阅读说明：本技术 一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用 (The ratio fluorescent probe that a kind of pair of membrane charge responds and its application in Bacteria Detection ) 是由 徐兆超 苗露 龙双双 于 2018-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用,其结构为二联咪唑盐两端连接有两个芘荧光团,能够发射芘单体或芘激基复合物荧光,分别在375nm和482nm,其结构如(1)所示。该化合物带有2个正电荷,在水溶液中由于疏水作用形成纳米聚集体而导致荧光淬灭。细菌表面带有大量的电荷,与探针纳米聚集体作用将其解聚引起荧光大幅度增强。由于细菌表面电荷分布不同,导致探针形成不同程度的单体和二聚体,从而产生芘单体和激基复合物荧光的比率变化(I<Sub>482</Sub>/I<Sub>375</Sub>)。以探针聚合物与细菌结合后产生的荧光增强,以及单体与激基复合物荧光比率变化作为荧光信号,能够识别革兰氏阴性菌或阳性菌,并且能够区分不同种类的细菌。<Image he="309" wi="700" file="DDA0001668136050000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention provides the ratio fluorescent probe of a kind of pair of membrane charge response and its application in Bacteria Detection, its structure is that there are two pyrene fluorogens for the connection of bigeminy imidazole salts both ends, pyrene monomer or pyrene exciplex fluorescence can be emitted, respectively in 375nm and 482nm, structure is such as shown in (1).The compound has 2 positive charges, leads to fluorescent quenching since hydrophobic effect forms Micelle-like Nano-structure of Two in aqueous solution.Bacterium surface has a large amount of charge, acts on probe nano aggregation and causes fluorescence to be greatly enhanced its depolymerization.Since bacterium surface distribution of charges is different, probe is caused to form different degrees of monomer and dimer, to generate the rate of change (I of pyrene monomer and exciplex fluorescence 482 /I 375 ).Using probe polymer in conjunction with bacterium after the fluorescence enhancement that generates and monomer and exciplex ratio fluorescent change as fluorescence signal, can identify Gram-negative bacteria or positive bacteria, and different types of bacterium can be distinguished.)

一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用。

背景技术

细菌，无论是致病菌还是非致病菌，都普遍存在于生物界。细菌的生长于我们的生活息息相关，每一个人的身体中大概有500-1000种不同种类的细菌数量占到了人体所有活细胞的90％，这些细菌人体的自身循环行使着各自的功能。但同时，细菌污染造成的食源性疾病也是食品安全中最突出的问题。我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30％-90％，人数占食物中毒总人数的60％-90％。因此，细菌的鉴别与检测在医疗诊断、生物学和食品安全等很多领域都非常重要。另外，细菌鉴定在发现病原体爆发、监测感染趋势和识别新威胁的出现方面也起着重要作用。目前常用的细菌检测法包括：聚合酶链式反应、单细胞和基因组DNA测序和靶向特异性免疫测定等生物学方法。但是这些传统的检测方法存在耗时长、操作繁琐，价格昂贵或者是重复性差、灵敏度低等缺点。因此，用于细菌检测的新方法的开发仍然面临巨大的挑战。

荧光检测法因具有快速、简单、灵敏、能够实时监测等优点而被开发应用于细菌的检测。已报到的荧光法检测细菌分为特异性检测和非特异性检测两种：特异性识别就是对细菌特有靶标分子的专一荧光检测，如细菌分泌的特异性蛋白酶、细菌鞭毛的甘露糖受体或者细菌表面的N-乙酰葡糖胺等，然而，这一探针只能单一检测某一种细菌，不具有普适性。非特异性检测利用了因不同细菌的表面结构和组成的不同而引起的带电量差异，通过探针与细菌的静电相互作用产生的荧光信号来鉴别细菌。考虑到非特异性途径的普遍性和简单性，对不同细菌的选择性鉴定具有重要意义。

近年来，基于静电相互作用识别细菌的荧光探针已被报道，如Bunz研究组有效地设计了一种基于聚合物/肽复合物的传感器阵列，用于快速鉴别人类尿液中的14种细菌；一种层层组装的超分子纳米组件被开发用于响应细菌消除和有效的细菌检测；另外，利用对不同细菌产生不同响应信号的多个聚集诱导发光探针，通过阵列法可以识别八种细菌。然而，目前报道的荧光探针均是基于阵列方法检测细菌，需要多个化合物的同时使用才能够实现对不同种属微小差异的区分，这种方法存在操作繁琐，重复性差，适用范围小的问题，并且只能够将不同种类细菌进行区分，不具有识别细菌的能力，如识别革兰氏阴性或阳性菌。因此，具有识别和区分不同种类细菌能力的单一荧光探针，并具细菌检测简单、快速和灵敏特性的新型荧光探针仍有待开发。

