个实施方案中，其半衰期在12至26小时。

在本发明的一个具体实施方案中，与环状肽缀合的官能团选自金属螯合剂，其适于络合药学相关的金属放射性同位素。当与所述放射性同位素络合时，这些效应物可以提供用于癌症治疗的有用试剂。合适的示例包括DOTA、NOTA、EDTA、DTPA、HEHA、SarAr等(Targeted Radionuclide therapy,Tod Speer,Wolters/Kluver Lippincott Williams&Wilkins,2011)。

可能的效应基团还包括酶，例如用于酶/前药治疗的羧肽酶G2，其中肽配体取代ADEPT中的抗体。

在本发明该方面的一个具体实施方案中，官能团选自药物，如用于癌症治疗的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂，如顺铂和卡铂、以及奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢剂包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物包括长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇，最初称为Taxol；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和托泊替康，以及II型抑制剂，包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。其他药剂可包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素D(用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素等。

在根据该方面的本发明的另一个具体实施方案中，细胞毒性剂选自DM1或MMAE。

DM1是细胞毒性剂，其是美登素的含巯基衍生物，具有以下结构：

单甲基瑞奥西汀E(MMAE)是合成的抗肿瘤剂，具有以下结构：

在一个实施方案中，细胞毒性剂通过可裂解的键(如二硫键)与双环肽连接。在另一个实施方案中，修饰与二硫键相邻的基团以控制二硫键的阻碍，并由此控制细胞毒性剂的裂解和伴随释放的速率。

已发表的工作确立了通过在二硫键的任一侧引入空间位阻来修饰二硫键对还原的易感性的潜力(Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry，22，717)。更大程度的空间位阻降低了细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身)还原剂的还原速率，从而降低了细胞内外由此释放毒素的难易程度。因此，通过仔细选择二硫键任一侧的阻碍程度，可以实现循环中二硫化物稳定性的最佳选择(使得毒素的不期望副作用最小化)与细胞内环境中的有效释放(使得治疗效果最大化)。

通过在分子构建体的靶向实体(本文，双环肽)或毒素侧引入一个或多个甲基来调节二硫键任一侧的阻碍。

因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂选自下式的化合物：

其中n代表选自1至10的整数；和

R₁和R₂独立地代表氢或甲基。

在上式化合物的一个实施方案中，n代表1，R₁和R₂均代表氢(即美登素衍生物DM1)。

在上式化合物的替代实施方案中，n代表2，R₁代表氢，R₂代表甲基(即美登素衍生物DM3)。

在该化合物的一个实施方案中，n代表2，R₁和R₂均代表甲基(即美登素衍生物DM4)。

应当理解，细胞毒性剂可以形成二硫键，并且在具有双环肽的缀合物结构中，通过几种可能的合成方案引入硫醇-毒素和硫醇-双环肽之间的二硫化物连接。

在一个实施方案中，缀合物的双环肽组分具有以下结构：

其中m代表选自0至10的整数，

双环代表如本文所述的任何合适的环状肽结构；和

R₃和R₄独立地代表氢或甲基。

其中R₃和R₄均为氢的上式化合物被认为是不受阻碍的，并且其中R₃和R₄中的一个或全部代表甲基的上式化合物被认为是受阻的。

应当理解，上式的双环肽可以形成二硫键，并且在具有细胞毒性剂的上述缀合物结构中，通过几种可能的合成方案在硫醇-毒素和硫醇-双环肽之间导入二硫化物连接。

在一个实施方案中，细胞毒性剂通过以下接头与双环肽连接：

其中R₁、R₂、R₃和R₄代表氢或C1-C6烷基；

毒素是指本文定义的任何合适的细胞毒性剂；

双环代表如本文所述的任何合适的环状肽结构；

n代表选自1至10的整数；和

m代表选自0至10的整数。

当R₁、R₂、R₃和R₄各自为氢时，二硫键受阻最小并且最易于还原。当R₁、R₂、R₃和R₄各自为烷基时，二硫键最受阻且最不易还原。氢和烷基的部分取代产生还原耐受性的逐渐增加，以及伴随的毒素裂解和释放。优选的实施方案包括：R₁、R₂、R₃和R₄均为H；R₁、R₂、R₃均为H和R₄＝甲基；R₁、R₂＝甲基，R₃、R₄＝H；R₁、R₃＝甲基，R₂、R₄＝H；以及R₁、R₂＝H，R₃、R₄＝C1-C6烷基。

在一个实施方案中，化合物的毒素是美登素，缀合物包含下式的化合物：

其中R₁、R₂、R₃和R₄如上所定义；

双环代表本文定义的任何合适的环状肽结构；

n代表选自1至10的整数；和

m代表选自0至10的整数。

在我们公开的专利申请WO2016/067035和2016年5月4日提交的未结案申请GB1607827.1中详细描述了制备上述双环肽配体与毒素的缀合物的进一步细节和方法。这些申请的全部公开内容明确地通过引用并入本文。

