一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探针及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探针及其制备方法与应用 (Colorimetric/fluorescent probe for detecting hypochlorite ions and preparation method and application thereof ) 是由 张然 苗保喜 赵鑫榆 倪中海 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探针及其制备方法与应用,荧光探针命名为TPE-acylamide-Rh,其化学结构式如式I所示；由1-(4-甲酸苯基)-1,2,2-三苯乙烯溶于氯化亚砜中,加热反应后,在惰性气氛和催化作用下与罗丹明B酰肼反应合成、纯化得到。该探针在溶液状态和聚集状态下对ClO～(-)识别性能表现出优良的选择性、抗离子干扰能力以及灵敏度。另外,该探针在聚集状态形成纳米颗粒,容易细胞染色,有利于细胞成像应用。Hela细胞成像研究表明：TPE-acylamide-Rh表现出对细胞中ClO～(-)优异的识别特性。该探针制备工艺简单、合成路线短。将探针应用于检测次氯酸根离子中,拓宽了探针的应用范围。(A colorimetric/fluorescent probe for detecting hypochlorite ions, a preparation method and application thereof are disclosed, wherein the fluorescent probe is named as TPE-acylamide-Rh, and the chemical structural formula of the fluorescent probe is shown as formula I; dissolving 1- (4-phenyl formate) -1,2, 2-triphenylethylene in thionyl chloride, heating for reaction, reacting with rhodamine B hydrazide under the action of an inert atmosphere and catalysis, and purifying to obtain the rhodamine B hydrazide. The probe is used for ClO in a solution state and an aggregation state ‑ The identification performance shows excellent selectivity, anti-ion interference capability and sensitivity. In addition, the probe forms nanoparticles in an aggregation state, is easy to dye cells and is beneficial to cell imaging application. Hela cell imaging studies showed that: TPE-acylamide-Rh showed to be directed to ClO in cells ‑ Excellent identification characteristics. The probe has simple preparation process and synthesisThe route is short. The probe is applied to detecting hypochlorite ions, so that the application range of the probe is widened.)
技术领域
本发明属于有机荧光分子探针领域，具体涉及一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探针 及其制备方法与应用。
背景技术
次氯酸，作为一种强氧化剂，在日常生活中广泛的应用于自来水消毒和衣物漂白等； 也是生物体中一种重要的活性氧小分子，参与生物体的免疫调节、抗原响应、信号传导以 及细胞凋零等过程。打破体内ClO-平衡会引发各种心血管疾病、组织炎症甚至癌症。因此， 为了防止来自ClO-的威胁，研究快速、有效、准确的检测环境中以及生物体内ClO-的方法 有着迫切需求。
与传统的ClO-检测方法(碘量法、库伦法、极谱法、电化学法、电势法等)相比，荧光探针显示出快速、灵敏、选择性好、原位实时检测等优点和潜力而得到广泛应用，并且 在细胞中次氯酸显影成像技术表现出巨大优势。ClO-既没有金属离子的配位能力，也没有 CN-的强的亲核性质或F-的强的电负性，因此，ClO-荧光探针的设计合成具有一定的挑战。
