一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法 (Separation and purification method of IVIg-simulated multi-human-part mixed human plasma IgG sample ) 是由 马莉 徐继轩 张巍 杜晞 王宗奎 叶生亮 张容 王娅 李长清 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术研发领域,涉及一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法,若干份血浆混合后,依次经过混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤,得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品,用于其它后续研究步骤使用。样品IgG含量高,IgG谱广泛,亲水性与机体高亲和等,专供IVIg等血浆纯化蛋白制品的制品改良等研究需求使用。(The invention belongs to the field of biomedical technology research and development, and relates to a separation and purification method of a multi-part mixed human plasma IgG sample for simulating IVIg. The sample has high IgG content, wide IgG spectrum, high hydrophilicity and body affinity, and the like, and is specially used for the research requirements of product improvement and the like of plasma purified protein products such as IVIg and the like.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法。
背景技术
静注人免疫球蛋白pH4(intravenous immunoglobulins，IVIG)，是一种重要的人血浆蛋白制品，主要成分是免疫球蛋白IgG。
IVIg作为传统的血液制品因其安全有效的特点而得到广泛应用，已经成为传统血液制品之一，其工业化程度很高。但也是受限于其高度的工业化，商业化IVIg制品的可编辑性极低。IVIg长久以来的多项缺陷与短板受工业化的限制而难以对制品采取基础研究所需的针对IVIg编辑优化的相关研究。
如何尽可能保留血浆完整IgG抗体谱的前提下，不丢失IgG抗体的生物学活性并尽量降低纯化产物中杂蛋白的含量，是需要解决的技术问题。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，纯化方法为在实验条件下对现有单一传统蛋白质纯化方法的集成应用，所制备样品IgG高纯高丰度，与IVIg制品高度相似；制备过程易干预，灵活度高，能够满足各种研究目的的实验样本需求，填补IVIg制品研发领域的空缺。
解决以上技术问题的本发明中的一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，其特征在于：若干份血浆混合后，依次经过混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品，用于其它后续研究步骤使用。
本发明中一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，包括以下具体步骤：
步骤一：若干份血浆混合；
步骤二：混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化：主要目的在于去除血浆白蛋白、脂质等非IgG成分。
(1)步骤一混浆与饱和度100％的饱和硫酸铵溶液在常温条件下按体积比1：1等体积混合，静置后离心，弃上清取沉淀；
需精确把控混合体积比，尽量去除上清液，这将影响白蛋白的去除效果以及IgG的沉淀效果，操作需尽量温和迅速，否则将影响IgG生物学活性。
(2)沉淀按混浆与重溶粗蛋白体积比1：0.6-1于沉淀中加入适量平衡缓冲液(Start Buffer；SB)后震荡混匀充分溶解沉淀；
(3)上述所得溶液经0.22μm孔径超滤膜超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；具体为使用0.22μm针头超滤膜(Merck millporeLtd.Tullagreen,Carrigtwohill,Co.cork,IRL.)对重溶沉淀进行超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；