比率荧光探针通常含有两个发射波长，检测时通过发射波长的比率变化可以定性或者定量的检测目标分子。芘是一个传统的荧光团，发射400nm左右的单体荧光；而两个芘荧光团容易形成激基复合物而发射480nm左右的长波长荧光。通过控制芘分子间的距离，能够产生芘单体与激基复合物的荧光变化，因此芘常用于设计比率荧光探针。本发明就是利用芘的这一性质通过比率变化检测不同种类的细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种对膜电荷响应的比率荧光探针及其在细菌检测的应用。这一探针通过荧光增强和荧光比率变化作为信号检测带不同电荷的细菌，能够识别革兰氏阴性和阳性菌，并能够区分不同种类细菌，具有制备方法简单，检测灵敏快速的特点，性能优于已有的细菌检测探针。

本发明所述的一种对膜电荷响应的比率荧光探针，该探针为二联咪唑盐两端连接有两个芘荧光团，能够发射芘单体或芘激基复合物荧光，分别在375nm和482nm；该化合物带有2个正电荷，在水溶液中由于疏水作用形成纳米聚集体而导致荧光淬灭，其结构式如下所示：

一种对膜电荷响应的比率荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

(1)在氮气保护下，将芘和溴乙酰溴溶解于二氯甲烷，保持温度在-5-0℃，向反应液中缓慢加入氯化铝粉末，三者物质的量比为芘:溴乙酰溴:氯化铝＝1:0.5-3:0.5-3，搅拌1-3小时后得到深色溶液；将温度升到室温并搅拌6-10小时后，用冰水淬灭多余的氯化铝，随后用二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱分离得到2-溴代-1-芘基乙酮；

(2)在氮气保护下，将四氢铝锂和氯化铝溶于***，随后将溶于二氯甲烷的2-溴代-1-芘基乙酮缓慢加入反应液中，在室温下搅拌0.5-3小时后得到白色沉淀；按物质的量比四氢铝锂：氯化铝：2-溴代-1-芘基乙酮＝1:0.5-4:0.1-1；

用冰水淬灭多余的氯化铝和四氢铝锂，用盐酸调节反应液至酸性，随后用二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱分离得到1-(2-溴乙基)-芘；

(3)在氮气保护下，将二联咪唑和1-(2-溴乙基)-芘按物质的量比例1：0.5-3混合于乙腈中，升温至75-90℃回流，搅拌12-48小时后产生沉淀，沉淀用***洗涤；随后将沉淀溶于甲醇中，缓慢将六氟磷酸钾滴入溶液中得到白色沉淀产物，即对细菌膜电荷响应的比率荧光探针di-PYIM。

其合成的路线为：

一种对膜电荷响应的比率荧光探针的应用，该荧光探针用于检测不同类型表面活性剂，具体的检测方法是将表面活性剂与荧光探针混合后测荧光光谱；以荧光增强和荧光比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)作为探针响应信号，用于区分不同类型的表面活性剂。

一种对膜电荷响应的比率荧光探针的应用，通过其比率变化用于识别并区分不同种类的细菌；该荧光探针用于区分不同种类的细菌；具体检测方法如下：

(1)细菌培养；

(2)细菌收集：在10000-14000rpm条件下离心5-10分钟，弃上清，用20mM、pH＝7.4的HEPES缓冲液清洗细菌2-3次，最后用HEPES重悬细菌；

(3)在细菌中加入探针后用荧光光谱仪检测。

步骤(1)中细菌培养至OD₆₀₀＝0.1-2.0。

步骤(2)中用HEPES重悬至细菌的OD₆₀₀＝0.05-2.0，探针的终浓度为5-20μM。

步骤(3)中，在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图，以荧光增强和荧光比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)作为探针响应信号，用于区分不同种类细菌。

一种对膜电荷响应的比率荧光探针的应用，该荧光探针用于识别细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