近年来，研究人员设计合成了很多基于不同检测机制的ClO-荧光探针，如荧光淬灭型、 OFF-ON型、比率型等。与荧光淬灭型探针相比，OFF-ON型型癸光探针虽在检测灵敏度上 有一定的提高，易于实现可视化检测，但由于检测是在单一波长下进行，易于受检测设备 本身光强度、光漂白及背景巧光的干扰；检测过程中，探针样品自身浓度，其所受的微环境(如测试样品均匀度、粘度、溢度)的改变都可能给实验结果造成偏差；而比率型荧光 探针有两个相关的发射信号，可避免仪器和环境因素造成的检测误差，可表现出更好的灵 敏度和动态响应范围等。另外，目前设计和报道的一些用于ClO-荧光成像的探针，少有可 实现对生物系统中ClO-的实时定量荧光成像。因此，设计合成具有能够实时定量荧光成像、高灵敏度的比率型ClO-荧光探针，并将其应用于生命体中ClO-的实时定量荧光成像依然是ClO-探针研究工作的重心。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探针，该探针灵敏度高， 能够实现实时定量荧光成像。
本发明的目的之二是提供上述检测次氯酸根离子的比色/荧光探针的制备方法，该制备 工艺简单，合成路线短。
本发明的目的之三是提供上述检测次氯酸根离子的比色/荧光探针的应用，拓宽探针的 应用范围。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种检测次氯酸根离子的比色/荧光探 针，所述荧光探针命名为TPE-acylamide-Rh，对应的化学结构式如式I所示：
上述检测次氯酸根离子的比色/荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将1-(4-甲酸苯基)-1,2,2-三苯乙烯溶于氯化亚砜中，在60-80℃下加热搅拌4-8h后， 减压蒸馏除去氯化亚砜，冷却至室温后，在惰性气氛保护下，依次加入乙腈和三乙胺，最 后加入罗丹明B酰肼，在40-85℃下加热搅拌10-18h；1-(4-甲酸苯基)-1,2,2-三苯乙烯与罗丹明B酰肼的摩尔比为1:1.03；反应完毕后，将反应液进行萃取、合并有机相，最后 干燥得到粗产品，粗产品再通过硅胶柱色谱法纯化得到TPE-acylamide-Rh；所述罗丹明B 酰肼的结构式为
进一步的，反应完毕后，将反应液倒入去离子水中，再用二氯甲烷萃取三次。
优选的，柱色谱法纯化采用的洗脱剂为体积比30:1的二氯甲烷/甲醇溶液。
具体的合成路线如下：
本发明还提供上述荧光探针在检测次氯酸根离子含量中的应用。
本发明中四苯乙烯是具有聚集诱导发光机制(AIE)性质的分子，罗丹明的红光特性使 其成为优异的荧光基团，在两者相互耦合作用下，不仅可以在溶液状态下表现出比色/荧光 双通道响应，而且在聚集状态下，可获得比率型荧光探针。该荧光探针在溶液状态下可以 通过比色和荧光双通道校准；也可以在聚集状态下，通过双波长响应，排除干扰。本发明 将四苯乙烯作为荧光基团，修饰、调控罗丹明的不同位置，设计合成反应性ClO-荧光探针 TPE-acylamide-Rh。由于四苯乙烯的聚集诱导效应，该荧光探针在聚集状态下，表现出比率 型荧光探针性质，且识别位点均为罗丹明的酰胺结构，这种酰胺结构在ClO-强氧化性作用 下，发生分解反应，进而导致罗丹明“开环反应”，引起探针溶液的比色和荧光响应。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明以罗丹明酰胺基团为识别反应位点，设计合成了四苯乙烯耦合罗丹明类反应的 比率型ClO-比色/荧光双通道荧光探针TPE-acylamide-Rh，该探针表现出AIE性质，并且在 溶液状态下(50％乙醇-水体系中)，表现出比色/荧光双通道响应，在ClO-作用下，溶液颜 色发生“裸眼”可见的响应(由无色变成红色)；在365nm紫外灯激发下，发出橙黄色荧光；并且表现出较好的灵敏度(紫外吸收光谱最低检出限1.3μM；荧光光谱最低检出限2.5 μM)；在聚集状态下(60％乙醇-水体系中)，表现出比率型荧光特性，识别ClO-也具有良 好的灵敏度(荧光光谱最低检出限2.8μM)。因此，该探针在溶液状态和聚集状态下，对 ClO-识别性能表现出优良的选择性、抗离子干扰能力以及灵敏度，实现实时定量荧光成像。 另外，该探针在聚集状态形成纳米颗粒，容易细胞染色，有利于细胞成像应用。Hela细胞 成像研究表明TPE-acylamide-Rh表现出对细胞中ClO-优异的识别特性，因此，该探针成功 的应用于活细胞内ClO-荧光成像技术。该荧光探针的制备工艺简单、合成路线短。将该探 针应用于检测次氯酸根离子中，从而拓宽了探针的应用范围。
附图说明
图1是化合物TPE-acylamide-Rh的核磁氢谱图；