毒素和双环肽之间的接头可以包含通过叠氮化物官能化的毒素和炔官能化的双环肽结构之间的点击化学反应形成的***基团(或反之亦然)。在其他实施方案中，双环肽可含有通过羧酸官能化的毒素与双环肽的N-末端氨基之间的反应形成的酰胺键。

毒素和双环肽之间的接头可以包含组织蛋白酶可裂解的基团，以提供靶细胞内毒素的选择性释放。合适的组织蛋白酶可裂解的基团是缬氨酸-瓜氨酸。

毒素和双环肽之间的接头可以包含一个或多个间隔基团以提供所需的功能，例如，对缀合物的结合亲和力或组织蛋白酶可裂解性。合适的间隔基团是对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)，其可位于缬氨酸-瓜氨酸基团和毒素部分的中间。

因此，在实施方案中，双环肽-药物缀合物可具有由毒素-PABC-cit-val-***-双环组成的以下结构：

在进一步的实施方案中，双环肽-药物缀合物可具有由毒素-PABC-cit-val-二羧酸酯-双环组成的以下结构：

其中(alk)是式C_nH_2n的亚烷基，其中n为1-10，可以是直链或支链的，合适地(alk)是正丙烯或正丁烯。

合适地，双环肽-药物缀合物选自BT17BDC53、BT17BDC59、BT17BDC61、BT17BDC62和BT17BDC68，如下文所定义。

根据本发明的肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外测定法和试剂应用等。

通常，肽配体的使用可以替代抗体的使用。根据本发明选择的衍生物在通过标准免疫组织化学程序的蛋白印记分析和原位蛋白检测中诊断使用；为了在这些应用中使用，可以根据本领域已知的技术标记所选库的衍生物。此外，当与色谱载体(如树脂)复合时，这些肽配体可以在亲和色谱步骤中用于制备。所有这些技术都是本领域技术人员所熟知的。根据本发明的肽配体具有与抗体相似的结合能力，并且可以在这种测定法中替代抗体。

诊断用途包括通常抗体所得以应用的任何用途，包括测试条测定法、实验室测定法和免疫诊断测定法。

根据本发明制备的肽配体的治疗和预防用途包括向受体哺乳动物(如人)施用根据本发明选择的衍生物。优选至少90-95％同质性(最优选98-99％或更高同质性)的基本上纯的肽配体用于施用给哺乳动物用于药物用途，特别是当哺乳动物是人时。一旦纯化、部分纯化或至所需同质性，所选择的肽可用于诊断或治疗(包括体外)或开发和进行测定步骤、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)Immunological Methods,Volumes Iand II,Academic Press,NY)。

通常，本发明的肽配体将以纯化形式与药理学上合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液、包括盐和/或缓冲介质的任何载体。肠胃外运载体(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠以及乳酸林格氏液。合适的生理学上可接受的佐剂(如果需要将肽复合物保持在悬浮液中)可选自增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。

静脉内运载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。

本发明的肽配体可以作为分开施用的组合物使用或与其他药剂联合使用。这些药剂可包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、以及免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其他药剂联合本发明所选的抗体、其受体或结合蛋白的“混合物”，或甚至具有不同特异性的本发明所选肽的组合，如使用不同的靶标衍生物所选择的肽，无论它们是否在施用前汇集。

根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员公知的任何一种。对于治疗，包括但不限于免疫疗法，可以根据标准技术将本发明所选的抗体、受体或其结合蛋白施用至任何患者。施用可以通过任何适当的方式进行，包括肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、通过肺部途径、或者适当地，通过用导管直接输注。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时施用、禁忌症(counter-indication)和临床医生应考虑的其他参数。

可以冻干本发明的肽配体用于储存，并在使用前在合适的载体中重构。已经证明该技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。

可以施用含有本发明肽配体或其混合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将实现至少部分抑制、抑制、调节、杀伤或一些其他可测量参数的所选细胞群的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常为每千克体重0.005至5.0mg所选的肽配体，更通常使用的剂量为0.05至2.0mg/kg/剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体或其混合物的组合物也可以相似或稍低的剂量施用。

含有本发明肽配体的组合物可用于预防和治疗环境，以帮助改变、失活、杀伤或除去哺乳动物中选择的靶细胞群。此外，本文所述的所选肽库可以在体外或体外选择性地用于杀死、消耗或以其他方式有效地从异质细胞集合中除去靶细胞群。来自哺乳动物的血液可以在体外与所选择的肽配体组合，从而根据标准技术将不需要的细胞杀死或以其他方式从血液中除去以用于返回哺乳动物。

参考以下实施例进一步描述本发明。

实施例

材料和方法

蛋白表达

MT1-MMP血红素结合蛋白样重复序列(也称为MT1-MMP血红素结合蛋白结构域)，来自人基因的残基Cys319-Gly511，使用pEXPR-IBA42(IBA)表达载体在HEK293细胞中作为分泌的N-末端His6标记的可溶性蛋白瞬时表达。表达后，通过镍-NTA亲和色谱法纯化蛋白，然后进行凝胶过滤，通过SDS-PAGE检查纯度。在存在/不存在血红素结合蛋白结构域结合的双环的情况下，还通过荧光热移实验监测批次间变异性。

