一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法
阅读说明：本技术 一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法 (Method for rapidly extracting human immunoglobulin from blood plasma ) 是由 刘勇 邓靖 张尧 李丹 肖春桥 杨龙 陈云华 赵学梅 于 2020-12-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物制品技术领域,具体是一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法。本发明以血浆为原料,采用特定浓度的辛酸直接进行沉淀,减少组分反应步骤,最终产品质量好、收率高,基本不含活化凝血因子Ⅺ等杂质,能有效避免产品使用过程中产生致栓性风险,降低产品发生血栓不良反应。本发明的生产方法简单,工艺周期短,不需要进行血浆低温乙醇工艺中组分反应步骤,能够快速制备免疫球蛋白,尤其适用突发性大规模疫情感染特异性免疫球蛋白的制备,为患者快速提供高效价、高安全性的特异性免疫抗体制剂。(The invention relates to the technical field of biological products, in particular to a method for quickly extracting human immunoglobulin from blood plasma. The invention takes blood plasma as a raw material, adopts caprylic acid with a specific concentration to directly precipitate, reduces the reaction steps of components, has good quality and high yield of the final product, does not contain impurities such as activated blood coagulation factor XI and the like basically, can effectively avoid the risk of causing thrombosis in the use process of the product, and reduces the adverse reaction of thrombus of the product. The production method is simple, the process period is short, the component reaction step in the plasma low-temperature ethanol process is not needed, the immunoglobulin can be rapidly prepared, the method is particularly suitable for preparing the specific immunoglobulin for sudden large-scale epidemic infection, and the specific immune antibody preparation with high titer and high safety is rapidly provided for patients.)
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体是一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法。
背景技术
人免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是人体对外来抗原(如细菌、病毒及其毒素或异物)进行免疫应答的主要物质，又称抗体。免疫球蛋白根据结构不同可分为5个大类，分别命名为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，其中IgG含量最高，约占血清免疫球蛋白总量的70-80％，是重要的血浆蛋白之一。