本发明的优点和有益效果为：

细菌表面带有大量的电荷，与探针纳米聚集体作用将其解聚引起荧光大幅度增强。由于细菌表面电荷分布不同，导致探针形成不同程度的单体和二聚体，从而产生芘单体和激基复合物荧光的比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)。以探针聚合物与细菌结合后产生的荧光增强，以及单体与激基复合物荧光比率变化作为荧光信号，能够识别革兰氏阴性菌或阳性菌，并且能够区分不同种类的细菌。

附图说明

图1实施例1制备的荧光探针核磁谱图氢谱；

图2实施例1制备的荧光探针核磁谱图碳谱；

图3为实施例2中描述的由实施例1制备的荧光探针(浓度为10μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中分别与不同表面活性剂和各种离子(400μM)作用的荧光光谱图和二维比率图。

图4为实施例3中描述的由实施例1制备的荧光探针(浓度为10μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中分别与表面活性剂BS-12、Triton X-100、DTAB或者SDS作用前后的动态光散射图谱，以及荧光探针与SDS作用前后的透射电镜图。

图5为实施例4中描述的由实施例1制备的荧光探针在HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与不同细菌(OD₆₀₀＝0.1)作用前后的荧光光谱图和二维比率图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

用于细菌检测的比率荧光探针的制备，基本合成方法如下：

在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入芘(4g,19.77mmol)和溴乙酰溴(3.33g,16.48mmol)溶解于40mL二氯甲烷，保持温度在0℃，缓慢的加入氯化铝粉末(2.64g,19.77mmol)于反应液中，搅拌2小时后得到深色溶液；将温度升到室温搅拌8小时后，加入20mL冰水淬灭多余的氯化铝，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱，在石油醚：二氯甲烷＝7:3的条件下分离得到2-溴代-1-芘基乙酮；

在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入四氢铝锂(0.295g,7.78mmol)和氯化铝(1.04g,7.78mmol)溶于9mL***，随后将溶于12.5mL二氯甲烷的2-溴代-1-芘基乙酮(1.00g,3.11mmol)缓慢加入反应液中，在室温下搅拌1小时后得到白色沉淀。用20mL冰水淬灭多余的氯化铝和四氢铝锂，用2.5摩尔的盐酸调节反应液至pH＝6，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱,在石油醚的条件下分离得到1-(2-溴乙基)-芘；

在氮气条件下，25mL的双口瓶中加入二联咪唑(96.25mg,0.65mmol)和1-(2-溴乙基)-芘(400mg,1.30mmol)混合于20mL乙腈溶于，升温至80℃回流，搅拌24小时后产生沉淀，沉淀用40mL***洗涤。随后将沉淀溶于20mL甲醇中，缓慢将5mL饱和六氟磷酸钾溶液滴入溶液中得到白色沉淀，过滤洗涤得到产物di-PYIM。

di-PYIM探针分子的氢谱和碳谱数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.04(s,2H),8.49–7.98(m,16H),7.96–7.47(m,6H),6.35(s,2H),4.72(t,J＝6.7Hz,4H),3.88(t,J＝6.8Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ137.80,131.29,131.15,130.79,130.54,129.05,128.35,128.09,127.82,127.72,126.91,125.90,125.68,125.44,124.68,124.43,123.97,123.36,122.23,99.99,51.03,33.21.

实施例2：

用于细菌检测的比率荧光探针的制备，基本合成方法如下：

在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入芘(4g,19.77mmol)和溴乙酰溴(4.5g,22.27mmol)溶解于40mL二氯甲烷，保持温度在0℃，缓慢的加入氯化铝粉末(4g,29.95mmol)于反应液中，搅拌2小时后得到深色溶液；将温度升到室温搅拌8小时后，加入20mL冰水淬灭多余的氯化铝，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱，在石油醚：二氯甲烷＝7:3的条件下分离得到2-溴代-1-芘基乙酮；

在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入四氢铝锂(0.38g,10mmol)和氯化铝(1.07g,8mmol)溶于9mL***，随后将溶于12.5mL二氯甲烷的2-溴代-1-芘基乙酮(1.6g,5mmol)缓慢加入反应液中，在室温下搅拌1小时后得到白色沉淀。用20mL冰水淬灭多余的氯化铝和四氢铝锂，用2.5摩尔的盐酸调节反应液至pH＝6，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱,在石油醚的条件下分离得到1-(2-溴乙基)-芘；