图2是化合物TPE-acylamide-Rh的质谱图；
图3是TPE-acylamide-Rh(2μM)在不同含水量的乙醇-水溶液中荧光峰值随含水量的变 化趋势图；
图4是TPE-acylamide-Rh(2μM)在不同含水量的乙醇-水溶液中的荧光发射谱图；
图5是TPE-acylamide-Rh(2μM)在不同含水量的乙醇-水溶液中对ClO-荧光光谱图；
图6是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下对不同检测物的紫外吸收光谱 图；
图7是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下对不同检测物和加入ClO-后的 紫外吸收光谱图；
图8是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下对不同检测物的荧光光谱图；
图9是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下对不同检测物和加入ClO-后的 荧光光谱图；
图10是TPE-acylamide-Rh(2μM)在60％乙醇-水体系下对不同检测物的荧光光谱图；
图11是TPE-acylamide-Rh(2μM)在60％乙醇-水体系下对不同检测物和加入ClO-后 的荧光光谱图；
图12是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下荧光滴定光谱图；
图13是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下荧光强度与ClO-浓度的线性 关系图；
图14是TPE-acylamide-Rh(2μM)在60％乙醇-水体系下荧光滴定光谱图；
图15是TPE-acylamide-Rh(2μM)在60％乙醇-水体系下荧光强度比值与ClO-浓度的 线性关系图；
图16是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下紫外吸收滴定光谱图；
图17是TPE-acylamide-Rh(2μM)在50％乙醇-水体系下紫外吸收强度与ClO-浓度的 线性关系图；
图18是TPE-acylamide-Rh的HeLa细胞毒性实验结果统计图；
图19是TPE-acylamide-Rh的HeLa细胞荧光成像图：(a)HeLa细胞在TPE-acylamide-Rh 明场中细胞成像图；(b)HeLa细胞在TPE-acylamide-Rh绿色通道中细胞成像图；(c)HeLa 细胞在TPE-acylamide-Rh和20μM ClO-红色通道中细胞成像图；(d)图b和图c叠加图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例中所用的原料和试剂，如无特殊说明，均为市售商品，纯度为分析纯及以 上。
实施例1：探针化合物TPE-acylamide-Rh的合成
称量1-(4-甲酸苯基)-1,2,2-三苯乙烯0.50g(1.33mmol)加入到5mL氯化亚砜溶液， 加热回流4h；反应完毕后，减压蒸馏蒸出氯化亚砜溶液。待温度降到室温，加入30mL乙腈溶液，再加入1mL三乙胺；最后称量罗丹明B酰肼0.62g(1.37mmol)加入反应液中， 氮气保护，加热回流，反应过夜。反应完毕后，反应液倒入水中，二氯甲烷萃取三次，合 并有机相，无水硫酸镁干燥，旋干得到粗产品，用二氯甲烷：甲醇体积比为30:1作为流动 相，过硅胶柱得到0.35g纯品，产率：31.4％，熔点：173-175℃。氢谱如图1所示，质谱 如图2所示，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.10(s,1H),7.84(d,J＝7.3Hz,1H),7.63–7.51 (m,2H),7.40(d,J＝8.1Hz,2H),7.19–7.05(m,10H),7.01–6.91(m,8H),6.55(d,J＝8.8Hz, 2H),6.35–6.25(m,4H),3.33–3.19(m,8H),1.06(t,J＝7.0Hz,12H).13C NMR(151MHz, Chloroform-d)δ156.87.,153.15,151.88,148.75,143.83,140.48,136.04,133.80,133.05, 131.24,131.22,131.18,128.91,128.10,128.02,127.63,127.60,127.52,126.34,126.12,126.04,123.75,123.47,123.26,110.08,107.89,106.26,97.95,65.84,55.37,44.32,12.67. MALDI-MS:m/z calcd for C55H50N4O3:815.0105,found:814.9627[M]+.