人免疫球蛋白可制作成注射剂，用于补充人体所需的各种抗体，提高人体抗病、抗感染能力，主要分为普通免疫性球蛋白和特异性免疫球蛋白。普通免疫球蛋白富含多种天然抗体，可抵抗大部分人体微生物感染。特异性免疫球蛋白制剂是利用血浆免疫技术，获得特异性免疫血浆，分离纯化出特异性免疫球蛋白，用于某些特定的病毒性感染性疾病的治疗，尤其是一些突发性的疫情感染性疾病。世界范围内在应对突发疫情感染的治疗方面，为了快速救治感染患者和控制疫情，一般是通过输注康复者的血浆使患者获得特异性免疫球蛋白作为一种重要的治疗手段，但血浆具有未知病毒感染的风险，治愈患者的同时也将带来较大其他未知病毒感染风险，所以使用快速制备方法获得合适的并经病毒灭活后的人免疫球蛋白对突发性疫情进行治疗是更好的选择。
目前，常规的人免疫球蛋白制备技术是由健康人血浆，经多步Cohn低温乙醇工艺制备组份II，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。制备方法工艺步骤复杂，所需原料组分II需经组分I、组分II+III、组分II反应以及多步组分分离步骤制备而成，组分II经进一步溶解、层析以及病毒灭活才能制成最终成品，产品制造周期长，不能快速制备免疫球蛋白类制剂，以发挥免疫球蛋白尤其特异性免疫球蛋白在突发性疫情感染情况下的重要治疗作用。
另外据研究发现，现有产品制备工艺中，由于低温乙醇反应时，血浆蛋白组分中会残留一定量的凝血因子类物质，并在制备过程中进入到最终产品中，尤其是凝血因子Ⅺ，进而导致免疫球蛋白类制剂发生血栓风险的重要原因。因此临床使用安全的免疫球蛋白制剂应该是不含凝血因子类物质的产品，而现有低温乙醇工艺已使用多年，没有专门针对凝血因子因子去除步骤，如果要专门除去其中的凝血因子类物质，需要加入专门的去除步骤，通常又会使用新的试剂，导致引进新的杂质并且整体制备所需时间也会延长，如专利CN201210071691.5(一种静注人免疫球蛋白的制备工艺)。
针对大规模、扩张快速的新型疫情，需要大量的人免疫球蛋白制剂以进行对抗，此时需要一种制备速度较快，并且所得人免疫球蛋白中凝血因子类物质含量较少的且经过病毒灭活的人免疫球蛋白制备方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法，本发明的方法包括如下步骤：
(1)使用单采血浆技术，采集健康献浆员血浆、经疫苗免疫的献浆员血浆或者突发性疫情感染的康复者血浆作为原料；
(2)将步骤(1)中的血浆于20-25℃条件下融化，用醋酸缓冲液稀释血浆，加入辛酸进行辛酸沉淀反应，沉淀杂蛋白，过滤去除沉淀，收集上清液；
(3)将步骤(2)的上清液，补加辛酸进行辛酸病毒灭活，灭活后进行深层过滤，收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的经过深层过滤后的溶液，经过离子交换层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液进行超滤透析，得到透析后料液；
(6)将步骤(5)中透析后料液进行纳米膜过滤，纳米膜孔径为20nm，得到过滤液，此时由于滤膜孔径小，可拦截料液中可能存在的病毒，尤其血浆中细小病毒，而免疫球蛋白分子则顺利通过滤膜；
(7)将步骤(6)的过滤液加入山梨醇，进行巴氏病毒灭活，得到巴氏灭活后料液；
(8)将步骤(7)的巴氏灭活后料液进行超滤透析，得到原液；
(9)将步骤(8)的原液进行半成品配制，进行除菌过滤、分装，得到成品。
优选的，所述步骤(1)中的血浆融化后，用2-4倍体积的pH4.0醋酸缓冲液稀释血浆。
优选的，所述步骤(2)中的加入辛酸进行辛酸沉淀反应，具体是加入浓度为80-100mmol/L的辛酸，进行辛酸沉淀反应，反应控制pH为4.8-5.0，辛酸添加结束后，搅拌反应2-3h。
优选的，所述步骤(2)中的过滤，是采用压滤，具体是：辛酸反应结束后，向反应液中添加1％～2％料液重量的硅藻土，搅拌15min，进行压滤，加入硅藻土，有助于对料液进行过滤，并且硅藻土可吸附辛酸反应过程中析出的微细杂蛋白，过滤效果更好，料液更佳澄清。
优选的，所述步骤(3)中的辛酸病毒灭活，具体是：将压滤上清液，补加辛酸至200mmol/L，调整料液pH至5.2，于20℃条件下孵育2小时，加入1％～2％料液重量的硅藻土，进行深层过滤。辛酸病毒灭活可对料液中可能存在的脂包膜及非脂包膜病毒。
优选的，所述步骤(4)中的离子交换层析，具体是：用注射用水对料液进行稀释，调整料液pH至5.2±0.1，进行DEAE离子交换层析，收集层析流穿液。用于去除料液中残留的白蛋白、IgA、IgM等杂质，提高制品纯度。
优选的，所述步骤(5)中的超滤透析，具体是：用50kD的超滤膜进行超滤透析，去除层析中缓冲液成分，用注射用水作为透析液恒量透析5倍，超滤透析温度控制在5.0℃以下。免疫球蛋白分子量为150kD，50kD孔径超滤膜可将球蛋白分子截留在超滤膜内进行透析或浓缩，而其他物质可随超滤透析去除，不影响后续操作步骤。
