阅读说明：本技术 一种特异性识别蛋白drc1的多克隆抗体的制备方法及其应用 (A kind of preparation method and applications of the polyclonal antibody of specific recognition protein D RC1 ) 是由 刘明兮 刘思钰 吴佳艳 于 2019-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域,具体公开了一种特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法,包括如下步骤：(1)蛋白DRC1抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白DRC1的重组表达,所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；(2)将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体构建含有如SEQ ID NO.1所示核昔酸序列的重组表达载体,将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白DRC1抗原；(3)将所述重组蛋白DRC1抗原免疫动物,经血清获得特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体。本发明在重组蛋白制备的中采用大肠杆菌表达系统,能很好的保证重组蛋白的表达,表达产量高,有利于大批量的制备特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体。(The present invention relates to bioscience and detection reagent technical field, specifically disclose a kind of preparation method of the polyclonal antibody of specific recognition protein D RC1, include the following steps: (1) protein D RC1 Characterization of antigenic epitopes: selecting target fragment to be used as the recombinant expression of protein D RC1 by Characterization of antigenic epitopes, the gene order of the target fragment is as shown in SEQ ID N0.1 in sequence table；(2) recombinant expression carrier conversion competent escherichia coli cell is obtained recombinant protein DRC1 antigen by the recombinant expression carrier that the DNA of selected target fragment is contained the core former times acid sequence as shown in SEQ ID NO.1 by being inserted into expression vector establishment after PCR amplification；(3) by the recombinant protein DRC1 antigen-immunized animal, the polyclonal antibody of specific recognition protein D RC1 is obtained through serum.The present invention prepares middle using escherichia expression system in recombinant protein, can guarantee the expression of recombinant protein well, expression yield is high, is conducive to the polyclonal antibody of large batch of preparation specific recognition protein D RC1.)

一种特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域。

背景技术

DRC1蛋白(动力蛋白调节复合蛋白1，Dynein regulatory complex protein 1)由DRC1基因表达。DRC1参与编码连接蛋白动力蛋白调节复合物(nexin-dynein regulatorycomplex，N-DRC)的中心成分，调节纤毛动力蛋白的组装。DRC1与DRC2共同组装形成N-DRC中心支架及其与外部双管微管的连接。该基因的突变可引起纤毛的运动障碍。研究示纤毛的异常运动与多种呼吸道疾病密切相关，例如鼻窦炎，COPD，囊肿性纤维化(cysticfibrosis)，原发性纤毛运动障碍(PCD，Primary ciliary dyskinesia)等(参考文献：Jing,J.C.and J.J.Chen,et al.(2017)."Visualization and Detection of Ciliary BeatingPattern and Frequency in the Upper Airway using Phase Resolved DopplerOptical Coherence Tomography."Sci Rep 7(1):8522.)。

纤毛相关的疾病在临床上多发展为慢性呼吸道感染。研究显示DRC1的突变与PCD的发病密切相关(参考文献：1、Morimoto,K.and M.Hijikata,et al.(2019)."Recurringlarge deletion in DRC1(CCDC164)identified as causing primary ciliarydyskinesia in two Asian patients."Mol Genet Genomic Med:e838.2、Raidt,J.andJ.Wallmeier,et al.(2014)."Ciliary beat pattern and frequency in geneticvariants of primary ciliary dyskinesia."Eur Respir J 44(6):1579-88.)。

目前对DRC1的研究已经不限于呼吸道疾病，因纤毛在人体的遍布广泛，国内外研究人员在DRC1的表达程度与多种疾病间探究联系，发现DRC1的异常表达在呼吸系统之外，与免疫系统、神经系统、生殖系统等方面均与疾病有统计学关联。

然而现有技术中关于蛋白DRC1多克隆抗体制备方法的相关研究还是处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法，以实现特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备。

为了达到上述目的，本发明的基础方案提供一种特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)蛋白DRC1抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白DRC1的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；

(2)将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后***到表达载体构建含有如SEQ IDNO.1所示核昔酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白DRC1抗原；

(3)将所述重组蛋白DRC1抗原免疫动物，经血清获得特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体。

进一步，步骤(2)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

进一步，步骤(2)中的表达载体为PET28a。

进一步，大肠杆菌感受态为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

进一步，步骤(3)中重组蛋白DRC1抗原免疫的动物为新西兰大白兔、ICR小鼠。

本发明的基础方案提供一种特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法在试验样品中蛋白DRC1的定量检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法，通过抗原表位分析，把可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重组蛋白片段，用此片段免疫动物得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备的中采用大肠杆菌表达系统，能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体。

(2)本发明制备的特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体可应用于定量检测试验样品中蛋白DRC1的残留水平，同时也便于蛋白DRC1纯化介质制造商监测特定条件下蛋白DRC1的脱落特征。