实施例2：探针TPE-acylamide-Rh的比率型荧光特性与AIE性质
探针TPE-acylamide-Rh是由四苯乙烯通过酰胺键与罗丹明B连接的具有AIE特性的 ClO-荧光探针。探针TPE-acylamide-Rh的识别位点是罗丹明酰胺结构，其在ClO-强氧化性 作用下，酰胺键被打断，罗丹明螺环发生“开环反应”，探针比色/荧光均发生变化。探针TPE-acylamide-Rh在聚集状态下，表现出四苯乙烯的荧光，在与ClO-反应后，探针的四苯乙烯的聚集诱导发光消失，显示出罗丹明结构的荧光，成为一种典型的比率型荧光探针。
探针TPE-acylamide-Rh由于具有“螺旋桨”结构的四苯乙烯基团，因此表现出典型的 聚集诱导发光性质(如图3和图4所示)。探针TPE-acylamide-Rh在乙醇-水体系下溶解性较好，溶液含水量在0～50％之间时，探针TPE-acylamide-Rh处于溶解状态，无荧光发射；当溶液含水量达到60％，TPE-acylamide-Rh出现纳米聚集(平均粒径为396nm)，在波长487nm处出现明显的荧光发射峰，其为典型的四苯乙烯荧光发射峰；溶液含水量在70％时，荧光强度达到最大值；然后，随着溶液含水量的增加，荧光强度逐渐下降。
实施例3：探针TPE-acylamide-Rh的溶剂配比选择
TPE-acylamide-Rh是一种反应性ClO-荧光探针，溶剂配比的选择影响着探针灵敏度。 测试在不同含水量的乙醇-水体系中加入ClO-的荧光强度来探究最佳溶剂配比，结果如图5 所示。TPE-acylamide-Rh溶液含水量在0％到50％之间，处于溶解状态，无荧光发射，在 ClO-作用下，583nm处出现荧光发射峰，且在含水量50％时发射峰强度最大，表明： TPE-acylamide-Rh在溶液状态下，对ClO-具有良好的灵敏度，在含水量50％的乙醇-水体系 下，对ClO-响应灵敏度最高。因此，TPE-acylamide-Rh在溶液状态下对ClO-识别的溶剂配 比选择50％乙醇-水体系。当溶液含水量达到60％时，探针处于纳米聚集状态，在583nm 和478nm处同时出现发射峰，表现出典型的比率型荧光特性，当含水量大于70％时，在583 nm处的荧光发射峰强度非常微弱，几乎对ClO-离子没有响应，因此可知，探针 TPE-acylamide-Rh在聚集态的溶剂配比最优条件为：60％乙醇-水体系。
实施例4：探针TPE-acylamide-Rh对ClO-识别的选择性和抗离子干扰能力
TPE-acylamide-Rh溶液的制备：TPE-acylamide-Rh的2.0×10-3mol L-1溶液是用色谱纯的 乙醇作为溶剂，称量计算量实施例1制备的探针加入到3mL容量瓶中，用乙醇定容，超声， 直至样品完全溶解，密封保存，以备使用。
ClO-以及干扰离子溶液的配制：用NO2 -、NO3 -、HCO3 -、ACO-、Br-、ClO4 -、SO4 2-、 S2-、H2O2、NO、ONOO-、DTBP和ClO-溶解于去离子水中，配制离子溶液。离子溶液浓 度为1.0×10- 2mol L-1，称量计算量的离子盐放入5mL容量瓶中，用去离子水定容到容量品 刻度线，摇晃、超声，使各个离子盐完全溶解，密封保存，以备使用。
如图6所示，探针TPE-acylamide-Rh在50％乙醇-水体系中处于溶液状态，除了在ClO-存在下溶液由无色变为红色，其他干扰离子都没有明显变化。同时，在其他离子存在下， 继续加入ClO-，如图7所示，探针TPE-acylamide-Rh表现出良好的抗离子干扰能力。同样， 探针TPE-acylamide-Rh在荧光光谱中也表现出优异的选择性与抗离子干扰能力(如图8-9 所示)。
