具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

制备半质子型化合物咪唑-咪唑的硝酸盐，具体方法如下：

将1g白色的咪唑溶于10mL水中，然后加入过量的NH₄NO₃水溶液(NH₄NO₃与咪唑的摩尔比为2:1)。室温下搅拌反应12h，冷冻干燥后加入过量氯仿溶解产物，柱层析分离产品，得淡褐色的半质子型咪唑-咪唑硝酸，熔点174～176℃。

1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)：δ7.68(s,2H),6.39(s,1H),3.59(t,J＝7.4Hz,1H),1.13(t,J＝7.1Hz,2H)。HRMS：[C₆H₉N₄]NO₃，分子离子峰137.2。其结构如下所示：

实施例2

制备半质子型化合物噻吩-噻吩六氟磷酸，具体方法如下：

将1g噻吩溶于10mL乙醇溶液中，然后加入过量的NH₄PF₆醇溶液(其中NH₄PF₆与噻吩的摩尔比为1.5:1)，室温下混匀，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清液，干燥即可得到淡黄色产品，熔点为89～91℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.33-8.23(m,5H),8.03-7.94(m,5H),7.23(s,1H),7.10(s,1H),6.98(s,1H)。HRMS：[C₈H₉S₂]PF₆，分子离子峰169.3。其结构如下所示：

实施例3

制备半质子型化合物嘌呤-嘧啶六氟磷酸，具体方法如下：

将1g白色的嘌呤和白色的嘧啶(其中嘌呤与嘧啶的摩尔比为1:1)分别溶于10mL水中，室温下搅拌反应2h，然后加入摩尔比为3:1的NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与嘌呤的摩尔比为3:1)，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到淡黄色的半质子型嘌呤-嘧啶六氟磷酸，熔点为228～230℃。

1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ9.10(d,J＝1.9Hz,1H),8.92(s,1H),8.57(s,1H),4.74(s,8H),4.63(s,5H)。HRMS：[C₉H₉N₆]PF₆，分子离子峰201.2。其结构如下所示：

实施例4

制备半质子型化合物三乙胺-三乙胺的乙酸盐，具体方法如下：

将1mL三乙胺溶于10mL乙醇中，然后加入CH₃COONH₄溶液(其中CH₃COONH₄与三乙胺的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应12h，抽滤后加入过量氯仿溶解产物，柱层析分离产品，得白色的半质子型三乙胺-三乙胺醋酸，熔点41～43℃。

1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)：δ5.89(dd,J＝7.5,1.1Hz,1H),5.39(s,1H),5.25(s,1H),4.37(dd,J＝7.5,1.1Hz,1H)。HRMS：CH₃COO[C₄H₁₉N₂]，分子离子峰203.2。其结构如下所示：

实施例5

制备半质子型化合物联吡啶-联吡啶六氟硅酸，具体方法如下：

将1g白色的2,2'-联吡啶溶于10mL乙醇溶液中，然后加入摩尔比为2:1的NH₄SiF₆水溶液(其中(NH₄)₂SO₄与2,2'-联吡啶的摩尔比为2:1)，室温下混匀后，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到橙红色产品。熔点为156～159℃。

1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3)：δ8.68(d,J＝5.7Hz,1H),7.96(t,J＝7.0Hz,1H),5.90(s,18H)。HRMS：[C₂₀H₁₇N₄]₂SiF₆，分子离子峰313.4。其结构如下所示：

实施例6

制备半质子型化合物苦参碱-苦参碱六氟磷酸，具体方法如下：

将1g白色的苦参碱溶于10mL水中，然后加入NH₄PF₆水溶液，室温下搅拌反应2h(其中NH₄PF₆与苦参碱的摩尔比为1.5:1)，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到淡褐色产品，熔点为218～220℃。

1H NMR(400MHz,Chloroform-d)：δ7.18(s,5H),2.40–2.31(m,1H),2.27(s,1H),1.60(s,28H),1.29–1.20(m,7H),1.04(d,J＝17.4Hz,2H),0.92–0.81(m,3H),0.84(s,21H)。HRMS：[C₃₀H₄₉N₄O₂]PF₆，分子离子峰497.7。其结构如下所示：

