一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针、制备方法及其应用 (Cross-bond energy transfer type Hg2+Fluorescent probe, preparation method and application thereof ) 是由 母晓玥 祁美蓉 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：一种跨键能量转移型Hg～(2+)荧光探针、制备方法及其应用,属于荧光探针技术领域。本发明公开的跨键能量转移型Hg～(2+)荧光探针,以有机胺为供体,以罗丹明B为受体,通过硫代双酰肼对Hg～(2+)的响应实现了荧光探针对溶液中Hg～(2+)的检测。该跨键能量转移型Hg～(2+)荧光探针的结构式如下所示,其可以用于检测水溶液中微量Hg～(2+)浓度,还可以在Hela细胞中痕量检测Hg～(2+)、制备检测纸检测溶液中Hg～(2+)方面得到应用。(Cross-bond energy transfer type Hg 2+ A fluorescent probe, a preparation method and application thereof belong to the technical field of fluorescent probes. The invention discloses a cross-bond energy transfer type Hg 2+ The fluorescent probe takes organic amine as a donor, rhodamine B as an acceptor and Hg is subjected to thiobis-hydrazide 2+ The response of the probe realizes that the fluorescent probe is used for detecting Hg in the solution 2+ Detection of (3). The cross-bond energy transfer type Hg 2+ The structural formula of the fluorescent probe is shown as follows, and the fluorescent probe can be used for detecting trace Hg in an aqueous solution 2+ The concentration of Hg in Hela cells can be detected in trace amount 2+ And preparing Hg in the detection paper detection solution 2+ The method is applied.)
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针、制备方法及其在检测水溶液中微量Hg2+浓度方面的应用。
背景技术
环境中重金属离子的污染对人类的健康造成了巨大威胁。其中汞离子(Hg2+)因其对人类等生物体的高毒性和在水生生态系统中的积累而被认为是最有害的金属离子之一。
可能。与传统的原子吸收光谱、原子荧光光谱和电感耦合等离子体质谱检测Hg2+的方法相比，荧光探针具有操作简单、选择性好、灵敏性高、响应快、对细胞损伤小等优点，近年来利用荧光探针检测Hg2+的方法得到了快速发展。到目前为止，已经有各种不可逆反应用于合成荧光化学剂量计检测Hg2+。然而，荧光化学剂量计对Hg2+的定量检测存在局限性，因为使用一个发射波段的荧光开启检测不能为Hg2+提供自校准的荧光信号。因此，比例型荧光化学剂量计被强烈推荐用于Hg2+的检测和定量，因为两个发射波段之间的比值可以允许自校准荧光信号，并修正荧光探针浓度。而合成具有选择性高、灵敏度高、荧光信号强、在水溶液中易于操作等优点于一体的Hg2+比例型荧光化学剂量计，具有很高的挑战性。
构建此类比例型荧光化学剂量计荧光探针的一个主要思路为：利用荧光团之间的能量传递过程来构造比率荧光探针，如荧光共振能量转移(FRET)型和跨键能量转移(TBET)型荧光探针。
荧光共振能量转移型荧光探针的供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，能量传递的效率受到诸多因素的影响，如供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迀偶极的相对取向、供体与受体之间的距离、受体部分的荧光量子产率等。因此构建此类荧光探针时，荧光团的选择受到较大限制。