步骤三：粗蛋白离子交换层析纯化：缓冲体系的pH、精氨酸浓度、盐浓度等因素将影响IgG整体纯度与回收率。
(1)步骤二所得粗蛋白样品通过Hitrap Desalting脱盐层析柱脱盐处理，监视器紫外峰完全通过后可重复上样；
(2)除盐后样品通过Hitrap Capto MMC离子亲和层析柱结合粗蛋白IgG成分，使用洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)洗脱与填料结合的IgG成分，收集洗脱峰组分(ET)，再生液(Washing Buffer；WB)完全通过后可重复上样；
Hitrap Capto MMC阳离子交换层析柱的吸附纯化效果受到缓冲体系盐浓度、pH值以及温度等因素影响。实验过程处于恒温条件下，最大化提升IgG抗体的纯化效果，温度条件为25℃室温环境。
(3)纯化蛋白样品保存于4℃条件或冰上备用；
步骤四：纯化蛋白超滤及缓冲系置换：组分检测后使用离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度，即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品。
具体为组分检测后使用Ultracel-30K离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度；即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品，可供后续实验需求使用。
所述步骤(一)和步骤(二)之间还有若干份血浆混合预处理步骤和混浆去冷沉淀步骤。混浆去冷沉淀步骤主要目的在于去除血浆Ⅷ因子、纤维蛋白原vWF等非IgG成分。
所述若干份血浆混合预处理步骤：获取原料血浆，根据研究需求可选用任意血浆份数，浆源类型，混浆比例，添加剂种类及数量条件制备混浆。
进一步优化步骤中，所述原料血浆为若干份新鲜血浆或冻存期2年以内的冰冻血浆。
所述混浆去冷沉淀步骤中去冷沉淀处理次数为1-2次，处理后混浆保存于4℃条件或冰上备用。混浆去冷沉淀操作为常规操作方式。
所述步骤二的第(3)步中超滤为使用Hitrap Capto MMC阳离子交换层析柱5mL×5；所述平衡缓冲液(Start Buffer；SB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)，pH＝6.5，柱温25℃，流速为1.5mL/min。
所述步骤三的洗脱缓冲液为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)含0.2-0.8M精氨酸，pH＝7.5-8.5。
优化方案中，洗脱缓冲液为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)，含0.5M精氨酸，pH＝8.0。
Hitrap Capto MMC阳离子交换层析柱对缓冲体系盐浓度敏感，降低盐浓度将有利于提升IgG纯化效果。也对缓冲体系亲疏水条件与有机试剂敏感，亲水性缓冲体系，不含有机试剂，提升IgG抗体的纯化效果。还对缓冲体系pH值敏感，本发明中IgG抗体的最适吸附环境为pH＝6.2-6.8，IgG抗体的最适洗脱环境为pH＝7.5-8.5，洗脱环境下，在pH变化＜1的前提下，升高pH有利于洗脱结合蛋白，提高总蛋白收率，但是将提升杂蛋白的比例，反之亦然。
Hitrap Capto MMC阳离子交换层析柱对缓冲体系精氨酸浓度也敏感，本发明中IgG抗体的最适精氨酸洗脱浓度为0.2-0.8M精氨酸，洗脱环境下，在精氨酸浓度变化＜0.3M的前提下，升高精氨酸浓度有利于洗脱结合蛋白，提高总蛋白收率，但是将提升杂蛋白的比例，反之亦然。
所述步骤(四)中模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG成品分装后于4℃(1周)、-20℃(1年)、-80℃(10年)条件下避光保存，避免反复冻融。
所述纯化方法中组份检测为设有模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品检测步骤，即样品成品通过BCA、Elisa、Western Blot、Coomassie brilliant blue staining生化实验检测分析其组分，是否含有硫酸铵、精氨酸、枸橼酸抗凝剂或其它成分，有各组份含量多少。
所述纯化方法中组份检测为使用BCA蛋白浓度测定法测定步骤三所得纯化蛋白样品的总蛋白浓度或通过Elisa法测定IgG浓度。
本发明混浆IgG样品具备传统市售IVIg制品的多人份混合IgG，样品IgG含量高，IgG谱广泛，亲水性与机体高亲和等特点。对传统的单一的蛋白纯化分离工艺与步骤进行了集成和优化，所需实验条件温和一个简单操作即可完成全程实验，所制备样品IgG富集效果良好，与IVIg制品高度相似。制备过程易干预，灵活度高，能够满足各种研究目的的实验样本需求。尽可能保留了血浆完整IgG抗体谱，且不丢失IgG抗体的生物学活性，并尽量降低了纯化产物中杂蛋白的含量。
