阅读说明：本技术 四氢呋喃型木脂素化合物及其制备方法和应用 (Tetrahydrofuran type lignan compound and its preparation method and application ) 是由 宋少江 黄肖霄 李双双 徐志勇 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及四氢呋喃型木脂素类化合物及其制备方法和应用,具体涉及从药用植物白英全草中分离得到的5个具有相同平面结构的四氢呋喃型木脂素,包括两对对映异构体和一个内消旋体,及其在制备抗阿尔茨海默症(AD)药物方面的应用。所述的化合物结构如下：<Image he="816" wi="671" file="DDA0002207374560000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to pharmaceutical technology fields, it is related to tetrahydrofuran type Lignanoids compounds and its preparation method and application, more particularly to 5 isolated from the medicinal plant bittersweet herb tetrahydrofuran type lignanoids with same level structure, including two pairs of enantiomters and a mesomer, and its application in terms of preparing anti-Alzheimer disease (AD) drug.The compound structure is as follows:)

四氢呋喃型木脂素化合物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及四氢呋喃型木脂素类化合物及其制备方法和应用，具体涉及从药用植物白英全草中分离得到的5个具有相同平面结构的四氢呋喃型木脂素，包括两对对映异构体和一个内消旋体，及其在制备抗阿尔茨海默症(AD)药物方面的应用。

背景技术：

白英(Solanum lyratum Thunb.)为茄科茄属多年草质藤本，全草及根入药，其产于甘肃、陕西、山西、河南、山东诸省。日本、朝鲜、中南半岛也有分布。白英味苦、微寒、有小毒，其药用历史久远，最早见于《神农本草经》记载，列为上品，为传统中药。白英具有清热利湿、解毒消肿、抗癌等功能，主治感冒发热、黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、子宫糜烂、肾炎水肿等症，临床上用于治疗各种癌症，尤其对子***、肺癌、声带癌等有一定疗效。

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)：又叫老年性痴呆，是一种常见的中枢神经系统变性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。逐渐发生的记忆障碍(memory impairment)或遗忘是AD的重要特征或首发症状。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。本发明选用的AD实验模型为MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞模型。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP⁺)是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的活性代谢产物，能产生对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性破坏作用，从而发挥其诱导AD的毒性作用。

发明内容

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本发明涉及五种从茄科茄属植物白英(Solanum lyratum Thunb.)中分离得到的四氢呋喃型木脂素类化合物，结构如下：

本发明包括如下制备技术方案：

利用白英全草制备四氢呋喃型木脂素类化合物的方法，包括如下步骤：

(1)取干燥的白英全草以70-80％乙醇加热回流提取2-3次，合并提取液浓缩得浸膏；

(2)步骤(1)得到的浸膏依次用乙酸乙酯和正丁醇以1:1-1:1.5的体积比进行萃取，萃取3-4次；

(3)步骤(2)所得乙酸乙酯层和正丁醇层干浸膏分别经硅胶柱色谱，均以二氯甲烷-甲醇系统(50:1-1:1)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识两层馏分进行合并后共得到6个馏分A、B、C、D、E、F。

馏分A经ODS柱色谱，以乙醇-水系统20％-90％进行梯度洗脱，经薄层检识和自动分析HPLC分析合并后进一步得到了四个组分A₁、A₂、A₃、A₄。

所得组分A₃经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，共得到30份样品，后经薄层检识和HPLC分析进行合并得到7个组分3.1-3.7。

利用制备HPLC对组分3.7以60-62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6。

利用半制备HPLC对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2和3，并利用相同方法，对3.7.2进行分离得到了化合物1。

利用手性色谱柱对化合物1和2进行手性拆分分别得到了化合物1a/1b和2a/2b。其手性制备拆分方法为：利用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱，流动相为正己烷-异丙醇(1:1)，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为254nm。

本发明所述的提取、制备方法，适用于茄科茄属植物白英(SolanumlyratumThunb.)。

本发明中所述的手性拆分条件，适用于化合物1和2。

本发明所得化合物的结构鉴定结果如下：

利用紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维NMR技术对化合物1、2、3的平面结构及相对构型进行确定。通过比较实测ECD和计算ECD谱图，对拆分后的光学纯化合物1a/1b-2a/2b的绝对构型进行确定。