与荧光共振能量转移型荧光探针结构类似，跨键能量转移型荧光探针分子中也有两个荧光团，能量从供体通过共轭键直接传递到受体，这类荧光探针对荧光团光谱重叠没有要求，且具有更高的能量转移效率。因而构建这类型的荧光探针时，荧光团的选择具有更大的灵活性。
综上所述，本发明以有机胺作为供体，罗丹明B作为受体，硫代双酰肼结构作为Hg2+的响应基团，构造了一系列跨键能量转移型Hg2+荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于提供一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针、制备方法及其在检测水溶液中微量Hg2+浓度方面的应用。
本发明公开了一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针，该荧光探针以有机胺为供体，以罗丹明B为受体，通过硫代双酰肼对Hg2+的响应实现了荧光探针对溶液中Hg2+的检测。
本发明所述的一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针，其结构式如下所示：
其中，Y的结构式如下所示：
其中R1、R2、R3、R4独立地选自氢、氟、氰基、C1～C6的烷基、C6～C20的芳基、含有1～5个杂原子数的C4～C20的杂芳基，所述的杂原子为N、O、S、Si中的一种或多种；m、n、x、y为1～3的整数。
作为优选，本发明所述的一种跨键能量转移型Hg2+荧光探针，其结构式如下所示：
本发明所述的Hg2+荧光探针的制备方法，其步骤如下：
S1：将3-羟基-N,N-二乙基苯胺和4-溴邻苯二甲酸酐混合，在丙酸溶液中反应20～30h，然后蒸馏除掉溶剂丙酸，得到对溴罗丹明B(p-Rho-Br)；其中，3-羟基-N,N-二乙基苯胺、4-溴邻苯二甲酸酐、丙酸的用量比例为1mmol：1mmol：(3～10)mL；
S2：将p-Rho-Br溶于乙醇，再加入浓度15～20mol/L水合肼，搅拌下加热至75～85℃回流反应2～4h，然后减压蒸馏除去溶剂乙醇，氧化铝层析柱纯化得到对溴罗丹明B酰肼(p-Rho-Br-NH2)；其中p-Rho-Br、水合肼、乙醇的用量比例为1mmol：3mL：(15～25)mL；中性氧化铝柱层析纯化过程中的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，体积比为(4～6)：1；
S3：将吩噻嗪、吩噁嗪、9,10-二氢-9,9-二甲基吖啶、9,9-二苯基-9,10-二氢吖啶、苯基酚嗪、1-萘氨基苯或N-苯基-2-萘胺和对溴碘苯在干燥的烧瓶中加入超干四氢呋喃溶液，于-78℃(液氮+丙酮)下，滴加正丁基锂锂化1～2h，再于-78℃下加入硼酸三甲酯，20～30℃下搅拌20～30h后加入饱和氯化铵溶液，继续搅拌2～4h，结束反应后分液，收集有机相后旋干，甲醇结晶得到供体Y)；其中，吩噻嗪、吩噁嗪、9,10-二氢-9,9-二甲基吖啶、9,9-二苯基-9,10-二氢吖啶、苯基酚嗪、1-萘氨基苯或N-苯基-2-萘胺、对溴碘苯、四氢呋喃、正丁基锂、硼酸三甲酯、氯化铵的用量比为1mmol：1mmol：(40-60)mL：1mmol：3mmol：(30-60)mL；
其中，供体Y的化合物D1-1和D4-1购买获得，其余化合物均由上述实验方案获得；
S4：将p-Rho-Br-NH2、供体Y、四丁基溴化铵(TBAB)、四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)和碳酸钾(K2CO3)混合，抽真空并充入氮气，加入甲苯和H2O，搅拌下加热到105～120℃回流反应8～12h，然后减压蒸馏除去甲苯，再用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液分液萃取，除去剩余的碳酸钾，同时将产物萃取到乙酸乙酯中；有机相乙酸乙酯用无水硫酸钠干燥，浓缩除去乙酸乙酯，再将除去乙酸乙酯后得到的残余物通过中性氧化铝层析柱纯化，从而得到对-Y-罗丹明B酰肼(p-Rho-Y-NH2)；其中，p-Rho-Br-NH2、供体Y、TBAB、Pd(PPh3)4、K2CO3、水和甲苯的用量比例为1mmol：1mmol：1mmol：0.03mmol：3mmol：(7～10)mL：(1.5～2)mL；中性氧化铝柱层析纯化的洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，体积比为1：(4～6)；