实施例7

制备半质子型化合物喹啉-喹啉甲酸，具体方法如下：

将1g喹啉溶于10mL甲醇溶液中，然后加入过量的NH₄COOH水溶液(其中NH₄COOH与喹啉的摩尔比为1.6:1)，室温下搅拌反应2h，离心，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到白色产品，熔点为328～330℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.66(s,1H),8.62(d,J＝6.1Hz,1H),8.37(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H),8.27–8.16(m,2H),8.05(ddd,J＝8.3,6.9,1.3Hz,1H),7.91(ddd,J＝8.2,6.9,1.2Hz,1H),7.20(s,4H),7.08(s,4H)。HRMS：HCOO[C₁₈H₁₅N₂]，分子离子峰259.3。其结构如下所示：

实施例8

制备半质子型化合物哒嗪-哒嗪六氟磷酸，具体方法如下：

将1g哒嗪溶于10mL乙醇中，然后加入过量的NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与哒嗪的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到白色产品，熔点为260～262℃。

1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3)：δ9.17(t,J＝3.5Hz,1H),7.62(t,J＝3.5Hz,1H),5.96(s,6H)。HRMS：[C₈H₉N₄]PF₆，分子离子峰161.2。其结构如下所示：

实施例9

制备半质子型化合物嘌呤-嘌呤六氟磷酸，具体方法如下：

将1g嘌呤溶于10mL水中，然后加入NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与嘌呤的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到灰色产品，熔点为249～251℃。

1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)：δ9.09(d,J＝2.7Hz,1H),8.91(s,1H),8.56(s,1H)。HRMS：[C₁₀H₉N₈]PF₆，分子离子峰241.2。其结构如下所示：

实施例10

制备半质子型化合物组氨酸-组氨酸六氟磷酸，具体方法如下：

将1g组氨酸溶于10mL水中，然后加入NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与组氨酸的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到白色产品，熔点为259～261℃。

1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)：δ6.88(d,J＝1.4Hz,1H),5.67(s,1H),5.40(s,6H),5.35(s,1H),2.69(t,J＝6.7Hz,1H),1.78～1.61(m,2H),0.25(s,3H)。HRMS：[C₁₂H₁₉N₆O₄]PF₆，分子离子峰311.3。其结构如下所示：

实施例11

制备半质子型化合物色氨酸-色氨酸六氟磷酸，具体方法如下：

将1g色氨酸溶于10mL水中，然后加入NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与色氨酸的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到白色产品，熔点为238～240℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.88(s,1H),7.56(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.20(d,J＝2.4Hz,1H),7.07(ddd,J＝8.1,6.9,1.2Hz,1H),7.01(s,9H),6.99(ddd,J＝8.0,6.9,1.1Hz,1H),3.43(dd,J＝9.0,4.0Hz,1H),3.35–3.26(m,1H),2.95(dd,J＝15.1,9.0Hz,1H)。HRMS：[C₂₂H₂₅N₄O₄]PF₆，分子离子峰409.3。其结构如下所示：

实施例12

制备半质子型化合物吩嗪-吩嗪六氟磷酸，具体方法如下：

将1g白色的吩嗪溶于10mL乙醇中，然后加入过量NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与吩嗪的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到黄色产品，熔点为299～301℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.88(s,1H),7.56(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.20(d,J＝2.4Hz,1H),7.07(ddd,J＝8.1,6.9,1.2Hz,1H),7.01(s,9H),6.99(ddd,J＝8.0,6.9,1.1Hz,1H),3.43(dd,J＝9.0,4.0Hz,1H),3.35～3.26(m,1H),2.95(dd,J＝15.1,9.0Hz,1H)。HRMS：[C₂₄H₁₇N₄]PF₆，分子离子峰461.4。其结构如下所示：