化合物1:黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 567.2566[M+Na]⁺(计算为C₃₀H₄₀O₉Na,567.2565)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉，计算不饱和度为11。¹H NMR和¹³C-NMR(400/100MHz,CDCl₃)谱中，δ6.99(1H,d,J＝1.3Hz,H-2),6.93(1H,d,J＝8.1Hz,H-5),6.97(1H,dd,J＝8.1,1.3Hz,H-6),6.90(1H,br.s,H-2′),6.89(1H,overlap,H-5′),6.88(1H,br.d,J＝8.4Hz,H-6′)提示为两个1,3,4-三取代苯环系统。δ4.64(1H,d,J＝8.5Hz,H-7),5.10(1H,d,J＝7.2Hz,H-7′)；δ83.1(C-7),81.3(C-7′)提示为两个连氧的次甲基质子。δ4.29(1H,dd,J＝11.3,5.4Hz,H-9a),4.22(1H,dd,J＝11.3,5.7Hz,H-9b),3.82(2H,m,H-9)；δ64.1(C-9),64.5(C-9′)提示为两个连氧的亚甲基。δ2.35(1H,dq,J＝8.5,5.4Hz,H-8),2.69(1H,m,H-8′)；δ50.5(C-8),45.7(C-8′)提示为两个次甲基信号。δ3.93(s,3-OCH₃),3.89(s,3′-OCH₃)；δ56.1(3,3′-OCH₃)提示为两个甲氧基信号。δ2.17(1H,d,J＝7.2Hz,H-2″),2.02(1H,d,J＝7.3Hz,H-2″′),2.06(1H,m,H-3″),1.96(1H,m,H-3″′),0.96(2H,dd,J＝6.6,1.8Hz,H-4″,5″),0.87(2H,dd,J＝6.5,1.1Hz,H-4″′,5″′)以及碳谱中δ173.1(C-1″),172.9(C-1″′),43.5(C-2″),43.3(C-2″′),25.8(C-3″),25.6(C-3″′),22.6(C-4″,4″′),22.5(C-5″,5″′)提示为两个异戊酯基片段。以上氢谱和碳谱数据显示结构中可能存在两个相似的片段。根据分子式提供的信息，推测结构中可能存在一个呋喃环。

通过HSQC谱对直接相连的碳氢信号进行了归属。在HMBC谱中，δ4.64(H-7)与δ132.3(C-1),109.4(C-2)及119.8(C-6)有相关，δ5.10(H-7′)与δ129.7(C-1′),108.9(C-2′)及119.4(C-6′)有相关说明两个苯环连在呋喃环的C-7和C-7′位。δ4.29(H-9b)与δ173.1(C-1″)存在相关，δ3.83(H-9′a)与δ172.9(C-1″′)存在相关，说明结构中的两个异戊酯基片段与C-9,C-9′位直接相连。δ2.35(H-8)与δ64.1(C-9),83.1(C-7),45.7(C-8′)存在相关，以及δ2.69(H-8′)与δ64.5(C-9′),81.3(C-7′),50.5(C-8)存在相关，说明异戊酯基通过C-9,C-9′位的亚甲基取代在呋喃环的C-8,C-8′位。δ3.93(3-OCH₃)与δ146.8(C-3)存在相关，δ3.89(3′-OCH₃)与δ146.6(C-3′)存在相关，说明了两个甲氧基的连接位置。根据以上信息，得到该化合物的平面结构。由此推测化合物1为四氢呋喃型木脂素类化合物。化合物1的相对构型是通过NOESY谱确定的。在NOESY谱中可观察到H-9与H-7/H-8′,H-8与H-6/H-7′/H-9′以及H-8′与H-7/H-9/H-6′的相关，证明了H-7与H-8,H-7′与H-8′,H-8与H-8′都为反式取向。

化合物2:黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 567.2566[M+Na]⁺(计算为C₃₀H₄₀NaO₉,567.2565)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉，不饱和度为11。¹H(400MHz,CDCl₃)与¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱中显示出2个甲氧基、4个甲基、4个次甲基、2个亚甲基、2个酯羰基碳以及12个芳香碳(其中6个为季碳)。对NMR谱图数据进行分析，发现化合物2的谱图与化合物1的类似，其主要的不同为C-9和C-9′处的化学位移值，化合物2中为δ61.9(C-9),60.7(C-9′)，而化合物1中为δ64.1(C-9),64.5(C-9′)。故推测化合物2与化合物1具有相同的平面结构。化合物2的相对构型也是通过NOESY谱确定的，在NOESY谱中可观察到H-9与H-7/H-9′,H-9′与H-2′/H-6′存在相关，证明了H-8,H-7′,H-8′为同一取向，而H-7为相反的取向。

化合物1和2的比旋光度接近于零且无明显的CD吸收，推测其为外消旋混合物。使用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱对化合物1和2进行进一步的分离，结果得到两对对映异构体1a/1b和2a/2b。它们的绝对构型是通过比较计算和实测ECD来确定的。1a的实验CD谱中的Cotton效应峰与预设为7S,8R,7′S,8′R构型的计算ECD谱中的Cotton效应峰能够较好的吻合。2a的实验CD谱中的Cotton效应峰与预设为7R,8R,7′R,8′S构型的计算ECD谱中的Cotton效应峰能够较好的吻合。由此可以确定化合物1a,1b,2a,2b的绝对构型分别为7S,8R,7′S,8′R、7R,8S,7′R,8′S、7R,8R,7′R,8′S和7S,8S,7′S,8′R构型。