S5：将p-Rho-Y-NH2、异硫氰酸苯酯和三乙胺混合溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，并在氮气气氛下20～25℃搅拌4-8h，再经减压蒸馏除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺；除去溶剂后得到的残余物通过中性氧化铝层析柱纯化，从而得到黄色固体p-RSP-Y；其中，p-Rho-Y-NH2、异硫氰酸苯酯、三乙胺和N,N-二甲基甲酰胺的用量比例为1mmol：(2～6)mmol：0.05mmol：(5～15)mL；中性氧化铝柱层析纯化的洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，体积比为1：(4～5)；
其中，对溴罗丹明B(p-Rho-Br)的化学式为：
对溴罗丹明B酰肼(p-Rho-Br-NH2)的化学式为：
对-Y-罗丹明B酰肼(p-Rho-Y-NH2)的化学式为：
对-Y-罗丹明B酰肼-异硫氰酸苯酯(p-RSP-Y)的化学式为：
本发明所述的上述p-RSP-Y荧光探针可以用于检测水溶液中微量Hg2+浓度，具体步骤如下：
T1：p-RSP-Y荧光探针母液的配制：称取83.4mg p-RSP-Y荧光探针，溶解于DMSO中，在10mL容量瓶中用DMSO定容至刻度线，配制成1mM的荧光探针母液，4℃冰箱保存；
HgCl2待测液的配制：用去离子水将HgCl2配制成1mM的待测液，4℃冰箱保存；
T2：将T1中的荧光探针母液间接加入HgCl2待测液中，加入后溶液中荧光探针的浓度为10μM；相比于荧光探针加入前，在加入荧光探针后，待测水溶液在570nm处有一个吸收峰出现，而在276nm处的吸收峰减弱。计算570nm处与276nm处吸收峰强度的比值，即A570/A276，可以发现，HgCl2浓度与吸收峰强度的比值在0～5μM范围内具有良好的线性关系。
由于所述荧光探针不溶于HgCl2待测液，检测HgCl2待测液中HgCl2浓度时，需要将所述荧光探针溶解在与水互溶的有机溶剂中后再加入待测溶液中。所述与水互溶的有机溶剂为乙醇、二甲亚砜、四氢呋喃中的一种或多种的混合物。荧光探针溶液与待测液混合后的混合溶液中有机溶剂与水的体积比根据各个测试实际情况重新确定。
本发明还提出了上述跨键能量转移型Hg2+荧光探针在Hela细胞中检测痕量Hg2+方面的应用。
本发明前所述的上述跨键能量转移型Hg2+荧光探针在Hela细胞中痕量Hg2+的检测方法，以实施例1制备的探针为例进行以下测试，包括以下步骤：
R1：将HeLa细胞用10μM荧光探针溶液染色两小时，再用不同Hg2+浓度的溶液培养半小时；其中，10μM的荧光探针溶液由T1配制的1mM的探针溶液经高糖细胞培养基(DMEM)稀释得到。不同Hg2+浓度的溶液为由T1配制的1mM的HgCl2待测液由高糖细胞培养基(DMEM)稀释得到。
其中，上述Hela细胞采购于中科院上海细胞库，高糖培养基(DMEM)采购于Hyclone，培养前，HeLa细胞中无Hg2+干扰后续实验。
R2：采用激光扫描共聚焦显微镜对被染色的HeLa细胞拍摄荧光共聚焦显微镜图像，并根据荧光共聚焦显微图像探测细胞中有无Hg2+，实现对Hg2+的定性检测。
本发明还提出了上述跨键能量转移型Hg2+荧光探针在制备检测纸检测溶液中Hg2+方面的应用。
本发明所述的上述跨键能量转移型Hg2+荧光探针制备检测纸检测溶液中是否含Hg2+的方法，包括以下步骤：
D1：取1.0g聚乙烯醇PVA(分子量75000)、1.0g聚乙二醇PEG(分子量20000)、5g质量分数10％的聚丙烯酰胺(PAM，分子量400000～800000)水溶液溶于20mL水中，得到质量分数分别为3.7％PVA、3.7％PEG和18.5％PAM的混合溶液。
D2：将滤纸铺在培养皿上，涂覆步骤D1制备的混合溶液，55～65℃条件下烘干；
D3：将步骤D2获得的滤纸上涂覆p-RSP-Y(10μM，溶剂为无水乙醇)荧光探针溶液，55～65℃烘干；
在上述技术方案中，所述10μM p-RSP-Y荧光探针溶液的制备方法为：称取p-RSP-Y荧光探针，溶解于DMSO中，用10mL容量瓶定容至刻度线，配制成1mM的荧光探针母液；再取100μL、1mM的荧光探针母液，加入到10mL容量瓶中，用无水乙醇溶液定容至刻度线。
D4：用海绵蘸取含有Hg2+的溶液，与步骤D3烘干后的滤纸接触3～5秒，并在365nm的紫外灯激发下观察滤纸的荧光的变化，与加入其它金属离子待测溶液相比，蘸取含有Hg2+的溶液后，滤纸荧光变为红色。
在上述技术方案中Hg2+溶液的制备方法为：称取2.8g HgCl2固体，去离子水溶解后转移到10mL的容量瓶中，用去离子水定容至刻度线，得到1mM的HgCl2溶液；再取10μL、1mM的HgCl2溶液于10mL容量瓶中，加入3990μL去离子水，后用无水乙醇定容至刻度线，得到1μM的HgCl2溶液，溶液中无水乙醇与水的体积比为3:2。
在上述所有试验方案中，所用试剂均为分析纯。