实施例13

制备半质子型化合物腺苷蛋氨酸-腺苷蛋氨酸六氟磷酸，具体方法如下：

将1g腺苷蛋氨酸溶于10mL乙醇中，然后加入NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到白色产品，熔点为159～161℃。

1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)：δ7.69(s,1H),6.88(s,1H),3.10(d,J＝6.0Hz,1H),2.25(s,1H),2.04(dt,J＝18.2,9.6Hz,3H),1.79(dd,J＝19.8,10.4Hz,2H)。HRMS：[C₃₀H₄₃N₁₂O₁₀S₂]PF₆，分子离子峰797.5。其结构如下所示：

实施例14

制备半质子型化合物菲啰啉-菲啰啉六氟硅酸，具体方法如下：

将1g菲啰啉溶于10mL水醇溶液中，然后加入NH₄SiF₆水溶液(其中NH₄SiF₆与菲啰啉的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙腈溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到粉红色产品，熔点为171～173℃。

1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3):δ8.98(dd,J＝4.4,1.7Hz,5H),8.39(dd,J＝8.1,1.8Hz,5H),7.89(s,5H),7.68(dd,J＝8.1,4.4Hz,5H),7.07(s,1H)。HRMS：[C₂₄H₁₇N₄]₂SiF₆，分子离子峰361.4。其结构如下所示：

实施例15

制备半质子型化合物色氨酸-组氨酸六氟磷酸，具体方法如下：

将1g色氨酸溶和等摩尔的组氨酸于10mL水中，然后加入过量NH₄PF₆水溶液(其中NH₄PF₆与色氨酸的摩尔比为1.5:1)，室温下搅拌反应2h，冷冻干燥后加入适量乙酸溶解产物，过滤取上清，干燥即可得到米白色产品，熔点为228～230℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.89(s,1H),7.56(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.20(d,J＝2.3Hz,1H),7.07(ddd,J＝8.1,6.9,1.2Hz,1H),6.88(d,J＝1.4Hz,1H),5.67(s,1H),5.40(s,6H),5.35(s,1H),3.45(dd,J＝9.0,4.0Hz,1H),2.96(dd,J＝15.1,8.9Hz,1H)，2.69(t,J＝6.7Hz,1H)。HRMS：[C₁₇H₂₂N₅O₄]PF₆，分子离子峰360.3。其结构如下所示：

通过以上实施例可以发现，本发明的制备方法中，半质子型化合物的制备过程中的反应式如下：

其中含有R₁的化合物为杂烷基有机化合物或杂环有机化合物；含有R₂的化合物为杂烷基有机化合物或杂环有机化合物。

当含有R₁的化合物为三乙胺、咪唑、吡唑、三氮唑、噁唑、噻唑、菲啰啉、喹啉、吡啶、联吡啶、嘌呤、嘧啶、吡嗪、哒嗪、噻嗪、吩嗪、呋喃、吡喃、吡咯、吲哚、噻吩、异喹啉、胍、甜菜碱、苦参碱、组氨酸或色氨酸中的任意一种或者上述化合物的衍生物、含有R₂的化合物为三乙胺、咪唑、吡唑、三氮唑、噁唑、噻唑、菲啰啉、喹啉、吡啶、联吡啶、嘌呤、嘧啶、吡嗪、哒嗪、噻嗪、吩嗪、呋喃、吡喃、吡咯、吲哚、噻吩、异喹啉、胍、甜菜碱、苦参碱、组氨酸或色氨酸中的任意一种或者上述化合物的衍生物，溶解于水、甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种或几种溶剂中，在化学通式为(NH₄)_nR(磷酸根、聚磷酸根、硝酸根、六氟磷酸根、六氟硅酸根、四氟硼酸根、硫酸根、过硫酸根、硫代硫酸根、钼酸根、丙酮酸根、琥珀酸根、苹果酸根、酒石酸根、没食子酸、阿魏酸根、苯甲酸根、氨基磺酸根、木质素磺酸根、甲酸根、乙酸根、水杨酸根、卤素或草酸根中的任意一种)的铵盐(磷酸铵、聚磷酸铵、硝酸铵、六氟磷酸铵、六氟硅酸铵、四氟硼酸铵、硫酸铵、过硫酸铵、硫代硫酸铵、钼酸铵、丙酮酸铵、琥珀酸铵、苹果酸铵、酒石酸铵、没食子铵、阿魏酸铵、苯甲酸铵、氨基磺酸铵、木质素磺酸铵、甲酸铵、乙酸铵、水杨酸铵、卤素铵盐或草酸铵中的任意一种)的作用下，同样可以如同实施例1～15中能够制备得到相应的质子型化合物。