在氮气条件下，25mL的双口瓶中加入二联咪唑(74.04mg,0.5mmol)和1-(2-溴乙基)-芘(461.54mg,1.50mmol)混合于20mL乙腈溶于，升温至90℃回流，搅拌24小时后产生沉淀，沉淀用40mL***洗涤。随后将沉淀溶于20mL甲醇中，缓慢将5mL饱和六氟磷酸钾溶液滴入溶液中得到白色沉淀，过滤洗涤得到产物di-PYIM。di-PYIM探针分子的氢谱和碳谱数据和实施例1相似。

实施例3

用于细菌检测的比率荧光探针的制备，基本合成方法如下：

在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入芘(3g,14.83mmol)和溴乙酰溴(8.1g,40mmol)溶解于40mL二氯甲烷，保持温度在0℃，缓慢的加入氯化铝粉末(5.33g,40mmol)于反应液中，搅拌2小时后得到深色溶液；将温度升到室温搅拌8小时后，加入20mL冰水淬灭多余的氯化铝，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱，在石油醚：二氯甲烷＝7:3的条件下分离得到2-溴代-1-芘基乙酮；

在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入四氢铝锂(0.3g,7.91mmol)和氯化铝(2.14g,16mmol)溶于9mL***，随后将溶于12.5mL二氯甲烷的2-溴代-1-芘基乙酮(2.00g,6.22mmol)缓慢加入反应液中，在室温下搅拌1小时后得到白色沉淀。用20mL冰水淬灭多余的氯化铝和四氢铝锂，用2.5摩尔的盐酸调节反应液至pH＝6，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱,在石油醚的条件下分离得到1-(2-溴乙基)-芘；

在氮气条件下，25mL的双口瓶中加入二联咪唑(74.04mg,0.5mmol)和1-(2-溴乙基)-芘(153.85mg,0.5mmol)混合于20mL乙腈溶于，升温至80℃回流，搅拌24小时后产生沉淀，沉淀用40mL***洗涤。随后将沉淀溶于20mL甲醇中，缓慢将5mL饱和六氟磷酸钾溶液滴入溶液中得到白色沉淀，过滤洗涤得到产物di-PYIM。di-PYIM探针分子的氢谱和碳谱数据和实施例1相似。

实施例4

实施例1制备的荧光探针对不同表面活性剂及各种离子的响应情况

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，表面活性剂和各种离子在水溶液中配成20mM的溶液。在1mL，20mM，pH＝7.4的HEPES溶液中分别配置10μM探针，探针(10μM)和各种表面活性剂(SDS，DTAB，Triton X-100，BS-12，400μM)的混合溶液，探针(10μM)和各种阴离子(SO₄ ^2-，PPi，PO₄ ^3-，NO₃ ^-，HPO₄ ^2-，CO₃ ^2-，Br^-，CH₃COO^-，ATP，AMP，ADP，400μM)的混合溶液，探针(10μM)和各种阳离子(Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，400μM)的混合溶液。用345nm激发波长激发，测定荧光得到图3。

图3a中只有di-PYIM探针存在时(10μM)显示微弱的荧光，加入阴离子表面活性剂SDS后375nm发射峰的荧光不变，而482nm发射峰的荧光显著增强；加入两性离子表面活性剂BS-12后375nm和482nm发射峰的荧光均增强；加入非离子表面活性剂Triton X-100后375nm发射峰的荧光增强，而482nm发射峰的荧光略有增强；加入阳离子表面活性剂DTAB和各种离子的di-PYIM探针分子溶液在375nm和482nm发射峰的荧光均不变。

图3b的二维荧光比率图由图3a中荧光强度换算得到，横坐标为di-PYIM探针与目标物作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I₄₈₂/I₃₇₅，纵坐标为△S/S₀，其中S₀代表只有di-PYIM探针存在时的荧光积分面积，△S代表探针与目标分子作用前后的荧光积分面积的绝对差值。

实施例5

实施例1制备的荧光探针对不同表面活性剂的响应情况

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，表面活性剂和各种离子在水溶液中配成20mM的溶液。在1mL，20mM，pH＝7.4的HEPES溶液中分别配置5μM探针，探针(5μM)和各种表面活性剂(SDS，DTAB，Triton X-100，BS-12，50μM)的混合溶液，用345nm激发波长激发，测定荧光光谱,得到的光谱图类似于图3，可以区分表面活性剂。