探针TPE-acylamide-Rh在含水量60％乙醇-水体系中，表现出比率型荧光探针性质。探 针TPE-acylamide-Rh(2μM)的60％乙醇-水中，分别加入10倍当量的测试离子，由荧光 光谱强度研究探针的选择性。如图10所示，TPE-acylamide-Rh在60％乙醇-水体系中，由于探针处于聚集状态，加入测试离子之前，荧光光谱在487nm出现四苯乙烯的荧光发射峰，当加入测试离子后，只有加入ClO-荧光探针溶液中荧光发出橙红色荧光，荧光发射波长为583nm；其他离子溶液在487nm处的发射荧光强度仅有微小变化，表明探针 TPE-acylamide-Rh对于ClO-的识别具有较高的选择性。同时，在其他离子存在下，继续加 入ClO-，如图11所示，探针TPE-acylamide-Rh表现出较好的抗离子干扰能力。
实施例5：探针TPE-acylamide-Rh对ClO-荧光光谱滴定
探针TPE-acylamide-Rh在溶液状态下(50％乙醇-水)，荧光强度与ClO-浓度的变化趋 势如图12所示。TPE-acylamide-Rh空白溶液荧光较弱；加入ClO-后，荧光光谱在583nm处出现新的荧光发射峰，随着ClO-浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当ClO-浓度达到30μM，荧光强度增速放缓，ClO-浓度达到饱和状态。由图13可知，探针TPE-acylamide-Rh荧光强度在ClO-在0.5μM到30μM呈现出良好的线性关系。经过线性拟合，得到荧光强度与ClO-浓度关系为：y＝14680.71x+106666.31，R2＝0.993。由最低检出限公式LOD＝3σ/k可计算出 探针TPE-acylamide-Rh在50％乙醇-水体系中的最低检出限为：1.3μM。
探针TPE-acylamide-Rh在聚集状态下(60％乙醇-水)，荧光强度与ClO-浓度的变化趋 势如图14所示。TPE-acylamide-Rh空白溶液在365nm激发下，溶液产生很强的四苯乙烯 荧光发射峰(最大发射波长：476nm)，加入ClO-后，荧光光谱在583nm处出现新的荧光 发射峰，随着ClO-浓度的增加，476nm处荧光强度逐渐减小，583nm处荧光强度逐渐增强； 当ClO-浓度达到30μM两处荧光强度几乎不再变化。由图15可知，探针TPE-acylamide-Rh 在583nm和476nm处荧光强度比值在ClO-在0.5μM到30μM呈现出良好的线性关系。 经过线性拟合，得到I579nm/I485nm与ClO-浓度关系为：y＝0.08394x+0.16389，R2＝0.998。由最 低检出限公式LOD＝3σ/k计算可知探针TPE-acylamide-Rh在60％乙醇-水体系中的最低检出 限为：2.8μM。
实施例6：探针TPE-acylamide-Rh对ClO-紫外吸收光谱滴定
探针TPE-acylamide-Rh是基于罗丹明结构设计合成，因此，探针TPE-acylamide-Rh在 识别ClO-后，不仅会有荧光响应，同时也会引起比色响应。如图16所示，TPE-acylamide-Rh 空白溶液没有紫外吸收峰，溶液呈现出无色，加入ClO-后，在556nm处出现新的吸收峰紫 外吸收光谱，随着ClO-浓度的增加，吸收峰强度逐渐增强，当ClO-浓度达到30μM以后， 紫外吸收峰强度停止增加。如图17所示，探针TPE-acylamide-Rh紫外吸收强度在ClO-浓 度为2μM到7μM之间时呈现出良好的线性关系。经过线性拟合，得到紫外吸收光谱强度 与ClO-浓度关系为：y＝0.02688x-0.17201，R2＝0.978。由最低检出限公式LOD＝3σ/k可计算 出探针TPE-acylamide-Rh在50％乙醇-水体系中的最低检出限为：2.5μM。
实施例7：探针TPE-acylamide-Rh的细胞毒性研究