在半质子型化合物的制备过程中，当含有R₁的化合物和含有R₂的化合物为同一种化合物时，且化合物可分别为菲啰啉、吡唑、哌嗪、呋喃、噻唑等微溶或不溶于水的化合物时，反应时将它们溶于乙醇、甲醇、乙腈等有机溶剂中，然后加入过量的铵盐水溶液。若有沉淀析出，则混匀后至沉淀析出完毕，过滤去除所述沉淀上的溶剂，用水洗去铵盐，干燥，即可；当含有R₁的化合物和含有R₂的化合物为嘌呤、嘧啶、咪唑等可溶或易溶于水的化合物时，反应时将它们溶于水溶液中，然后加入过量的铵盐水溶液，充分搅拌反应。至薄层层析鉴定反应液中没有游离的原料时，除去水分，加入有机溶剂，柱层析分离产品，干燥，即可。

通式I中，当含有R₁的化合物和含有R₂的化合物为不同分子时，含有R₁的化合物和含有R₂的化合物可分别为嘌呤、嘧啶、吡啶、联吡啶、吡嗪、哌嗪、吩嗪、咪唑、噻唑、呋喃、苦参碱等杂环化合物的不同组合。

当含有R₁的化合物和含有R₂的化合物为菲啰啉、吡唑、哌嗪、三乙胺等微溶或不溶于水的化合物时，反应时将它们溶于相应的有机溶剂中，然后加入过量的铵盐水溶液，若有沉淀析出，则混匀后至沉淀析出完毕，过滤去除所述沉淀上的溶剂，用水洗去铵盐，柱层析分离产品，干燥，即可；若无沉淀析出，则除去水分后，加入有机溶剂，柱层析分离产品，干燥，即可；

当含有R₁的化合物和(或)含有R₂的化合物为嘌呤、嘧啶、咪唑、腺苷、组氨酸等可溶或易溶于水的化合物时，反应时将它们溶于水溶液中，然后加入过量的铵盐水溶液，充分搅拌反应。至薄层层析鉴定反应液中没有游离的原料时，除出水分，加入有机溶剂，柱层析分离产品，干燥，即可。

实施例6

实施例中制备的半质子型化合物的还原性能检测：

1、将24只试管分为四组，咪唑组、噻吩组、实施例1中制备的半质子型化合物咪唑-咪唑的硝酸盐组和实施例2中制备的半质子型化合物噻吩-噻吩六氟磷酸组，每组6只试管。在装有浓度为1μmol/mL GSSG溶液的试管中，分别加入1μmol/mL的咪唑、噻吩、半质子型化合物咪唑-咪唑的硝酸盐和半质子型化合物噻吩-噻吩六氟磷酸，然后根据试剂盒的说明，依次加入反应试剂，室温下孵育1小时后，在412nm处检测吸光度(使用分光光度计法检测溶液中氧化型谷胱甘肽(GSSG)和原型谷胱甘肽(GSH)的含量)，计算出GSSG和GSH的含量，结果如图1所示。从图1中可以看出，咪唑和噻吩在1μmol/mL浓度下没有把氧化型的GSSG还原为GSH的作用，但半质子型化合物咪唑-咪唑的硝酸盐和半质子型化合物噻吩-噻吩六氟磷酸可降低溶液中的GSSG含量，同时升高GSH的含量。说明实施例1和2中制备的质子型化合物具有较好的还原性能，其作为还原剂时能够还原氧化型谷胱甘肽(GSSG)。