本发明应用于专供IVIg等血浆纯化蛋白制品的制品改良，优化为目的的研究需求使用，以填补国内IVIg等制品受限于工业化生产流程而难以小批量任意生产，编辑，修饰，调整，检测的需求空缺。且仅需普通生化实验室条件下即可进行，简单、高效、稳定、经济、重复性和样品均一性高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明，本发明所指普通实验室条件为，具备完成基本生物化学实验需求的生物学实验室，需要具备基本的纯化层析能力及相关仪器，需要具备稳定常温(25℃)实验环境，4℃及-20℃冷藏环境，需要具备离心系统，需要具备基本无菌实验平台，其它所用操作方法如BCA蛋白浓度测定法、Elisa法为常规方法和市场上购买的试剂：
实施例1
一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，依次经若干份血浆混合、混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品用于下游研究使用。
具体步骤如下：
步骤一：若干份血浆混合；
步骤二：混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化：
(1)步骤一所得混浆与饱和度100％的饱和硫酸铵溶液在常温条件下按体积比1：1等体积混合，静置后离心，弃上清取沉淀；
(2)沉淀按预处理混浆与重溶粗蛋白体积比1：0.6于沉淀中加入适量平衡缓冲液(Start Buffer；SB)后震荡混匀充分溶解沉淀；
(3)上述所得溶液经0.22μm孔径超滤膜超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；超滤为用离子交换柱Hitrap Capto MMC离子亲和层析柱5mL×5；所述平衡缓冲液(Start Buffer；SB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)，pH＝6.5，柱温25℃，流速为1.5mL/min。
血浆先混合，再去冷沉淀，然后硫酸铵沉淀，再缓冲液重溶。
步骤三：粗蛋白离子交换层析纯化：
(1)步骤二所得粗蛋白样品通过Hitrap Desalting脱盐层析柱脱盐处理，监视器紫外峰完全通过后可重复上样；
(2)除盐后样品通过Hitrap Capto MMC离子亲和层析柱结合粗蛋白IgG成分，使用洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)洗脱与填料结合的IgG成分，收集洗脱峰组分(ET)，再生液(Washing Buffer；WB)完全通过后可重复上样；洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)含0.3M精氨酸，pH＝8.0。
(3)纯化蛋白样品保存于4℃条件或冰上备用；
步骤四：纯化蛋白超滤及缓冲系置换：
(1)模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品可有检测步骤，即样品成品通过BCA、Elisa、Western Blot、Coomassie brilliant blue staining生化实验检测分析其组分，是否含有硫酸铵、精氨酸、枸橼酸抗凝剂或其它成分，有各组份含量多少。
(2)使用Ultracel-30K离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度；即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品，可供后续实验需求使用。
模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG成品分装后于4℃(1周)、-20℃(1年)、-80℃(10年)条件下避光保存，避免反复冻融。
本发明中制得的混浆IgG样品具备传统市售IVIg制品的多人份混合IgG，样品IgG含量高，IgG谱广泛，亲水性与机体高亲和等，专供IVIg等血浆纯化蛋白制品的制品改良，优化为目的的研究需求使用。
实施例2
一种模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品的分离纯化方法，依次经若干份血浆混合预处理步骤、混浆去冷沉淀步骤、混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化步骤、粗蛋白超滤步骤、粗蛋白离子交换层析纯化步骤、纯化蛋白超滤步骤、纯化蛋白的缓冲系置换及组分检测步骤，得模拟IVIg制品的多人份混浆高纯高丰度IgG样品用于下游研究使用。
具体步骤如下：
步骤一：多人份人混浆预处理：获取原料血浆，根据研究需求可选用任意血浆份数，浆源类型，混浆比例，添加剂种类及数量条件制备混浆；原料血浆为若干份新鲜血浆或冻存期2年以内的冰冻血浆。