化合物3：黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 567.2541[M+Na]⁺(计算为C₃₀H₄₀NaO₉,567.2565)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉，其与化合物1和2的分子式相同。其中最显著的差异是化合物3在氢谱和碳谱中出现了叠加共振的信号，说明化合物3具有磁性等同的对称面。对二维核磁数据的分析验证了所有氢和碳信号的分配。在NOESY谱中，可以观察到H-7与H-9,H-8与H-2和H-6的相关，由此确定了化合物的相对构型，为(rel)-(7β7′β,8α,8′α)-3,3′-二甲氧基-4,4′-二羟基-7,7′-环氧木脂素-9,9′-异戊酯基。化合物3为内消旋化合物，不具有旋光性和Cotton效应。

表1 1-3在CDCl₃中¹H(400MHz)与¹³C(100MHz)NMR数据

对发明所述五个新的四氢呋喃型木脂素类化合物对MPP⁺诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用进行了考察，体外细胞试验结果表明化合物1-3对MPP⁺诱导的人SH-SY5Y细胞氧化损伤具有显著的保护作用。因此本发明所述的新的四氢呋喃型木脂素类化合物，具有抗AD作用的医药新用途。

附图说明：

图1化合物1的UV谱；

图2化合物1的HRESIMS谱；

图3化合物1的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图4化合物1的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图5化合物1的¹H-¹H COSY谱(600MHz,CDCl₃)；

图6化合物1的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图7化合物1的手性拆分色谱图；

图8化合物2的UV谱；

图9化合物2的HRESIMS谱；

图10化合物2的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图11化合物2的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图12化合物1的¹H-¹H COSY谱(600MHz,CDCl₃)；

图13化合物2的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图14化合物2的手性拆分色谱图；

图15化合物3的UV谱；

图16化合物3的HRESIMS谱；

图17化合物3的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图18化合物3的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图19化合物3的¹H-¹H COSY谱(600MHz,CDCl₃)；

图20化合物3的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图21化合物1的HMBC相关图；

图22化合物1-3的NOESY相关图；

图23化合物1a/1b-2a/2b实测ECD与计算ECD比对图。

具体实施方式

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下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1-3的制备。

选用茄科植物白英(S.lyratum)的干燥全草40kg为原料，用70％工业乙醇加热回流提取3次，每次2小时。经减压浓缩后得乙醇粗提物2500g，浸膏分别采用乙酸乙酯及正丁醇以1:1的体积比进行萃取，萃取3-5次，得到乙酸乙酯层干浸膏293g，正丁醇干浸膏1114g，两层浸膏分别进行快速减压柱色谱分离，都以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，共收集到40～50个馏分，经硅胶薄层检识后，合并得到6个馏分A(32.5g)、B(44.8g)、C(43.2g)、D(186.4g)、E(49.0g)、F(207.2g)。馏分A经ODS色谱柱，以20％-90％乙醇-水进行梯度洗脱，并经薄层检识和HPLC分析(50-100％甲醇水)得到四个组分A₁(4.6g)、A₂(3.6g)、A₃(7.2g)、A₄(13.2g)。所得组分A₃(7.2g)经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统15:1-0:1进行梯度洗脱，共得到30个组分，后经薄层检识和HPLC分析(80％甲醇水)进行合并得到7个组分3.1-3.7。利用制备HPLC对组分3.7以62％的甲醇-水系统进行分离，得到了3.7.1-3.7.6。利用半制备HPLC对3.7.1以乙腈-水系统50％-55％进行洗脱，得到了化合物2(5.9mg,t_R40.8min)和3(12.3mg,t_R 43.4min)，利用相同方法，对3.7.2进行分离得到化合物1(11.3mg,t_R47.4min)。并利用手性色谱柱Daicel Chiralpak IC对化合物1进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.3ml/min)得到化合物1a(4.6mg,t_R 32.8min)和1b(4.3mg,t_R 45.1min)，用相同的条件对化合物2进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.3ml/min)得到化合物2a(2.4mg,t_R 22.9min)和2b(2.5mg,t_R 26.1min)。

实施例2：化合物1-3对体外MPP⁺诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用的考察。

利用常规的MTT法考察化合物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。将经胰蛋白酶消化后的SH-SY5Y细胞均匀的接种在96孔板中，置于培养箱中培养12h，样品组中加入不同浓度的化合物(12.5,25,50μM)预处理SH-SY5Y神经细胞1h，对照组与模型组中加入等体积的空白培养基预处理1h，在模型组与加药组中加入1mM的MPP⁺处理细胞36h。随后将培养液替换为含有0.5mg/mL MTT的磷酸盐缓冲溶液并在37℃下放置4h。吸去上清液，每孔加入150mL的DMSO于微量振荡器上振荡5min，用酶标仪在490nm波长处检测吸光度值，实验操作3次。细胞存活率(％)＝[A_490(sample)–A_490(control)]/[A_490(control)–A_490(blank)]×100％。MTT实验结果显示，化合物1-3在不同浓度下均表现出显著的保护作用，尤其在50μM浓度下作用最强，相较于阳性药的52.28±2.16％，并且对映异构体2a和2b在加药浓度为25μM浓度下表现出明显的立体选择性的神经保护活性差异(2a:82.66％；2b:69.03％)。

表2给药后细胞存活率