细胞培养：细胞成像的宫颈癌细胞(Hela细胞)购置于生物公司，Hela细胞培养过程： 将购买的Hela细胞转移至装有2mL的10％胎牛血清的DMEM培养液的培养皿中，将培养皿放入二氧化碳含量保持在5％、37℃恒温、无菌的培养箱中，培养24h，以备用于细胞 成像。
细胞毒性测试：将Hela细胞转移至96孔的含有100μL培养液的培养皿中，在二氧化碳含量5％、37℃恒温的环境中孵育24h，然后，用上述培养液配制100μL的0μM、5μM、 10μM、20μM和30μM浓度的探针溶液，分别放入有标记的96孔培养皿中，为了实验的 准确性，每个浓度的探针都做5组平行实验，继续培养24h。然后在每个实验孔内加入20μL 的MTT(mg/mL)，在培养4h。最后，加入100μL的二甲基亚砜溶液混合均匀后，最后 加入酶标仪，通过测定其在570nm处的紫外吸收强度来算出细胞存活率，进而反映出荧光 探针的毒性强弱。
探针TPE-acylamide-Rh经过Hela细胞毒性试验(MTT)结果如图18所示。Hela细胞在不同浓度(0μM、5μM、10μM、20μM和30μM)探针TPE-acylamide-Rh中孵育相同 时间，观察细胞存活率。细胞存活率随着TPE-acylamide-Rh浓度的增加而小幅降低，当探 针浓度达到30μM，细胞存活率95％以上。结果表明低浓度TPE-acylamide-Rh探针对细胞 毒性较小，适合用于细胞成像技术。
实施例8：探针TPE-acylamide-Rh的细胞成像
细胞成像主要用于检测外源性ClO-细胞成像实验。分两组用于细胞成像。第一组将Hela 细胞放入含有培养液的培养皿中培养24h，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤三次，然后将 20μL的荧光探针标准溶液加入到细胞培养液中，继续培养1h，最后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤三次，洗去细胞代谢物以及死亡的细胞，剩下的细胞用于细胞成像；第二组将Hela细胞放入含有培养液的培养皿中培养24h，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤三次，然 后将20μL荧光探针标准溶液加入到细胞培养液中，继续培养1h，加入10μL的ClO-标准 溶液，继续培养1h，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤三次，洗去细胞代谢物以及死亡的细 胞，剩下的细胞用于细胞成像。
如图19所示，探针TPE-Acylamide-Rh溶液加入到Hela细胞培养液中培养后，将细胞 转移至共聚焦显微镜上，用405nm紫外激发，通过观察蓝色通道(425nm-475nm)可以 得到探针TPE-Acylamide-Rh容易进入细胞内，并且发出微弱的黄绿色荧光(如图19-b所示)。当加入20μM ClO-继续培养后，再次放入共聚焦显微镜下拍照观察，发现细胞发出红色荧光(如图19-c所示)。通过探针TPE-Acylamide-Rh细胞成像实验表明，探针在细胞中对 ClO-识别效果(细胞成像中发出红色荧光)要比在60％乙醇-水体系中(溶液发出橙黄色荧 光)更加明显。这是因为共聚焦显微镜具有双通道(蓝光通道和红光通道)，其中蓝光通 道激发波长为405nm，红光通道(570-620nm)的激发波长561nm，细胞成像实验中，探 针与离子反应后所得到的图片是在在561nm激发下通过红色通道收集的，因此要比荧光滴 定溶液显示的荧光要强。结果表明探针TPE-Acylamide-Rh在细胞内可以灵敏的检测ClO-。 因此，探针TPE-Acylamide-Rh能够实现对Hela活细胞内ClO-检测，并且可以实现比率型 细胞荧光成像。