肽合成

基于Fmoc化学、使用Peptide Instruments制造的Symphony肽合成仪和MultiSynTech制造的Syro II合成仪进行肽合成。使用标准Fmoc-氨基酸(Sigma，Merck)，其具有以下侧链保护基团：Arg(Pbf)；Asn(Trt)；Asp(OtBu)；Cys(Trt)；GIu(OtBu)；Gln(Trt)；His(Trt)；Lys(Boc)；Ser(tBu)；Thr(tBu)；Trp(Boc)和Tyr(tBu)(Sigma)。偶联试剂是HCTU(Pepceuticals)，二异丙基乙胺(DIPEA，Sigma)用作碱，并用含20％哌啶的DMF(AGTC)实现脱保护。使用0.37mmol/gr Fmoc-Rink酰胺AM树脂(AGTC)进行合成，Fmoc-氨基酸以4倍过量使用，碱相对于氨基酸过量4倍。将氨基酸以0.2M溶解于DMSO中，HCTU以0.4M溶解于DMF中，DIPEA以1.6M溶解于N-甲基吡咯烷酮(AlfaAesar)中。条件是在含有20-50％DMSO的DMF中进行偶联反应，这减少了固相合成期间的聚集和缺失并提高了产率。偶联时间通常为30分钟，脱保护时间为2×5分钟。使Fmoc-N-甲基甘氨酸(Fmoc-Sar-OH，Merck)偶联1小时，脱保护和随后残基的偶联时间分别为20分钟和1小时。合成后，用二氯甲烷洗涤树脂，并干燥。使用10mL 95：2.5：2.5：2.5v/v/v/w TFA/H₂O/iPr₃SiH/二硫苏糖醇进行侧链保护基团从支持物的裂解，持续3小时。裂解后，过滤除去废树脂，将滤液加入已在-80℃冷却的35mL二***中。离心肽沉淀，弃去***上清液，用冷***再洗涤两次肽沉淀。然后将肽在5-10mL乙腈-水中再溶解并冻干。移除小样品，用于通过质谱法(来自Applied Biosystems的MALDI-TOF，Voyager DE)分析粗产物的纯度。冻干后，将肽粉末溶于10mL 6M盐酸胍的H₂O中，其中补充有0.5mL的1M二硫苏糖醇，加载到C8Luna制备型HPLC柱(Phenomenex)上。用0.1％七氟丁酸酸化溶剂(H₂O，乙腈)。使用Gilson制备型HPLC系统，在15分钟内梯度范围为30-70％乙腈，流速为15-20mL/min。含有纯的线性肽物质的级分(如MALDI所鉴定)用于通过偶联至支架分子来制备双环衍生物，如下文进一步描述。

除非另有说明，否则所有氨基酸均以L-构型使用。使用上述一般方法将非天然氨基酸并入肽序列中。本文采用的非天然氨基酸前体列表总结在下表中：

此外，以下非天然氨基酸前体用于制备DAP和N-MeDAP修饰肽：

化合物	CAS	Mw	供应商
				Fmoc-L-Dap(Boc,Me)-OH	446847-80-9	440.49	Iris Biotech GMBH
Fmoc-Dap(Boc)-OH	162558-25-0	426.46	Sigma Aldrich

与MT1-MMP结合亲和力

使用荧光偏振(各向异性)使用竞争测定法测量结合亲和力。

本文提及的荧光示踪剂是使用5,6-羧基荧光素进行荧光素化的双环肽。可以在肽的N-末端氨基上进行荧光素化，其通过肌氨酸间隔(通常为Sar5)与双环核心序列隔开。如果N-末端氨基对肽是独特的，这可以在Fmoc固相合成期间或合成后(在用TBMB环化和纯化后)进行。荧光素化也可以在C-末端进行，通常在作为第一C-末端残基引入的赖氨酸上进行，然后通过肌氨酸间隔(通常为Sar6)将其与双环核心序列隔开。因此，N-末端示踪剂可具有描述为Fluo-Gly-Sar5-A(双环核心序列)的分子形式，对于C-末端荧光化构建体，为(双环核心序列)-A-Sar6-K(Fluo)。实施例中使用的荧光示踪剂是A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo)、A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo)和A-(17-69-12)-A-SAR6-K(Fluo)。由于17-69荧光肽的酸性，其通常制备成浓缩的DMSO储液，在100mM Tris pH 8缓冲液中从该储液制备稀释液。

由于它们对MT1-MMP血红素结合蛋白结构域(PEX)的高亲和力，本文的荧光衍生物可用于竞争实验(使用FP进行检测)。文中，用游离的非荧光双环肽滴定预先形成的PEX与荧光PEX结合的示踪剂的复合物。由于预期所有基于17-69的肽都在同一位点结合，因此滴定剂将取代PEX中的荧光示踪剂。可以定量测量复合物的解离，并测定竞争物(滴定剂)对靶蛋白的Kd。竞争方法的优点是可以准确且快速地测定非荧光双环肽的亲和力。