优选的，所述步骤(6)中的加入山梨醇，具体是：添加山梨醇，调节料液pH至4.8～5.2，山梨醇含量33±1％。
优选的，所述步骤(9)，原液进行半成品配制，具体是调节原液蛋白浓度至5％、10％等目标浓度，加入麦芽糖作为保护剂，调节pH至4.0-4.5。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本发明以血浆为起始原料，直接通过辛酸沉淀反应结合层析技术，获得质量好、收率高、病毒安全性高的免疫球蛋白制剂。
(2)本发明以血浆为原料，采用特定浓度的辛酸直接进行沉淀反应，减少组分反应步骤，不需要专门加入除杂步骤也能去除产品中可能存在凝血活性类物质，如活化凝血因子Ⅺ等，获得更为安全的免疫球蛋白制剂，降低产品发生血栓不良反应。
(3)本发明的方法制备过程采用辛酸病毒灭活、纳米膜过滤及巴氏灭活等三步病毒灭活，三种方法均对非脂包膜和脂包膜病毒具有较好效果(常规方法如低pH孵放法、S/D灭活法等，一般仅灭活单一脂包膜或非脂包膜病毒)，能够充分保证产品使用的病毒安全性。
(4)本发明的生产方法简单，工艺周期短，不需要进行血浆低温乙醇工艺中组分反应步骤，能够快速制备免疫球蛋白，尤其适用突发性大规模疫情感染特异性免疫球蛋白的制备，为患者快速提供高效价、高安全性的特异性免疫抗体制剂。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
(1)使用单采血浆技术，采集健康献浆员的血浆2L；
(2)将步骤(1)中的血浆于25℃条件下融化用3倍体积的pH4.0醋酸缓冲液稀释血浆，加入浓度为90mmol/L的辛酸，进行辛酸沉淀反应，反应控制pH为4.9，辛酸添加结束后，搅拌反应2.5h，沉淀杂蛋白，向反应液中添加1.5％料液重量的硅藻土，搅拌15min，进行压滤，收集上清液；
(3)将步骤(2)的上清液，补加辛酸至200mmol/L，调整料液pH至5.2，于20℃条件下孵育2小时，加入1.5％料液重量的硅藻土，进行深层过滤；
(4)将步骤(3)得到的经过深层过滤后的溶液，用注射用水对料液进行稀释，调整料液pH至5.2，进行DEAE离子交换层析，收集层析流穿液，收集流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液用50kD的超滤膜进行超滤透析，去除层析中缓冲液成分，用注射用水作为透析液恒量透析5倍，超滤透析温度控制在5.0℃以下，得到透析后料液；
(6)将步骤(5)中透析后料液进行纳米膜过滤，纳米膜孔径为20nm，得到过滤液，此时由于滤膜孔径小，可拦截料液中可能存在的病毒，尤其血浆中细小病毒，而免疫球蛋白分子则顺利通过滤膜；
(7)将步骤(6)的过滤液加入山梨醇，调节料液pH至5.0，山梨醇含量33％，60℃保温10h进行巴氏病毒灭活，得到巴氏灭活后料液；
(8)将步骤(7)的巴氏灭活后料液进行超滤透析，得到原液；
(9)将步骤(8)的原液调节原液蛋白浓度至5％，加入麦芽糖100g/L作为保护剂，调节pH至4.2，进行0.2μm孔径除菌过滤、分装，得到成品。
实施例2
(1)使用单采血浆技术，采集健康献浆员的血浆2L；
(2)将步骤(1)中的血浆于20℃条件下融化用2倍体积的pH4.0醋酸缓冲液稀释血浆，加入浓度为80mmol/L的辛酸，进行辛酸沉淀反应，反应控制pH为4.8，辛酸添加结束后，搅拌反应2h，沉淀杂蛋白，向反应液中添加1％料液重量的硅藻土，搅拌15min，进行压滤，收集上清液；
(3)将步骤(2)的上清液，补加辛酸至200mmol/L，调整料液pH至5.2，于20℃条件下孵育2小时，加入1％料液重量的硅藻土，进行深层过滤；
(4)将步骤(3)得到的经过病毒灭活后的溶液，用注射用水对料液进行稀释，调整料液pH至5.1，进行DEAE离子交换层析，收集层析流穿液，收集流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液用50kD的超滤膜进行超滤透析，去除层析中缓冲液成分，用注射用水作为透析液恒量透析5倍，超滤透析温度控制在5.0℃以下，得到透析后料液；
(6)将步骤(5)中透析后料液进行纳米膜过滤，纳米膜孔径为20nm，得到过滤液，此时由于滤膜孔径小，可拦截料液中可能存在的病毒，尤其血浆中细小病毒，而免疫球蛋白分子则顺利通过滤膜；
(7)将步骤(6)的过滤液加入山梨醇，调节料液pH至5.2，山梨醇含量32％，60℃保温10h进行巴氏病毒灭活，得到巴氏灭活后料液；
(8)将步骤(7)的巴氏灭活后料液进行超滤透析，得到原液；
(9)将步骤(8)的原液调节原液蛋白浓度至5％，加入麦芽糖100g/L作为保护剂，调节pH至4.2，进行0.2μm孔径除菌过滤、分装，得到成品。
实施例3
(1)使用单采血浆技术，采集健康献浆员的血浆2L；
