阅读说明：本技术 一种柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒及提取方法 (A kind of column method whole blood nucleic acid preservation extracts integrated kit and extracting method ) 是由 黄学文 赵琪 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒及提取方法,组分包括硅胶吸附柱、80％乙醇水溶液、洗脱液A、洗脱液B、核酸保存提取液、洗涤液,核酸保存提取液包括：柠檬酸缓冲液、盐酸胍、CTAB、LiCl、EDTA、Triton X-100和APG。采用本发明试剂盒进行的提取方法能够迅速变性各种蛋白包括核酸酶,使核酸酶处于彻底失活状态,从而达到长期保存核酸的目的；本发明试剂盒能够使核酸与蛋白质完全分离,保持变性蛋白质处于溶解状态,促进硅胶膜高效吸附核酸,经洗涤液洗涤和洗脱液洗脱后,得到高纯度和浓度的核酸。(The present invention relates to a kind of column method whole blood nucleic acid preservations to extract integrated kit and extracting method, component includes silica gel adsorption column, 80% ethanol water, eluent A, eluent B, nucleic acid preservation extracting solution, cleaning solution, and nucleic acid preservation extracting solution includes: citrate buffer solution, guanidine hydrochloride, CTAB, LiCl, EDTA, Triton X-100 and APG.It includes nuclease that various albumen can be denaturalized rapidly using the extracting method that kit of the present invention carries out, and so that nuclease is in thorough inactivated state, to achieve the purpose that long-term preservation nucleic acid；Kit of the present invention can be such that nucleic acid is kept completely separate with protein, and denatured protein is kept to be in dissolved state, and pellosil efficient absorption nucleic acid is promoted to obtain the nucleic acid of high-purity and concentration after washed liquid washing and elution.)

一种柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒及提取方法

技术领域

本发明涉及一种柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒及提取方法，属于生物提取技术领域。

背景技术

核酸(Nuecleic Acid)是生命的基本物质，根据化学组成可以分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。DNA是储存、复制和遗传信息的主要物质基础。RNA包括信使RNA(mRNA)、miRNA、LncRNA和CircRNA等，在蛋白质合成和基因调控过程中起着重要作用。在大多数涉及生命特别是医学研究中，核酸一直是重要的研究对象和研究热点，高纯度和完整性好的核酸是这些研究所必需的。但是核酸特别是RNA非常容易被核酸酶降解，降解后的核酸满足不了研究的需要。由于核酸酶(包括DNase和RNase)在组织、细胞、血液和环境中广泛存在，核酸酶特别是RNase非常稳定，当组织(细胞)离开生命体后，核酸酶迅速发挥作用，而且一般的处理很难灭活核酸酶，因此这些问题给核酸特别是RNA的保存、纯化、储存和运输带来了极大的挑战，也限制着许多技术的应用。

核酸保存和纯化的技术难点主要是在灭活内源性(组织或细胞内)和外源性(环境中)核酸酶的同时不影响核酸(DNA/RNA)的完整性。目前，核酸保存的方法主要有：1、组织(细胞)离开生命体后立即放入液氮；2、将组织(细胞)立即放入含有核酸酶抑制剂的保存管中，-20℃(或-80℃)冷冻。液氮保存核酸效果很好，但也存在这诸多不便，比如说液氮保存需要液氮罐，组织(细胞)离体后必须马上放入液氮罐。另外液氮保存的组织(细胞)在纯化核酸的过程中需要在液氮中研磨，还需要额外的纯化试剂，在这些过程中操作繁琐，动作要快，稍有不慎将会引起核酸保存或提取失败，导致不可挽回的结果。

许多其他的化学变性剂被报道或已经用于保存含核酸的生物样本，比如Trizol试剂，但是Trizol试剂只可以临时保存核酸，并且毒性较大。目前，核酸保存液主要有以Qiagen为代表的RNA later和以BD为代表的PAXgene全血RNA管。Qiagen的保存液保存组织效果非常好，但保存细胞特别是白细胞的效果不佳，保存样本中核酸的提取需要额外的专用纯化试剂，价格昂贵。BD保存液保存全血细胞中的核酸效果非常好，但是保存样本纯化前需要离心取沉淀，离心后的沉淀容易结块，非常难以打散，很容易造成提取失败，并且需要额外的专用提取试剂，价格更加昂贵。目前市场上还未见不需额外提取试剂的保存效果好、价格低廉的相关产品。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供了柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒及提取方法。