示踪剂的浓度通常为Kd或更低(文中为1nM)，并且结合蛋白(文中为MT1-MMP的血红素结合蛋白)为15倍过量，使得>90％的示踪剂结合。随后，滴定非荧光竞争双环肽(通常仅是双环核心序列)，使其从靶蛋白中置换荧光示踪剂。测量示踪剂的置换并与荧光偏振的下降相关联。荧光偏振的下降与非荧光滴定剂结合的靶蛋白的分数成比例，因此是滴定剂对靶蛋白亲和力的量度。

将原始数据拟合于三次方程的解析方案，该三次方程描述荧光示踪剂、滴定剂和结合蛋白之间的平衡。拟合需要荧光示踪剂对靶蛋白的亲和力值，这可以通过直接结合FP实验单独测定(参见前一部分)。使用Sigmaplot 12.0和使用Zhi-Xin Wang(FEBS Letters360(1995)111-114)描述的等式的改编版本进行曲线拟合。

参考实施例1

选择用于比较硫醚与烷基氨基支架连接的双环肽被命名为17-69-07-N241。其是硫醚形成肽与三亚甲基苯支架的双环缀合物。该双环衍生物的结构示意性地显示在图2中。缀合前的线性肽具有序列：

H-(β-Ala)-Sar10-Ala-Cys-(D-Ala)-Asn-Glu-(1Nal)-(D-Ala)-Cys-Glu-Asp-Phe-Tyr-Asp-(tBuGly)-Cys-NH₂

如下进行与1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB，Sigma)的缀合。将线性肽用H₂O稀释至～35mL，加入～500μL 100mM TBMB的乙腈溶液，并用5mL 1M NH₄HCO₃的H₂O溶液引发反应。使反应在室温下进行约30-60分钟，并在反应完成后冻干(通过MALDI判断)。冻干后，如上纯化修饰的肽，同时用Gemini C18柱(Phenomenex)替换Luna C8，并将酸改变为0.1％三氟乙酸。合并含有正确TMB修饰物质的纯级分，冻干并保持在-20℃储存。

得到的命名为17-69-07-N241的双环衍生物，其显示出对MT1-MMP的高亲和力。测得的衍生物对MT1-MMP的亲和力(Kd)为0.23nM。因此，该衍生物被认为是靶向表达细胞表面金属蛋白酶MT1-MMP的肿瘤细胞的有希望的候选物。

实施例1

制备了命名为17-69-07-N385的双环肽，其对应于参考实施例1的肽配体的双环区域，减去b-Ala-Sar10尾部，并且通过DAP残基取代第一和第三半胱氨酸残基，形成与TBMB支架的烷基氨基键。该衍生物的结构如图3所示。

用于形成这种双环的线性肽如下：

Ac-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap)

线性肽和双环肽具有以下LCMS特征：

	保留时间	m/z呈现
			线性肽	4.17min	886.1,1771.7
环状肽	4.39min	942.7

如下尝试用于环化步骤的各种试剂。在所选溶剂中将试剂调整至下表中所示的浓度。向一定体积的肽溶液中加入一半体积的TBMB溶液，将混合物充分搅拌，然后一半体积的碱溶液。将反应物混合并定期取样用于LCMS分析。

实施例：向50μL肽溶液中加入25μL TBMB溶液。将溶液充分混合，然后加入25μL碱溶液。

在使用的溶剂是DMF的情况下，所有试剂均在DMF中配制。在使用的溶剂是DMSO的情况下，所有试剂均在DMSO中配制。在使用的溶剂是MeCN/H₂O的情况下，肽溶液在50％MeCN/H₂O中配制，TBMB溶液在MeCN中配制，碱溶液在H₂O中配制，除非碱是DIPEA，在这种情况下，碱溶液在MeCN中配制。所有环化均在室温下进行。结果如下(光谱范围设定为3.5-5.5分钟。整合220nm处的光谱并取得主峰的总和)：

可以看出环化后的纯度高度依赖于碱的选择。产物纯度范围为2-66％，后者包括在DIPEA存在下的乙腈/水混合物。与参考实施例1的环化不同，当使用常规NaHCO₃作为碱时，产率相对较低。使用三烷基胺即三乙胺和二异丙基乙胺(DIPEA)实现最佳产率。

与MT1-MMP结合的比较数据显示在图7中。测得的Kd为0.45nM，这表明相对于参考实施例1的硫醚连接的衍生物，该实施例中烷基氨基键的变化导致结合亲和力的显著较小的变化。

实施例2

制备了命名为17-69-07-N426的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其中用N-MeDAP残基取代DAP残基。该衍生物的结构示意性地显示在图4中。用于形成该双环的线性肽如下：

Ac-A(Dap(Me))(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap(Me))

线性肽和双环肽具有以下LCMS特征：

	保留时间	m/z呈现
			线性肽	4.19min	900.1,1799.1
双环肽	4.38min	956.0,1913.7

如实施例1中所述，将各种不同的反应条件、溶剂和碱用于环化步骤，具有以下结果(所有环化在室温下进行)：

溶剂	碱	总整合	产物整合	％产物	时间
						MeCN/H<sub>2</sub>O	Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>	21659.8	12714.5	59％	1h
MeCN/H<sub>2</sub>O	DIPEA	10547.7	9841.3	93％	16h