2、将18只试管分为三组，嘌呤组、嘧啶组和实施例3中制备的半质子型化合物嘌呤-嘧啶六氟磷酸组，每组6只试管。在试管中分别加入不同浓度的嘌呤、嘧啶和嘌呤-嘧啶的六氟磷酸盐，然后各试管加入浓度为0.5g/L的H₂O₂溶液2mL，室温下孵育5分钟后，依次加入浓度为3mol/L的H₂SO₄溶液10rnL和浓度无0.01mol/L的KMnO₄溶液5mL，混匀，在530nm处检测吸光度(使用分光光度计法检测溶液中H₂O₂的含量)，根据标准曲线计算出H₂O₂的残存量。结果如图2所示。从图2可以看出，嘌呤和嘧啶并不具有水解H₂O₂的作用，然而半质子型化合物嘌呤-嘧啶六氟磷酸则能剂量依赖性地降低H₂O₂的含量。由此说明，实施例3制备的半质子型化合物嘌呤-嘧啶六氟磷酸具有还原性，能够作为还原剂还原H₂O₂。

上述实施例1、实施例2和实施例3中的半质子型化合物可作为还原剂，用于体内外的还原反应，主要是由于本发明制备的半质子型化合物中的R₁和R₂以氢键连接成为R₁ ⁺-R₂，可做为活性质子供体，与其它氧化型物质反应时具有良好的还原性。

而本发明其它实施例制备的半质子型化合物也具有同样的结构，因此也是可以做为活性质子供体，与其它氧化型物质反应时具有良好的还原性。

实施例7

实施例中制备的半质子型化合物抗微生物活性测试：

将实施例4和实施例5中制备的半质子型化合物三乙胺-三乙胺硝酸、联吡啶-联吡啶六氟硅酸加水稀释制成浓度为1mg/mL的溶液，按照96孔微量稀释法，分别加入到培养有革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和真菌(新型隐球菌、白色念珠菌、红色毛癣菌)的培养基中，在温度为37℃下培养12～72小时，将培养板置于振荡器上充分摇匀后，在波长600nm处测定吸光度，测得半质子型化合物三乙胺-三乙胺硝酸、联吡啶-联吡啶六氟硅酸对细菌和真菌的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC或MFC)，结果如下表1和表2所示。从表1和表2的测试结果可以看出，实施例4和实施例5中制备的半质子型化合物三乙胺-三乙胺硝酸、联吡啶-联吡啶六氟硅酸对细菌和真菌均有良好的抗菌作用，显示出广谱的抗菌效果。

表1半质子型化合物三乙胺-三乙胺硝酸抗微生物活性测试

表2半质子型化合物联吡啶-联吡啶六氟硅酸抗微生物活性测试

实施例8

实施例中制备的质子型化合物抑制人SH-SY5Y神经母细胞瘤和H22肝癌细胞生长作用测试：

将实施例5中制备的半质子型化合物苦参碱-苦参碱六氟磷酸，分别加入到培养有人SH-SY5Y神经母细胞瘤和H22肝癌细胞的96孔细胞培养板中，孵育12h后，使用CCK-8检测半质子型苦参碱-苦参碱六氟磷酸对上述肿瘤细胞的生长抑制作用。结果如图3所示。从图3可以看出，实施例5中制备的半质子型化合物苦参碱-苦参碱六氟磷酸可明显抑制肿瘤细胞的生长，且抑制作用呈量效关系。此外，该半质子型化合物苦参碱-苦参碱六氟磷酸对两种肿瘤细胞的抑制作用均明显强于相同浓度的苦参碱。

综上所述，本发明公开了一种质子型化合物的制备方法，通过将杂烷基有机化合物或杂环有机化合物在铵盐的作用下反应，在体外由下分子合成制备形成质子型化合物，制备方法简单，制备得到的半质子型化合物具有还原性、抗菌和抗肿瘤的生物学活性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。