本发明采用如下技术方案：一种柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒，组分包括硅胶吸附柱、80％乙醇水溶液、洗脱液A、洗脱液B、核酸保存提取液、洗涤液，所述核酸保存提取液包括：柠檬酸缓冲液、盐酸胍、CTAB、LiCl、EDTA、Triton X-100和APG。

进一步的，所述核酸保存提取液包括50-200mmol/L的柠檬酸缓冲液，3-5M盐酸胍，质量百分数为1％-3％的CTAB，0.5mol/L-3M的LiCl，2-10mmol/L的EDTA、体积百分数为0.1％-5％的Triton X-100和体积百分数为5％-15％的APG。

进一步的，所述核酸保存提取液的pH为3.0-4.0。

进一步的，所述洗涤液包括10-100mM Tris-HCl，0.5-2M氯化锂，体积百分数为50％-70％乙醇。

进一步的，所述洗涤液的pH6.5-7.5。

进一步的，所述洗脱液A为含质量分数为0.01％-0.1％叠氮钠RNase-free的水溶液。

柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒的提取方法，对全血细胞核酸(包括DNA和RNA)进行保存并使用硅胶吸附柱进行提取，具体步骤如下：

(1)向全血中加入核酸保存提取液，核酸保存提取液与全血样本的使用量比例按体积份数比为：1-4：1，室温振荡混匀，得到混合物；混合物可以立即提取核酸或适当保存；保存条件为室温或-4℃至-80℃；

(2)将完全融解的混合液加入硅胶吸附柱，离心使混合物完全通过硅胶吸附柱，核酸被吸附柱中的硅胶膜吸附；

(3)离心完成后，首先使用0.5-0.7mL的洗涤液I洗涤硅胶吸附柱1次，然后再使用0.5-0.7mL80％乙醇水溶液洗涤硅胶吸附柱2次，每次洗涤后均需离心，对洗涤完成后的吸附柱进行烘干，得到去除杂质的含有核酸的硅胶吸附柱；

(4)若使用洗脱液A对硅胶吸附柱进行洗脱，离心后收集洗脱液，离心收集洗脱液的速度为10,000-20,000×g，离心时长为0.5-2min，得到RNA。

(5)若使用洗脱液B对硅胶吸附柱进行洗脱，离心后收集洗脱液，离心收集洗脱液的速度为10,000-20,000×g，离心时长为0.5-2min，得到包括DNA和RNA的总核酸。

进一步的，所述步骤(1)中振荡混匀的时间为30-60min，振荡速度为1500-3000rpm。

进一步的，所述步骤(2)中离心速度为10,000-20,000×g，离心时长为30-60s。

进一步的，所述步骤(3)中80％乙醇水溶液洗涤的离心速度为6,000-10,000×g，离心时长为15-60s。

核酸保存提取液中各组分的作用：

盐酸胍是强变性剂，能使核酸-蛋白结构发生变化，迅速溶解细胞膜和核膜，有效解离核蛋白与核酸的复合体，促进核酸与蛋白质迅速彻底分离；同时盐酸胍可以提供高盐环境，使核酸表现出比其正确折叠或天然构象时更高的热动力学稳定性，促使核酸的磷酸基团与硅胶吸附柱中的硅烷醇基团之间更容易形成氢键，利于核酸被硅胶膜吸附。CTAB是阳离子表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而释放出核酸。CTAB具有在低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的作用，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍然保留在溶液中。TritonX-100可以溶解脂质，防止脂质对核酸吸附的干扰，同时具有促进氢键形成的作用。氯化锂具有明显的沉淀RNA作用。因此在盐酸胍、CTAB和TritonX-100的共同作用下，核酸与核蛋白迅速彻底分离。分离出的核酸在CTAB和氯化锂的作用下沉淀至硅胶膜上，在盐酸胍、TritonX-100及柠檬酸缓冲液的共同作用下，沉淀在硅胶表面的核酸迅速与硅胶膜形成氢键，使硅胶膜牢固地吸附核酸，而蛋白和多聚糖则不被吸附。