环化后的纯度再次取决于碱的性质。如所预期的，用Na₂CO₃作为碱的纯度低(参见实施例1)。在DIPEA存在下使用乙腈/水的最佳条件，环化后的纯度非常高(93％)，证明Dap残基的N-甲基化降低了副反应的水平。

与MT1-MMP结合的比较数据显示在图8中。测量的Kd为0.36nM，其与参考实施例1的硫醚连接的衍生物几乎没有变化。尽管键上存在两个N-甲基化，但该效力仍然保留，因此，本实施例的衍生物具有很大的吸引力。

实施例3

制备了命名为17-69-07-N428的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其中用Phe9取代Tyr9(除去Tyr羟基)。用于形成这种双环的线性肽如下：

Ac-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFF₉D(tBuGly)(Dap)

线性肽和双环肽具有以下LCMS特征：

	保留时间	m/z呈现
			线性肽	4.51min	876.5,1755.4
环状肽	4.80min	935.3

如实施例1中所述，将各种不同的反应条件、溶剂和碱用于环化步骤，具有以下结果(LCMS光谱范围设定为4-6分钟。在220nm处整合光谱并取得主峰的总和)：

溶剂

碱

温度

总整合

产物整合

％产物

时间

MeCN/H<sub>2</sub>O

DIPEA

rt

5962.8

4209.3

71％

6h

MeCN/H<sub>2</sub>O

DIPEA

50℃

5936.4

2898.3

49％

1h

DMF

DIPEA

rt

4804.6

84.7

2％

1h

DMF

DIPEA

50℃

4384.8

309.7

7％

1h

MeCN/H<sub>2</sub>O

TMG

rt

5050.8

2023.8

40％

1h

MeCN/H<sub>2</sub>O

K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>

rt

6366.7

4109.2

65％

4h

MeCN/H<sub>2</sub>O

K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>

50℃

5314.5

2306.7

43％

1h

可以看出产物纯度范围为2-71％，后者包括在DIPEA存在下的乙腈/水混合物。相对于在MeCN/H₂O/TMG/rt或MeCN/H₂O/K₂CO₃/rt条件下与含酪氨酸的肽的相同反应，去除Tyr-OH(Tyr→Phe9)显著提高了产物产率。使用DMSO作为溶剂产生非常混乱的色谱图，其具有不易分析的多个峰。

该17-69-07-N428衍生物与MT1-MMP结合的比较数据显示在图9中。测得的Kd为3.5nM。相对于参考实施例1的硫醚连接的衍生物，结合亲和力轻微降低，似乎主要归因于用Phe9取代Tyr9。

实施例4

制备命名为17-69-07-N434的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其具有与参考实施例1类似的N-末端Sar10间隔，和缀合基团PYA(4-戊炔酸，用于与毒素“点击(click)”衍生化)。该衍生物的结构如图5所示。用于形成该双环的线性肽如下：

(PYA)-(B-Ala)-Sar10-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap)

线性肽和双环肽具有以下LCMS特征：

	保留时间	m/z呈现
			线性肽	4.18	863.7,1294.8
环状肽	4.37	902.6,1353.0

如下进行环化：

溶剂

碱

温度

总整合

产物整合

％产物

时间

MeCN/H<sub>2</sub>O

DIPEA

rt

4445.6

2666.5

60％

4h

得到的衍生物17-69-07-N434是N241(参考实施例1)的Dap1/3等同物，其具有与效应物(即毒素)衍生化所需的N-末端炔烃。该肽可以与TBMB环化，纯度为60％。用MT1-MMP测量的k_d为1.52nM，使得该双环肽非常适合靶向MT1-MMP。

实施例5

通过TBAB取代实施例1至3中使用的TBMB支架分子，按照如下进行。

用于在实施例1至3中形成17-69-07-N385、17-69-07-N426和17-69-07-N428的线性肽与TBAB环化，其浓度和当量与所用的TBMB的浓度和当量相同。具有N385肽的TBAB衍生物的结构示意性地显示在图6中。

在室温下DIPEA作为选择的碱与MeCN/H₂O的溶剂混合物使用。获得了以下结果。

肽	产物保留时间	总整合	产物整合	％产物	时间
						17-69-07-N385	4.28min	9399.8	8830.0	94％	16h
17-69-07-N426	4.47min	11941.6	11485.1	96％	16h
						17-69-07-N428	4.70min	8321.8	7941.5	95％	16h

这些结果表明TBAB(卤代乙酰基)化学提供比TBMB更高的环化率和更高的选择性，如％产物列中所示。

实施例6

制备了命名为17-69-07-N474的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其中用Dap(Me)取代Cys6。用于形成该双环的线性肽如下：Ac-A(Dap(Me))(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)(Dap(Me))EDFYD(tBuGly)(Dap(Me))。