步骤二：混浆需经过血浆冷沉淀分离步骤根据研究需求可增减去冷沉淀处理次数；混浆保存于4℃条件或冰上备用。
步骤三：混浆50％饱和硫酸铵法粗纯化：
(1)步骤二所得预处理混浆与饱和度100％的饱和硫酸铵溶液在常温条件下按体积比1：1等体积混合，静置后离心，弃上清取沉淀；
(2)沉淀按预处理混浆与重溶粗蛋白体积比1：0.8于沉淀中加入适量平衡缓冲液(Start Buffer；SB)后震荡混匀充分溶解沉淀；
(3)上述所得溶液经0.22μm孔径超滤膜超滤后得粗蛋白样品；样品保存于4℃条件或冰上备用；超滤为用离子交换柱Hitrap Capto MMC离子亲和层析柱5mL×5；所述平衡缓冲液(Start Buffer；SB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)，pH＝6.5，柱温25℃，流速为1.5mL/min。
血浆先混合，再去冷沉淀，然后硫酸铵沉淀，再缓冲液重溶。
步骤四：粗蛋白离子交换层析纯化：
(1)步骤三所得粗蛋白样品通过Hitrap Desalting脱盐层析柱脱盐处理，监视器紫外峰完全通过后可重复上样；
(2)除盐后样品通过Hitrap Capto MMC离子亲和层析柱结合粗蛋白IgG成分，使用洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)洗脱与填料结合的IgG成分，收集洗脱峰组分(ET)，再生液(Washing Buffer；WB)完全通过后可重复上样；洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)含含0.8M精氨酸，pH＝8.5。
(3)纯化蛋白样品保存于4℃条件或冰上备用；
步骤五：纯化蛋白超滤及缓冲系置换：
(1)模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品可有检测步骤，即使用BCA蛋白浓度测定法测定步骤三所得纯化蛋白样品的总蛋白浓度或通过Elisa法测定IgG浓度；
(2)使用Ultracel-30K离心式超滤器对纯化蛋白样品进行超滤处理，根据所测蛋白浓度复溶至研究需要的蛋白浓度或IgG浓度；即得模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG样品成品，可供后续实验需求使用。
模拟IVIg的多人份混合人血浆IgG成品分装后于4℃(1周)、-20℃(1年)、-80℃(10年)条件下避光保存，避免反复冻融。
本发明中制得的混浆IgG样品具备传统市售IVIg制品的多人份混合IgG，样品IgG含量高，IgG谱广泛，亲水性与机体高亲和等，专供IVIg等血浆纯化蛋白制品的制品改良，优化为目的的研究需求使用。
实施例3
其它内容如实施例2中，其中洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)含含0.2M精氨酸，pH＝7.5。沉淀按预处理混浆与重溶粗蛋白体积比1：1于沉淀中加入适量平衡缓冲液(Start Buffer；SB)后震荡混匀充分溶解沉淀。
实施例4
其它内容如实施例2中，其中洗脱缓冲液(Elution Buffer；EB)为0.22μm滤膜超滤磷酸盐缓冲液(PB)含含0.5M精氨酸，pH＝8.0。
试验一
以实施例4为实验例，其中本试验每个步骤中得率情况：
以性别为差异的单性别混浆纯化终产物性质为半饱和硫酸铵沉淀步骤中间产物样品总蛋白含量为20.19μg/μL，蛋白回收率约为72.7％；
所得粗蛋白样品通过Hitrap Desalting脱盐层析柱脱盐处理，除盐阶段样品总蛋白含量为10.55μg/μL，回收率约为52.25％；
MMC阳离子交换层析步骤总蛋白含量为3.45μg/μL，回收率约为32.70％；
最终产物终IgG含量范围在9.6mg/mL-18.53mg/mL，IgG占总蛋白比值约为19.2％-37.06％；
终产物中IgM含量范围在11.30μg/mL-15.20μg/mL，终产物中IgD含量范围在0.14μg/mL-0.23μg/mL，终产物中IgE含量范围在0.13μg/mL-0.14μg/mL；终产物IgG抗体Fc段生物学活性约为41％。
本发明的终产物现以初步在THP-1诱导的DC细胞模型上进行应用，实验结果显示，不同浓度与不同性别的样品与DC细胞共培养后，检测细胞培养上清液中细胞因子浓度，细胞因子浓度存在差异。
为了响应IVIg及类似的血液制品的改进、优化与研究的需求，创建了本专利所述实验室条件下模拟IVIg及其他血浆蛋白纯化制品的混浆IgG抗体纯化实验平台。从整体上对IVIg工业制备工艺进行条件简化与模拟，并能获得性状接近的最终产品。本发明所有产物仅适用于研究需要，严禁在临床中使用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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