本发明中，核酸酶(包括DNase和RNase)灭活是全血核酸保存和提取的关键，而pH值是DNase和RNase失活的关键，在pH5.0-6.0时DNase稳定，而RNase在pH2-4.5时稳定。柠檬酸盐缓冲液能够稳定提供pH3.0-6.6的缓冲环境，在pH3.0-4.0的环境下，DNase和RNase基本失活。盐酸胍是有效的核酸酶抑制剂，而EDTA可以螯合DNase的活化剂--Mg²⁺和辅助因子--Ca²⁺，因此在pH值、盐酸胍和EDTA共同下，内源性和外源性核酸酶(包括DNase和RNase)被迅速彻底灭活，保证核酸在保存和提取过程中不被降解。另外酸性柠檬酸缓冲液还可以使核酸磷酸基团和硅胶膜处于带电性状态，利于氢键的形成。

由于本发明所使用的盐酸胍和氯化锂的浓度较高，而CTAB的溶解度较低，在低温时CTAB容易析出，因而造成溶液体系不稳定。十二烷基葡萄糖苷(APG)是一种性质非常稳定的无毒无害的表面活性剂，APG具有明显的促进CTAB和盐酸胍溶解的作用，提高溶液的稳定性，并且具有保持核酸柔韧性的作用。另外，APG能增加溶液的粘稠度，延长核酸保存提取液的过柱时间，保证核酸有充足时间与硅胶膜形成氢键，提高核酸的吸附率。

Tris-HCl能够稳定提供pH6.5-9.0的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与硅胶膜的带电状态，利于氢键的保持；氯化锂提供高盐环境，保持已形成的氢键；乙醇能够保持核酸在硅胶膜表面的沉淀状态，使其与硅胶形成的氢键更牢固。因此，本发明所使用洗涤液I通过维持核酸与硅胶之间的氢键使核酸稳定地固定在硅胶膜上，在洗涤去除非特异性结合蛋白的同时，保证已吸附的核酸不被洗脱。

碱性条件下，核酸(包括DNA和RNA)与硅胶膜之间的氢键被破坏，硅胶膜释放核酸；在微酸性或中性条件下，DNA与硅胶膜之间的氢键保持完好，而RNA与硅胶膜之间的氢键消失，因此微酸性或中性洗脱液可以选择性洗脱RNA。本发明的洗脱液A能够提供中性洗脱环境，可以选择性洗脱RNA，同时叠氮钠具有一定的RNA保护作用。

本发明具有如下优点：(1)本发明的核酸保存提取液中包含柠檬酸盐缓冲液、盐酸胍和EDTA，能快速彻底灭活核酸酶(包括DNase和RNase)，能够长期有效保存核酸特别是RNA，有效地解决了DNA/RNA提取、保存和运输中的降解问题。

(2)核酸保存提取液中的CTAB和Triton-X100，能使核酸-蛋白结构发生变化，迅速溶解细胞和核膜，有效解离核蛋白与核酸的复合体，促进核酸与蛋白质迅速彻底分离，并且使蛋白质保持溶解状态。在盐酸胍、CTAB、氯化锂、TritonX-100和柠檬酸缓冲液的共同作用下，硅胶膜高效吸附释放出的核酸，而蛋白和多聚糖则不被吸附。由于本发明采用了用于除去硅胶膜上非特异性结合蛋白的洗涤液和用于除去硅胶膜上残留离子(如胍和氯化钠等)的乙醇水溶液，确保了提取核酸的纯度和浓度。

(3)本发明在保存核酸的同时，无需额外的核酸提取试剂，真正做到了保存提取一体化，操作简单快速，成本低廉。

(4)本发明的柱式法全血核酸保存提取一体化试剂盒保存核酸特别是RNA的效果好，保存时间长，提取核酸的效率高、质量好。

附图说明

图1本发明提取全血RNA效果与Trizol方法的比较；Lane1-4:本发明的提取结果；Lane5-8:Trizol方法的提取结果。

图2本发明提取全血核酸(包括DNA和RNA)的效果。

图3本发明37℃保存全血RNA的效果观察。从左至右保存时间分别为1h，3h，5h，7h，9h和10h。

图4本发明室温保存全血RNA的效果观察。从左至右室温保存时间分别为：1天，3天，5天，7天和10天。

图5本发明-4℃保存全血RNA的效果观察。从左至右全-4℃保存时间分别为：1周，2周，3周和4周。

图6本发明-20℃保存全血RNA的效果观察。从左至右-20℃保存时间分别为：3个月，6个月，12个月和18个月。

图7本发明提取的全血DNA扩增后的电泳图。Lane1：Marker；Lane2-3:102bpβ-globin；Lane4-5：268bpβ-globin；Lane6-7：402bp p53。

图8本发明提取的全血RNA中microRNA-21qPCR结果。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例中涉及的实验材料：