(2)将步骤(1)中的血浆于23℃条件下融化用4倍体积的pH4.0醋酸缓冲液稀释血浆，加入浓度为100mmol/L的辛酸，进行辛酸沉淀反应，反应控制pH为5.0，辛酸添加结束后，搅拌反应3h，沉淀杂蛋白，向反应液中添加2％料液重量的硅藻土，搅拌15min，进行压滤，收集上清液；
(3)将步骤(2)的上清液，补加辛酸至200mmol/L，调整料液pH至5.2，于20℃条件下孵育2小时，加入2％料液重量的硅藻土，进行深层过滤；
(4)将步骤(3)得到的经过深层过滤后的溶液，用注射用水对料液进行稀释，调整料液pH至5.3，进行DEAE离子交换层析，收集层析流穿液，收集流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液用50kD的超滤膜进行超滤透析，去除层析中缓冲液成分，用注射用水作为透析液恒量透析5倍，超滤透析温度控制在5.0℃以下，得到透析后料液；
(6)将步骤(5)中透析后料液进行纳米膜过滤，纳米膜孔径为20nm，得到过滤液，此时由于滤膜孔径小，可拦截料液中可能存在的病毒，尤其血浆中细小病毒，而免疫球蛋白分子则顺利通过滤膜；
(7)将步骤(6)的过滤液加入山梨醇，调节料液pH至4.8，山梨醇含量34％，60℃保温10h进行巴氏病毒灭活，得到巴氏灭活后料液；
(8)将步骤(7)的巴氏灭活后料液进行超滤透析，得到原液；
(9)将步骤(8)的原液调节原液蛋白浓度至5％，加入麦芽糖100g/L作为保护剂，调节pH至4.2，进行0.2μm孔径除菌过滤、分装，得到成品。
实施例4
(1)使用单采血浆技术，采集经狂犬疫苗免疫的献浆员血浆2L；
(2)将步骤(1)中的血浆于25℃条件下融化用3倍体积的pH4.0醋酸缓冲液稀释血浆，加入浓度为90mmol/L的辛酸，进行辛酸沉淀反应，反应控制pH为4.9，辛酸添加结束后，搅拌反应2.5h，沉淀杂蛋白，向反应液中添加1.5％料液重量的硅藻土，搅拌15min，进行压滤，收集上清液；
(3)将步骤(2)的上清液，补加辛酸至200mmol/L，调整料液pH至5.2，于20℃条件下孵育2小时，加入1.5％料液重量的硅藻土，进行深层过滤；
(4)将步骤(3)得到的经过深层过滤后的溶液，用注射用水对料液进行稀释，调整料液pH至5.2，进行DEAE离子交换层析，收集层析流穿液，收集流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液用50kD的超滤膜进行超滤透析，去除层析中缓冲液成分，用注射用水作为透析液恒量透析5倍，超滤透析温度控制在5.0℃以下，得到透析后料液；
(6)将步骤(5)中透析后料液进行纳米膜过滤，纳米膜孔径为20nm，得到过滤液，此时由于滤膜孔径小，可拦截料液中可能存在的病毒，尤其血浆中细小病毒，而免疫球蛋白分子则顺利通过滤膜；
(7)将步骤(6)的过滤液加入山梨醇，调节料液pH至5.0，山梨醇含量33％，60℃保温10h进行巴氏病毒灭活，得到巴氏灭活后料液；
(8)将步骤(7)的巴氏灭活后料液进行超滤透析，得到原液；
(9)将步骤(8)的原液调节原液蛋白浓度至5％，加入麦芽糖100g/L作为保护剂，调节pH至4.2，进行0.2μm孔径除菌过滤、分装，得到成品。
实施例5
(1)使用单采血浆技术，采集健康献浆员的血浆2L；
(2)将步骤(1)中的血浆于25℃条件下融化用3倍体积的pH4.0醋酸缓冲液稀释血浆，加入浓度为90mmol/L的辛酸，进行辛酸沉淀反应，反应控制pH为4.9，辛酸添加结束后，搅拌反应2.5h，沉淀杂蛋白，向反应液中添加1.5％料液重量的硅藻土，搅拌15min，进行压滤，收集上清液；
(3)将步骤(2)的上清液，补加辛酸至200mmol/L，调整料液pH至5.2，于20℃条件下孵育2小时，加入1.5％料液重量的硅藻土，进行深层过滤；
(4)将步骤(3)得到的经过深层过滤后的溶液，用注射用水对料液进行稀释，调整料液pH至5.2，进行DEAE离子交换层析，收集层析流穿液，收集流穿液；
(5)将步骤(4)的流穿液用50kD的超滤膜进行超滤透析，去除层析中缓冲液成分，用注射用水作为透析液恒量透析5倍，超滤透析温度控制在5.0℃以下，得到透析后料液；
(6)将步骤(5)中透析后料液进行纳米膜过滤，纳米膜孔径为20nm，得到过滤液，此时由于滤膜孔径小，可拦截料液中可能存在的病毒，尤其血浆中细小病毒，而免疫球蛋白分子则顺利通过滤膜；
(7)将步骤(6)的过滤液加入山梨醇，调节料液pH至5.0，山梨醇含量33％，60℃保温10h进行巴氏病毒灭活，得到巴氏灭活后料液；
(8)将步骤(7)的巴氏灭活后料液进行超滤透析，得到原液；
(9)将步骤(8)的原液调节原液蛋白浓度至5％，加入麦芽糖100g/L作为保护剂，调节pH至4.2，进行0.2μm孔径除菌过滤、分装，得到成品。
对比例1