(3)本发明的特异性识别DRC1蛋白的多克隆抗体是免疫新西兰大白兔和ICR小鼠得到的，这两种都是符合实验室规范的常用实验动物，易于获得，品系稳定，取其血液，获得血清(血清无须纯化)即获得抗体，步骤简单，符合现代动物伦理制度。ICR小鼠适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，抗体特异性高，实验重复性较好。

附图说明

图1为本发明实施例1中蛋白DRC1的梯度胶考马斯亮兰染色结果示意图；

图2为实施例1中的DRC1亲水性，免疫原性及表位暴露性示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

实施例1：特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法，

一、抗原表位分析

采用DNAstar软件进行抗原表位分析和疏水性分析，在SignalP4.1线上网站进行信号肽预测，选定目标序列并设计引物序列，所选片段的核酸序列详见SEQ ID No.1，其对应的氨基酸序列，详见SEQ ID No.4。

二、表达载体的构建

1、蛋白A目的片段获取

在在南京金斯瑞生物科技有限公司通过全基因合成的方法，合成用于原核表达载体构建的DNA序列，即合成SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2、PCR扩增

以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为模板，按表1体系将溶液依次从多至少加入PCR管中(模板cDNA最后加入)进行PCR扩增。

扩增的引物序列：

前引序列详见SEQ ID No.2，后引序列详见SEQ ID No.3。

以B6小鼠(B6是小鼠品系)睾丸组织提取mRNA，mRNA通过反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增序列的引物即为步骤“蛋白A目的片段获取”中提及的引物，PCR结束后用试剂盒纯化产物，试剂盒购自vazyme biotech。

反应体系:

2X Phanta Max Buffer	25ul
		dNTP(10mM)	1ul
模板DNA	5ul
		Primer-F	2ul
Primer-R	2ul
		Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	1ul
ddH2O	to50ul

反应程序：

循环步骤	温度(℃)	时间	循环数
				预变性	95	30s	1
变性	95	15s	35
				退火	60	15s	35
延伸	72	60s	35
				终延伸	72	5min	1

3、构建表达载体

PCR片段和PET28a空载体分别用BamH I和Not I双酶切，37℃水浴酶切3h。

酶切片段切胶，凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体(试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司vazyme biotech)，测浓度。

目的片段和载体做连接反应，剂盒为CloneExpressII-C112，反应体系为20μL：

使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心手机反应液至管底，37℃反应30min；立即置于冰上冷却。

4、转化

从-80℃冰箱中取出DH5α化学感受态细胞25ul，加入5ul连接产物置于冰上10min,42°热激1min,立即置于冰上3min。加入500ul无抗性LB摇菌45min,37℃，180rpm,低速离心(3000转常温)1min,弃去大部分LB，留100～200ul,吹悬菌体。

5、涂板

将转化产物吸到卡那抗性LB平板上，用玻棒(提前用酒精灯烧过灭菌)推匀，置于37℃孵箱12～16h。挑取单克隆，用带kana抗性的LB摇菌。(20mL无抗性LB+20μL Kana)37℃，220rpm，12h。摇成浓储。提取质粒，送公司测序。根据测序结果，挑选***正确的质粒。

将构建好的质粒转化到BL21感受态的菌株中，涂板过夜(37℃，12-16h)。转化过程：BL21冰上融化，将质粒浓度稀释至20-30ng/ul,BL21 30ul+30ng质粒，冰上静置30min。42℃热激60s,冰上静置3min。+500ul无抗性LB摇菌，180rpm,45min。

6、诱导重组蛋白表达及纯化。

7、将上述的浓储取20μL加入到20ML含1‰Kana的LB溶液中，摇床37℃，220rpm，12h。按不同条件分组摇菌(8ML无抗性LB+8ul浓储+8ulKana)，到菌液的OD值约为0.4～0.6时加入0.5mM浓度的IPTG继续以180rpm的速度摇菌，至OD值约1.0(37℃，6h)，离心收菌(10000rpm)，弃上清，留菌液。每管吸3ul菌，加30uL l*protein loading，煮蛋白95℃10min；涡旋，12000g*3min；取上清20ul加样，跑梯度胶R250考马斯亮蓝染色30min(摇床60rpm),脱色16h(摇床120rpm)。

如图1所示，结果显示有目的蛋白大小的条带，上面的与下面的两个箭头，上方的含有蛋白修饰故分子量略大，与预测的目的蛋白抑制，且表达量很大，足够满足制备抗体的需要。

图2为DRC1亲水性，免疫原性及表位暴露性示意图。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

2.酶切(NEB)

质粒	40ul
		Buffer	5ul
Enzyme 1	2.5ul
		Enzyme 2	2.5ul
ddH2O	0ul

37°温度下，水浴3h。

3.质粒跑胶回收

4.连接(Promega)