1)引物和探针

为了验证本发明提取的总核酸在下游DNA实验中的应用，发明人设计了102bp的β-Globin基因、268bp的β-Globin基因和402bp的p53基因引物，用普通PCR扩增目的片段，凝胶电泳观察这些片段的扩增效果，上述引物的基因序列如下所示：

102bpβ-Globin上游引物：5'-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3'(SEQID NO:1)；

102bpβ-Globin下游引物：5'-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3'(SEQID NO:2)；

268bpβ-Globin上游引物：5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'(SEQID NO:3)；

268bpβ-Globin下游引物：5'-GGTGAACGTGGATGAAGTTG-3'(SEQID NO:4)；

p53上游引物：5'-TTCCTACAGTACTCCCCTGC-3'(SEQID NO:5)；

p53下游引物：5'-GCCGCCTGAGGTCTGGTTTGCAACT-3'(SEQID NO:6)。

为了验证本发明提取的RNA在下游实验中的应用，发明人设计了microRNA-21的引物探针，以本发明方法和Qiagen方法提取的RNA为模板逆转录合成microRNA-21，用Taqman-MGB专用荧光定量PCR测定microRNA-21。

miRNA-21茎环引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3'(SEQID NO:7)

microRNA-21上游引物：5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'(SEQID NO:8)

microRNA-21下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(SEQID NO:9)

microRNA-21探针序列：5'-CTGGATACGACTCAACA-3'(SEQID NO:10)，其5'端带有6-FAM基团，3'端带有基团MGB基团。

2)试剂

其中2×PCR Buffer、逆转录试剂盒和Taqman-MGB专用荧光定量反应预混液购自江苏昱安生物技术有限公司，成分具体参见产品说明书。dNTP、琼脂糖购自上海生工，Takara Taq^TM HS酶购自大连宝生物，硅胶吸附柱购自杭州莱枫公司，引物和探针由上海英骏合成。Trizol试剂购自Qiagen公司。

实施例1：试剂盒中各溶液的配制

(1)核酸保存提取液的配制：采用常规配制方法分别配制50-200mM柠檬酸-柠檬酸钠盐缓冲液，调节pH值至3.7，用此缓冲液溶解终浓度相当于3-5M的盐酸胍，0.5-3M的LiCL，2-10mM的EDTA，质量百分比在1％-3％的CTAB，体积百分比为0.1％-5％的Triton-X100，体积百分比为5％-15％的APG，溶解完成后，再调节pH至3.0-4.0后即得核酸保存提取液。

(2)洗涤液的配制：采用常规配制方法配制10-100mM Tris-HCl，以10-100mMTris-HCl为溶剂溶解相当于0.5-2M的氯化锂，体积百分比为50-70％的乙醇，调节pH至6.0-7.5后即得洗涤液I。

(3)洗脱液A的配制：以RNase-free水为溶剂解相当于0.01％-0.1％质量百分比的叠氮钠，即得洗脱液A。

(4)洗脱液B的配制：采用常规配制方法配制10-100mM Tris-HCl，调节pH至7.5-8.5后即得洗脱液B。

(5)80％乙醇水溶液的配制：8份体积的无水乙醇中加入2份体积的RNase-free水混匀。

试剂盒的配制一：

(1)核酸保存提取液的配制：50mmol/L柠檬酸酸盐缓冲液，5M盐酸胍，1％CTAB，3MLiCL，2mM EDTA，5％Triton-X100，5％APG，pH3；

(2)洗涤液的配制：10mM Tris-HCl，0.5M氯化锂，70％乙醇，pH6；

(3)洗脱液A的配制：0.01％叠氮钠RNase-free水溶液；

(4)洗脱液B的配制：10mM Tris-HCl，调节pH至7.5；

(5)80％乙醇水溶液的配制：8份体积的无水乙醇中加入2份体积的RNase-free水混匀。

试剂盒的配制二：

(1)核酸保存提取液的配制：150mmol/L柠檬酸酸盐缓冲液，4M盐酸胍，1％CTAB，1MLiCL，5mM EDTA，1％Triton-X100，10％APG，pH3.7；