具有N385肽的TBMB衍生物的结构示意性地显示在图10中。

线性肽和双环肽具有以下LCMS特征：

	保留时间	m/z呈现
			线性肽	3.61min	599.64、898.96、1795.90
环状肽	3.98min	637.68、956.03、1910.04

根据以下步骤进行环化：将50μL的1mM肽的MeCN/H₂O(1：1)溶液与25μL2.6mM TBMB的MeCN溶液混合，然后加入25μL 200mM DIPEA的MeCN/H₂O(用乙酸将pH调节至10)，并混合溶液。(相对于反应中存在的肽，1.3当量TBMB和100当量碱)。4小时后取LCMS样品，过夜反应，反应步骤如下表所示。

总整合	产物整合	％产物	时间
				3120	1248	40	4h
3784	3632	96	18h(过夜)

以与其他实施例相同的方式评估与MT1-MMP的结合。测量的Kd为8.0nM，其小于参考实施例1的硫醚连接的衍生物。尽管键上有三个N-甲基Dap，该化合物仍以高亲和力结合，因此本实施例的衍生物是非常令人感兴趣的。

实施例7

制备根据本发明的以下其他双环肽，并使用上述方法测试与MT1-MMP的结合亲和力。这些双环肽化合物的示意结构示于图10-13。

可以看出，使用根据本发明的这些烷基氨基连接的双环化合物实现了与MT1-MMP的高亲和力。进一步的研究表明，根据本发明的双环肽与狗、小鼠/大鼠和人MT1-MMP完全交叉反应。进一步的研究表明，根据本发明的双环肽具有高度特异性，与MMP1胞外域、MMP2胞外域、MMP15胞外域(血红素结合蛋白结构域)或MMP16血红素结合蛋白结构域没有显著的交叉反应性。还测定了根据本发明的双环肽的药代动力学类似于具有至支架的三个硫醚键的相应双环肽，但在本发明的双环肽的血清测量中具有稍长的半衰期。

实施例8

根据图14中所示的反应方案制备双环肽-药物缀合物(BCD)，其中根据本发明的双环肽通过***环化反应与单甲基瑞奥西汀E(MMAE)偶联。除***基团外，缀合物中的接头基团包括缬氨酸-瓜氨酸(组织蛋白酶可裂解基团)和对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)、间隔基团。反应方案的步骤如下进行。

制备化合物3的一般步骤

在黑暗中向化合物2(30g，80mmol)的DCM(300mL)和MeOH(150mL)溶液中加入4-氨基苯基甲醇(11g，88mmol)和EEDQ(40g，160mmol)。将混合物在30℃下搅拌16小时。TLC(DCM：MeOH＝10/1，R _f＝0.43)表明化合物2被完全消耗并且形成许多新斑点。根据TLC，反应澄清(clean)。将得到的反应混合物浓缩，得到残余物，将其通过快速硅胶色谱法纯化(330g×3 Silica Flash Column，洗脱液0-20％MeOH/二氯甲烷@100mL/min)。得到化合物3(20g，52％产率)，为白色固体。

制备化合物4的一般步骤

向化合物3(5.0g，10.4mmol)的DMF(40mL)溶液中加入DIEA(5.4g，7.26mL，41.7mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(12.7g，41.7mmol)。将混合物在0℃和氮气下搅拌1小时。TLC(DCM：MeOH＝10/1，R_f＝0.66)表明化合物3完全消耗并形成一个新斑点。根据TLC，反应澄清，LCMS(ES8241-10-P1A，产物：RT＝1.15min)显示形成所需产物。在中性条件下通过制备型HPLC直接纯化所得反应混合物。得到化合物4(12g，60％产率)，为白色固体。

制备化合物5的一般步骤

一批反应如下进行：在氮气氛下，向化合物4(1.2g，1.68mmol)的DMF(10mL)溶液中加入DIEA(1.22mL，6.98mmol)，在0℃搅拌溶液10分钟，然后加入HOBt(226mg，1.68mmol)和MMAE(1.00g，1.40mmol)，将混合物脱气并用N₂吹扫3次，将其在35℃下搅拌16小时。LC-MS(ES8396-1-P1A1，产物：RT＝1.19分钟)显示化合物4被完全消耗，并且检测到具有所需质量的一个主峰。将得到的五批反应混合物在1L烧杯中组合，加入500mL水，然后形成沉淀物并过滤收集。将沉淀物用EtOAc研磨过夜。得到化合物5(5g，59％产率)，为白色固体。

制备化合物6的一般步骤

在TFA(44mmol，3.5mL)存在下，将化合物5(3.3g，2.7mmol)溶解在DCM(18mL)中，然后将溶液在25℃下搅拌3小时。随后，将反应混合物减压浓缩，以除去DCM和TFA，得到残余物。将残余物溶于THF(20mL)中，用K₂CO₃(1.8g，13mmol)处理，并将混合物在25℃下再搅拌另外的12小时。LC-MS(ES8396-2-P1B1，产物：RT＝1.04min)显示检测到具有所需质量的一个主峰。过滤反应混合物，减压浓缩，得到残余物。将残余物溶于10mL DMF中，并通过制备型HPLC(中性条件)纯化。得到化合物6(1.6g，53％产率)，为白色固体。