按照ClonExpressII说明书进行

5*CEII Buffer	4ul
		Exnase II	2ul
Pet28a(+)	13ul(浓度12.4ng/ul)
		片段1/2	1ul(浓度：1.106ng/ul 2.156ug/ul)

5.转化

取DH5α感受态细胞25ul，加入5ul连接产物置于冰上10min,42°热激1min,立即置于冰上3min。

加入500ul无抗性LB摇菌45min,37℃，180rpm,低速离心(3000转常温)1min,弃去大部分LB，留100～200ul,吹悬菌体。

7.涂板

将转化产物吸到卡那抗性LB平板上，用玻棒(提前用酒精灯烧过灭菌)推匀，置于37°孵箱12～16h。

8.挑取单克隆，用带kana抗性的LB摇菌。

9.提取质粒，送公司测序。

在至少一个实施例中：DRC1蛋白纯化

Wash buffer：

平衡液+30m M imidazole,PH 8.0

Elution buffer:

平衡液+250mM imidazole,PH 8.0

实验过程：

1.大量诱导所得菌中加入20ml平衡液，重旋后1:100加入PMSF，混匀；

2.冰盒中超声，3s on,3s off,每20min加次冰，混匀，1h后菌液仍浑，离心后取沉淀同样条件继续超声；

3..10000g,15min,离心，取上清；

4.清洗过滤柱，装过滤柱，向过滤柱中加入2ml Ni-NTA Resin后平衡液过柱；

5.上清-wash buffer 30ml-elution buffer 20ml顺次过柱。elution buffer过柱所得液体用l.5mlEP管接500ul*20管。冻存于-80℃。第一次过柱后上清留下，再过一次柱。

6.每管取30ul，加6*loading buffer 95℃煮10min，同时，各取3ul诱导前、诱导后(未纯化)菌，加入20ul 1*loading buffer,95℃煮10min,同时，配置5ug(1ul标准品+7ulelution buffer+2ul loading buffer)，10ug(2+6+2)，20ug(4+4+2)BSA标准品(5mg/ml),95℃煮10min。

7.跑胶。

8.R250染色15min。

9.脱色过夜。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种特异性识别蛋白DRC1的多克隆抗体的制备方法及其应用

<130> 1

<141> 2019-07-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 5

<211> 438

<212> DNA

<213> 动力蛋白调节复合蛋白1(Dynein regulatory complex protein 1)

<400> 5

atgaatccct caggaaccat tggggtccta gagcagaatg gggaagaaca cttagccacc 60

ccgattctcg gaccctcggt gcattcggat aacccgcagg agcggatcca ggcccggcgc 120

ctgcgcatcg ctgctcgtca ggaagcccga aggcgggaag ccctgggaga gtatttggac 180

gggaagaagg agagtgagga ggagcagagc aagagctaca aacagaaaga agagagccgc 240

ctgaaactga ctaaactcct gctctgcggg accgagttgg tgacaaatat tcaggtggct 300

gcagacgtca gagagatcca caggagggtt gaagaggagg agacaaagcg gcagagactg 360

gagaagctgg agaatgaagt taagaccagc caggataaat ttgatgaaat cacggcgaag 420

tgggaggagg gcagacgg 438

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 动力蛋白调节复合蛋白1(Dynein regulatory complex protein 1)

<400> 6

cagcaaatgg gtcgcggatc catgaatccc tcaggaacca ttggg 45

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 动力蛋白调节复合蛋白1(Dynein regulatory complex protein 1)

<400> 7

tggtggtgct cgagtgcggc cgcgcttcct gacgagcagc gatg 44

<210> 8

<211> 146

<212> PRT

<213> 动力蛋白调节复合蛋白1(Dynein regulatory complex protein 1)

<400> 8

Met Asn Pro Ser Gly Thr Ile Gly Val Leu Glu Gln Asn Gly Glu Glu

1 5 10 15

His Leu Ala Thr Pro Ile Leu Gly Pro Ser Val His Ser Asp Asn Pro

20 25 30

Gln Glu Arg Ile Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Ala Ala Arg Gln Glu

35 40 45

Ala Arg Arg Arg Glu Ala Leu Gly Glu Tyr Leu Asp Gly Lys Lys Glu

50 55 60

Ser Glu Glu Glu Gln Ser Lys Ser Tyr Lys Gln Lys Glu Glu Ser Arg

65 70 75 80

Leu Lys Leu Thr Lys Leu Leu Leu Cys Gly Thr Glu Leu Val Thr Asn

85 90 95

Ile Gln Val Ala Ala Asp Val Arg Glu Ile His Arg Arg Val Glu Glu

100 105 110

Glu Glu Thr Lys Arg Gln Arg Leu Glu Lys Leu Glu Asn Glu Val Lys

115 120 125

Thr Ser Gln Asp Lys Phe Asp Glu Ile Thr Ala Lys Trp Glu Glu Gly

130 135 140

Arg Arg

145