(2)洗涤液的配制：50mM Tris-HCl，1M氯化锂，60％乙醇，pH6.5；

(3)洗脱液A的配制：0.01％叠氮钠RNase-free水溶液；

(4)洗脱液B的配制：50mM Tris-HCl，调节pH至8；

(5)80％乙醇水溶液的配制：8份体积的无水乙醇中加入2份体积的RNase-free水混匀。

试剂盒的配制三：

(1)核酸保存提取液的配制：200mmol/L柠檬酸酸盐缓冲液，3M盐酸胍，3％CTAB，0.5M LiCL，10mM EDTA，0.1％Triton-X100，15％APG，pH4；

(2)洗涤液的配制：100mM Tris-HCl，2M氯化锂，50％乙醇，pH7.5；

(3)洗脱液A的配制：0.1％叠氮钠RNase-free水溶液；

(4)洗脱液B的配制：100mM Tris-HCl，调节pH至8.5；

(5)80％乙醇水溶液的配制：8份体积的无水乙醇中加入2份体积的RNase-free水混匀。

以下实施例中均采用试剂盒的配制法二进行配制。

实施例2：全血样本中RNA的提取

(1)全血样本的制备：用2.5mL BD EDTA-K₂抗凝真空管抽取1份全血，轻轻充分混匀后，平均分成4份；

(2)裂解：从每份全血样本中取0.2mL加入1.5mL离心管中，加入0.6mL核酸保存提取液，室温1500-3000rpm振荡30-60min；

(3)核酸吸附：转移400-800μL振荡混匀后的混合物至硅胶吸附柱，15000-25000×g离心30-60s；

(4)洗涤：离心完成后，向硅胶吸附柱中加入600μL洗涤液I，20,000×g，离心30秒，再用0.6mL80％乙醇水溶液洗涤硅胶吸附柱2次，每次6,000-10,000×g，离心时长为15-60s；

(5)甩干硅胶柱：将洗涤完成的硅胶吸附柱20,000×g，离心3min；

(6)RNA洗脱：向硅胶吸附柱中加入50-100μL洗脱液A，室温(15℃-25℃)放置3min，15,000×g离心1min，收集洗脱液，即可得到RNA；

(7)RNA检测：洗脱液A洗脱后，使用微量核酸测定仪测定RNA的浓度和纯度，使用Agilent 2100测定RNA的完整指数RIN，RIN≥7表示完整，RIN越高说明RNA越完整；用1％琼脂糖电泳RNA，凝胶成像观察结果；

(8)结果分析见表1和图1。

表1：本发明提取全血RNA的浓度、纯度及完整性与Trizol方法的比较

由表1结合图1可知，本发明提取的RNA浓度较高，完整性较好，与Trizol方法提取的RNA无明显差别。

实施例3：全血样本中总核酸的提取方法

用2.5mL BD EDTA-K₂抗凝真空管抽取2份全血，轻轻充分混匀。步骤(2)-(5)与实施例2中的完全相同。

(6)总核酸洗脱：向硅胶吸附柱中加入50-100μL洗脱液B，室温(15℃-25℃)放置2-5min，10,000-20,000×g离心30-90s，收集洗脱液，即可得到总核酸包括DNA和RNA。

(7)核酸检测：洗脱液B洗脱后，使用微量核酸测定仪测定总核酸的浓度和纯度，用1％琼脂糖电泳核酸，凝胶成像观察结果。

(8)结果分析见表2和图2。

表2：本发明提取全血核酸(包括DNA和RNA)的浓度及纯度

由表2和图2可知，采用本发明提取的全血核酸纯度和浓度较高。

实施例4：QiagenTrizol柱式法的比较

以实施例2中制备的4例全血为样本，从每份全血样本中取0.2mL加入1.5mL离心管中，用Qiagen Trizol柱式法试剂盒提取全血RNA，提取方法参照Qiagen Trizol柱式法说明书，具体方法如下：

(1)在1.5mL离心管中，加入200μL全血和1mL核酸提取缓冲液，漩涡振荡混匀；

(2)室温(15-25℃)放置5min；

(3)加入0.2mL的氯仿，剧烈震荡15s，室温(15-25℃)放置3min；

(4)12,000×g 4℃离心15min；

(5)转移上清液至新的1.5mL离心管中，加入1.5倍上清体积的无水乙醇，吹打混匀；

(6)将混合液分批全部转移至吸附柱中，离心过柱；

(7)加入洗液洗涤吸附柱2次；

(8)离心甩干吸附柱，加入50μL洗脱液至吸附柱中心，室温静置3min。15,000×g室温离心1min，收集洗脱液；

(9)RNA检测：洗脱液洗脱后，使用微量核酸测定仪测定RNA的浓度和纯度，使用Agilent 2100测定RNA的完整指数RIN，RIN≥7表示完整，RIN越高说明RNA越完整，用1％琼脂糖电泳RNA，凝胶成像观察结果。