按照专利CN201210071691.5的实施例1进行，血浆用量为2L。
对比例2
(1)将检疫期检疫合格的2L人血浆经离心，离心时，离心速度为3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，蛋白液的温度为2℃，按0.8L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.90；加－18℃95％乙醇，流速为1.2L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－2℃，混合液pH值为7.05。
(2)将步骤(1)的制得物搅拌40min以上，进行离心，离心出液流速为3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库。
(3)将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.62；加－18℃乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－5℃；搅拌150min，静置80min，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力为0.15Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产。
(4)将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入8℃的11倍量的注射用水溶解，然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.6，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5％辛酸40毫升，加完搅拌62min后压缩过滤，过滤压力为0.15Mpa，收集压滤液。
(5)对步骤(4)的制得物压滤液进行超滤，将蛋白含量浓缩至5.7％，用5倍体积4℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至4.5％，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.7，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T＝19℃时测为0.16s/m，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集流穿液。
(6)用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得的流穿液，pH为3.85，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5.6％,用5倍体积5℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6.6％，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，最终蛋白溶液中麦芽糖含量为10.5％，pH为3.9，蛋白含量5.02％。
(7)步骤(6)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装。
将实施例和对比例1-2进行对比，结果如下：
免疫球蛋白得率
免疫球蛋白纯度
制备所需时间
实施例1
7.1kg/吨
100％
＜48小时
实施例2
7.2kg/吨
100％
＜48小时
实施例3
7.0kg/吨
100％
＜48小时
实施例4
7.2kg/吨
100％
＜48小时
实施例5
7.4kg/吨
100％
＜48小时
对比例1
6.9kg/吨
99.8％
26天
对比例2
6.1kg/吨
99.1％
26天
注：免疫球蛋白得率按照每吨血浆回收免疫球蛋白的量计算。
并且各实施例的通过本申请所得的人免疫球蛋白产品中，活化凝血因子Ⅺ含量均＜2mIU/ml，避免了产品使用过程中产生致栓性风险，降低产品发生血栓不良反应。
由上数据可知，本发明的方法具有良好的产品得率及产品纯度，最终所得产品中活化凝血因子Ⅺ含量＜2mIU/ml，并且用时远远少于其他现有技术，说明通过本发明的方法不需要专门加入除杂步骤也能去除产品中可能存在凝血活性类物质，如活化凝血因子Ⅺ等，避免产品使用过程中产生致栓性风险，降低产品发生血栓不良反应，且不需要进行血浆低温乙醇工艺中组分反应步骤，能够快速制备免疫球蛋白。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。