制备化合物7-1的一般步骤

将化合物6(1.2g，1.1mmol)和2-叠氮基乙酸(162mg，1.6mmol)溶解在DMF(10mL)中。在氮气下将TEA(450uL，3.2mmol)、HOBt(217mg，1.6mmol)和EDCI(307mg，1.6mmol)加入到该溶液中，并将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后将混合物缓慢温热至25℃，再搅拌15.5小时。LC-MS(ES8396-3-P1A，产物：RT＝1.04min)显示化合物6被完全消耗，并且检测到具有所需质量的一个主峰。向反应混合物中加入2mL水，形成澄清溶液。然后在中性条件下通过制备型HPLC直接纯化溶液。得到化合物7-1(0.9g，70％产率)，为白色固体。

制备BT17BDC-53的一般步骤

向(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE(16mg，13.26μmol，1当量)和双环炔烃(17-69-07-N434，30mg，11.09μmol，0.8当量)混合物的DMF(3mL)和H₂O(2mL)中加入CuI(1.26mg，6.63μmol，0.5当量)。将混合物在25℃和N₂下搅拌20小时。LC-MS显示(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE被完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化得到的反应混合物。获得化合物BT17BDC-53(23.7mg，6.06μmol，54.64％产率)，为白色固体。

制备BT17BDC-59的一般步骤

在氮气下向(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE(31mg，25.69μmol，1.2当量)和(17-69-07-N438，40mg，20.8μmol，1当量)混合物的DMF溶液(3mL)加入CuSO₄(10.25mg，64.24μmol，3当量)水溶液(0.4mL)和抗坏血酸(37.71mg，214.12μmol，10当量)水溶液(0.4mL)中。然后将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS显示(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE被完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化得到的反应混合物。获得BT17BDC-59(26.7mg，8.53μmol，41.02％产率)，为白色固体。

制备BT17BDC61的一般步骤

将化合物7-1(250mg，207umol)和BICY-ALKYNE 17-69-07-N450(515mg，188umol)置于50mL圆底烧瓶中，加入DMF(5mL)，然后在氮气氛下加入抗坏血酸水溶液(1M，1.88mL)和CuSO₄水溶液(1M，570uL)，然后将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS(ES8396-8-P1A，产物：RT＝1.03min)显示BICY-ALKYNE被完全消耗，并且检测到具有期望质量的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的物质，通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化滤液。获得BT17BDC61(262mg，35％产率)，为白色固体。

制备BT17BDC62的一般步骤

将化合物7-1(250mg，207umol)和BICY-ALKYNE 17-69-07-N443(368mg，188umol)置于50mL圆底烧瓶中。加入DMF(5mL)，然后加入抗坏血酸水溶液(1M，1.88mL)和CuSO₄水溶液(1M，570uL)。然后将混合物在25℃下搅拌1小时。LC-MS(ES8396-9-P1A，产物：RT＝1.07min)显示BICY-ALKYNE被完全消耗，并且检测到具有期望质量的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的物质。所得滤液直接通过制备型HPLC(TFA条件)纯化。获得BT17BDC62(253mg，42％产率)，为白色固体。

实施例9

根据图15所示的反应方案制备双环-药物缀合物(BCD)，其中根据本发明的双环肽通过接头末端的戊二酰基和肽末端的氨基之间形成酰胺而与单甲基瑞奥西汀E(MMAE)偶联。反应方案的步骤如下进行。

制备化合物3的一般步骤

在黑暗中向化合物2(7.00g，18.70mmol，1.00当量)的DCM(80.00mL)和MeOH(40.00mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(2.53g，20.56mmol，1.10当量)和EEDQ(9.25g，37.39mmol，2.00当量)。将混合物在25℃下搅拌8小时。LC-MS显示化合物2完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。减压浓缩所得反应混合物，除去溶剂，得到残余物。通过快速硅胶色谱法(120g Silica Flash柱,洗脱液0～10％MeOH/[email protected]/min)纯化残余物。得到化合物3(7.00g，14.60mmol，78.06％产率)，为白色固体。

制备化合物4的一般步骤

向化合物3(4.00g，8.34mmol，1.00当量)和氯甲酸4-硝基苯酯(6.72g，33.36mmol，4.00当量)的THF(20.00mL)和DCM(10.00mL)溶液中加入吡啶(2.64g，33.36mmol，2.69mL，4.00当量)。将反应混合物在25℃下搅拌5小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。减压浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过快速硅胶色谱法纯化(120g Silica Flash柱,洗脱液0～20％DM/[email protected]/min)。得到化合物4(2.20g，3.41mmol，40.92％产率)，为白色固体。

制备化合物5的一般步骤

将化合物4(500.00mg，775.59umol，1.00当量)和DIEA(1.00g，7.76mmol，1.35mL，10.00当量)混合物的DMF溶液(10.00mL)中在氮气下在0℃下搅拌30分钟。并将MMAE(445.49mg，620.47umol，0.80当量)和HOBt(104.80mg，775.59umol，1.00当量)加入上述混合物中。将反应混合物在氮气下在0℃下搅拌10分钟并在30℃下再搅拌18小时。LC-MS显示化合物4完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。将得到的反应混合物直接通过快速C18凝胶色谱法(330g C18Flash柱,洗脱液0～50％MeCN/H₂[email protected]/min)纯化。得到化合物5(400.00mg，326.92umol，42.15％产率)，为白色固体。