(10)结果分析见表1和图1。

由表1和图1可知，本发明提取的4份全血的RNA浓度平均为35.55ng/μL，平均RIN为8.85；而Qiagen Trizol法的平均浓度为36.75ng/μL，平均RIN同样为8.83。本发明提取的RNA全部RIN结果均大于7.0说明，本发明方法提取的RNA完整性完全符合下游实验要求。本发明提取的RNA浓度略低于Trizol法，但是两者RIN一致。虽然Trizol法是目前公认的RNA提取的金标准，但是由于Trizol法操作繁琐，并且试剂毒性较大，因此本发明完全可以替代Trizol法。

实施例5：本发明方法保存提取全血核酸的效果观察

(1)样本制备：用4mL BD EDTA-K₂抗凝真空管抽取同一名志愿者的2份全血，轻轻充分混匀后，备用；

(2)裂解步骤同实施例2；

(3)将裂解后的样本分别放置在37℃、室温(15℃-25℃)、4℃和-20℃，于放置的不同时间，取出样本进行RNA提取。

其中，37℃放置的样本于放置的1小时、3小时、5小时、7小时、9小时和10小时，提取RNA。

室温(15℃-25℃)放置的样本于放置的1天、3天、5天、7天、9天和10天，提取RNA。

4℃放置的样本于放置的1周、2周、3周、4周和1周，提取RNA。

-20℃保存的样本于保存的3个月、6个月、12个月和18个月，提取RNA。

(4)取出的混合物于室温1500-3000rpm振荡30-60min；

(5)其余步骤，如：核酸吸附、洗涤、甩干硅胶柱、RNA洗脱和RNA检测均与实施例2完全一致。

(6)结果见表3-表6以及图3-图6。

表3本发明37℃保存全血RNA的效果观察

表4本发明室温(15℃-25℃)保存全血RNA的效果观察

表5本发明-4℃保存全血RNA的效果观察

表6：本发明-20℃保存全血核酸的效果观察

实施例6：提取的总核酸在下游中的应用

为了验证本发明提取的总核酸在下游DNA实验中的应用，以本发明方法实施例3提取的总核酸为模板，扩增长度为102bp、268bp的β-globin基因和长度为402bp的p53基因片段，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。

PCR反应体系如下：

其中，该PCR体系在Veriti梯度PCR仪(ABI公司)中进行反应。

扩增条件为：94℃预变性60秒；94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃5分钟。

由图7所示的电泳结果可知，以本发明方法提取的总核酸为模板的扩增结果在102bp、268bp和402bp处均出现明显条带。结果表明，本发明提取的总核酸可以很好的应用于下游实验。

实施例7：提取的RNA在下游中的应用

以本发明方法和Qiagen方法提取的RNA为模板逆转录合成microRNA-21cDNA，以此模板进行qPCR扩增。

逆转录体系如下：

逆转录反应条件如下：16℃30min，42℃30min，85℃5min。

qPCR体系如下：

其中，上述PCR反应在荧光定量PCR仪ViiA 7Dx(ABI公司)中进行反应，反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火40s，共40个循环。

由图8所示的结果可知，以本发明方法和Qiagen Trizol法提取的RNA为模板的microRNA的qPCR结果并无明显差异。结果说明，本发明提取的RNA可以很好的应用于下游RNA实验。

综上所述，1、本发明保存的核酸在37℃存放时，核酸(包括DNA和RNA)可以保存10小时以上；在室温(15-25℃)保存时，核酸(包括DNA和RNA)可以保存10天；在-4℃保存时，核酸(包括DNA和RNA)可以保存30天；在-20℃或-80℃保存时，核酸(包括DNA和RNA)可以长期保存。由此，本发明有效地解决了DNA/RNA提取、保存和运输中的降解问题。2、本发明在总核酸提取和RNA提取方面均能满足下游研究的需要。特别是在RNA提取方面，本发明无论是提取效率还是提取的完整性均可以与Trizol法相媲美，虽然Trizol法是目前公认的RNA提取的金标准，但是由于Trizol法操作繁琐，并且试剂毒性较大，因此本发明能够用于替代Trizol方法。3、本发明不含毒害物质，对环境和工作人员无危害，是唯一能同时保存和提取核酸的方法。