实施例6

实施例1制备的荧光探针对不同表面活性剂的响应情况

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，表面活性剂和各种离子在水溶液中配成20mM的溶液。在1mL，20mM，pH＝7.4的HEPES溶液中分别配置20μM探针，探针(20μM)和各种表面活性剂(SDS，DTAB，Triton X-100，BS-12，5mM)的混合溶液，用345nm激发波长激发，测定荧光得到类似于图3的图谱，可以区分表面活性剂。

实施例7

实施例1制备的荧光探针的尺寸研究

在1mL，20mM，pH＝7.4的HEPES溶液中配置10μM探针、以及探针(10μM)分别和各种表面活性剂(SDS，DTAB，Triton X-100，BS-12，400μM)的混合溶液，用动态光散射仪测定其粒径大小得到图4a。

在1mL，20mM，pH＝7.4的HEPES溶液中分别配置10μM探针、探针(10μM)和SDS(400μM)的混合溶液，分别取5μM溶液滴在铜网薄层上，烘干，用透射电子显微镜检测得到图4b-c。

图4a中只有di-PYIM探针存在时(10μM)形成的粒子平均尺寸为380nm，加入阴离子表面活性剂SDS(400μM)后粒子尺寸显著减弱，平均尺寸为130nm；加入两性离子表面活性剂BS-12(400μM)、非离子表面活性剂Triton X-100(400μM)和阳离子表面活性剂DTAB(400μM)后粒子尺寸只微量减弱，平均尺寸均为320nm。

图4b中只有di-PYIM探针存在时(10μM)形成的粒子在透射电镜下的尺寸约为380nm，与图4a动态光散射图谱相符合。

图4c中在di-PYIM探针(10μM)中加入阴离子表面活性剂SDS(400μM)后粒子在透射电镜下的尺寸约为150nm，与图4a动态光散射图谱相符合。

实施例8

实施例1制备的荧光探针对不同细菌的检测

细菌培养：从长有细菌的表面皿挑去单斑于5mLLB培养基中，37℃培养至OD＝1.0，用12000rpm离心10分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.1。各种细菌(大肠杆菌BL21，大肠杆菌DH5α绿脓杆菌，农杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，粪肠球菌，弗氏柠檬酸杆菌，紫色色杆菌，蜡样芽胞杆菌，表皮葡萄球菌和丛毛单胞菌)的培养均按照以上操作。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到图5a。

图5a中只有di-PYIM探针存在时显示微弱的荧光，加入各种细菌后375nm发射峰的荧光变化微弱，而482nm发射峰的荧光均显著增强，但是增强的幅度不同。

图5b中di-PYIM探针与不同细菌作用后的二维荧光比率图由图5a中荧光强度换算得到，横坐标为di-PYIM探针与各种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I₄₈₂/I₃₇₅，纵坐标为△S/S₀，其中S₀代表只有di-PYIM探针存在时的荧光积分面积，△S代表探针与各种细菌作用前后的荧光积分面积的绝对差值。12种细菌分布于二维图中，几乎无交叉，并且从起始点沿对角线画一条虚线，虚线的上方为革兰氏阴性菌，虚线下方为革兰氏阳性菌。

实施例9

实施例1制备的荧光探针对不同细菌的检测

细菌培养：从长有细菌的表面皿挑去单斑于5mL LB培养基中，37℃培养至OD＝1.0，用12000rpm离心10分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.5。各种细菌(大肠杆菌BL21，大肠杆菌DH5α绿脓杆菌，农杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，粪肠球菌，弗氏柠檬酸杆菌，紫色色杆菌，蜡样芽胞杆菌，表皮葡萄球菌和丛毛单胞菌)的培养均按照以上操作。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到如图5b相似的细菌分布图，区分不同的细菌。

实施例10

实施例1制备的荧光探针对不同细菌的检测

细菌培养：从长有细菌的表面皿挑去单斑于5mL LB培养基中，37℃培养至OD＝1.0，用12000rpm离心10分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为2.0。各种细菌(大肠杆菌BL21，大肠杆菌DH5α绿脓杆菌，农杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，粪肠球菌，弗氏柠檬酸杆菌，紫色色杆菌，蜡样芽胞杆菌，表皮葡萄球菌和丛毛单胞菌)的培养均按照以上操作。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取10μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到如图5b相似的细菌分布图，区分不同的细菌。