制备化合物6的一般步骤

向化合物5(430.00mg，351.44umol，1.00当量)的DCM(36.00mL)溶液中加入TFA(6.16g，54.03mmol，4.00mL，153.73当量)，并将混合物在25℃下搅拌2小时。然后将混合物减压浓缩，得到残余物，将其溶于THF(10.00mL)中，并向混合物中加入K₂CO₃(1.21g，8.79mmol，25.00当量)。将反应在25℃下搅拌12小时。LC-MS显示化合物5完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。过滤得到的反应混合物，减压浓缩滤液，得到残余物，通过快速C18凝胶色谱法纯化(120g C18Flash柱,洗脱液0～50％MeCN/H₂[email protected]/min)。得到化合物6(290.00mg，258.14umol，73.45％产率)，为白色固体。

制备化合物7的一般步骤

使用氮气球吹扫含有(400mg，356umol)的小瓶。在搅拌下加入无水DMA(5mL)并将溶液在冰水浴中冷却至0℃。然后加入DIEA(130uL，712umol)并将反应在0℃下搅拌10分钟。加入四氢吡喃-2,6-二酮(81mg，712umol)，然后除去冰浴。将反应在25℃下搅拌1小时。LC-MS(ES8396-4-P1A，产物：RT＝1.08min)显示化合物6被完全消耗，并且检测到具有期望质量的一个主峰。将混合物用5mL水稀释，然后通过制备型HPLC(中性条件)纯化。得到化合物7-2(330mg，75％产率)，为白色固体。

制备化合物8的一般步骤

在氮气下向化合物7-2(330mg，267umol)的无水DMA(4.5mL)和DCM(1.5mL)溶液中加入HOSu(92mg，800umol)，在0℃下使用冰浴搅拌10分钟。然后将EDCI(154mg，800umol)加入到混合物中，并在25℃下进一步搅拌16小时。LC-MS(ES8396-5-P1A，产物：RT＝1.15分钟)显示化合物7-2被完全消耗，并且检测到具有期望质量的一个主峰。将得到的反应混合物用5mL水稀释，然后通过制备型HPLC(中性条件)纯化。得到化合物8(250mg，70％产率)，为白色固体。

制备BT17BDC68的一般步骤

使用氮气球吹扫50mL圆底烧瓶，其中含有BICY-NH₂ 17-69-07-N451(80.0mg，30umol)的DMA(4mL)溶液。然后在25℃搅拌下加入DIEA(20uL，114umol)10分钟。然后加入化合物8(40mg，30umol)并将反应在正氮气氛下在25℃下搅拌18小时。LC-MS(ES6635-127-P1A1，产物：RT＝1.06min)显示化合物8被完全消耗，并且检测到具有期望MS的一个主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化得到的反应混合物。获得BT17BDC68(33.9mg，29％产率)，为白色固体。

实施例10

如上文所述，测量上文制备的双环肽-药物缀合物对MT1-MMP的体外结合亲和力。结果如下。

可以看出，在所有情况下，在与MMAE缀合后双环肽保持结合亲和力。

实施例11

研究了BT17BDC-53在小鼠和人血清中的血浆稳定性。在小鼠和人血清中发现缀合物是稳定的(在4μm浓度下T_1/2大于50小时)。稳定性似乎略大于其中肽通过三个硫醚键与支架连接的相应缀合物的稳定性。

实施例12

如下评估上文制备的双环肽药物缀合物针对肿瘤的体内功效。

在37℃，5％CO₂和空气的气氛中，在补充有10％热灭活的胎牛血清的EMEM培养基中，将HT1080肿瘤细胞作为单层培养物体外维持。通过胰蛋白酶-EDTA处理每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数用于肿瘤接种。

将BALB/c裸鼠在右侧皮下接种0.2ml PBS中的HT1080肿瘤细胞(％×10⁶)用于形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到134mm²时，随机分配39只动物。

将BDC化合物在含有25mM组氨酸和10％蔗糖的运载体缓冲液中配制为0.03mg/ml。每周两次(biw)施用制剂，剂量为0.3、1.3和10mg/kg。从第一次给药开始测量肿瘤体积和体重直至14天。结果如图16-20所示。

结果显示，所测试的所有五种缀合物表现出强烈的剂量依赖性肿瘤抑制。在3mg/kg和10mg/kg的剂量下，肿瘤似乎被完全根除。高达10mg/kg时BT17BDC53、61和68耐受良好。BT17BDC62耐受高达约5mg/kg。BT17BDC59耐受高达3mg/kg。这表明在BT17BDC53、61和68中存在的N-末端Sar10间隔降低了缀合物的全身毒性。

上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文中。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明所述方面和实施方案的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应该理解，要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体的实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的，用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。