附图说明
下面将结合附图及实例对本发明做进一步说明：
图1为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针在355nm光激发下在不同比例的THF-H2O混合溶液中的荧光光谱图；
图2为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针在355nm光激发下在不同pH的THF-H2O(v/v，1/1)混合溶液中的荧光光谱图；
图3为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针在355nm光激发下在THF-H2O(v/v，2/3)溶液中加入不同浓度Hg2+后混合溶液的荧光光谱图；
图4为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针在THF-H2O(v/v，2/3)溶液中加入不同浓度的Hg2+后混合液的紫外吸收光谱图；
图5为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针在THF-H2O(v/v，2/3)溶液中检测Hg2+时，Hg2+浓度与溶液紫外吸收光谱A570/A276的线性关系曲线；
图6为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针在355nm激发下在THF-H2O(v/v，2/3)溶液中加入同浓度的金属氯化物(Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+等)后溶液的荧光光谱图；
图7为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针对HeLa细胞进行染色再与Hg2+反应后的共聚焦显微镜图；
图8为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针制备检测纸的结构示意图；
图9为本发明实施例1制备得到的p-RSP-TPA荧光探针制备检测纸接触不同金属阳离子后的光学图像。
具体实施方式
实施例1：化合物1的合成
将3-羟基-N,N-二乙基苯胺(4.93g，21.8mmol)和4-溴邻苯二甲酸酐(7.2g，43.6mmol)混合于三口瓶，溶于150mL丙酸溶液中，150℃搅拌回流24h，反应结束后，常压蒸馏将反应体系中的丙酸溶液蒸干后得到p-Rho-Br(未提纯，直接用于下一步反应)。将上述得到的p-Rho-Br溶于250mL乙醇溶液中，向体系中加入80％(浓度为15.98mol/L)的水合肼溶液(2mL，4mmol)，在80℃下，加热搅拌、回流4h。减压蒸馏除去反应体系中的溶剂，除去溶剂后的残余物再用中性氧化铝层析柱分离纯化，展开剂为乙酸乙酯-石油醚(v/v＝1/4)，得到化合物p-Rho-Br-NH2，产率为17％，质谱分析确定的分子离子质量为：535.89(计算值为:534.16)。
1HNMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.82(d，J＝8.1Hz，1H)，7.60(d，J＝8.0Hz，1H)，7.27(s，1H)，6.49(d，J＝8.7Hz，2H)，6.45(s，2H)，6.35(d，J＝8.8Hz，2H)，3.63(s，2H)，3.38(q，J＝7.1Hz，8H)，1.21(t，J＝7.0Hz，12H).
将p-Rho-Br-NH2(0.534g，1mmol)、TPA-B(OH)2(0.289g，1mmol)、TBAB(0.322g，1mmol)、Pd(PPh3)4(35mg，0.03mmol)和K2CO3(0.414g，3mmol)混合，加入甲苯(7.36mL，1mmol)和H2O(1.5mL，0.08mmol)，在氮气气氛下，110℃回流反应8h。反应结束后，减压蒸馏除去溶液中的甲苯，再用乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，除去溶剂后的残余物再用中性氧化铝层析柱分离纯化，展开剂为乙酸乙酯-石油醚(v/v＝1/4)，得到化合物p-Rho-TPA-NH2，产率为：77％，质谱分析确定的分子离子质量为：699.84(计算值为:699.36)。
1HNMR(500MHz，Chloroform-d)δ7.99(d，J＝8.0Hz，1H)，7.73–7.66(m，2H)，7.49(dt，J＝9.9，5.0Hz，1H)，7.40(d，J＝8.4Hz，2H)，7.25(d，J＝7.7Hz，3H)，7.10(d，J＝7.9Hz，4H)，7.07–7.02(m，4H)，6.55(d，J＝8.8Hz，2H)，6.45(s，2H)，6.33(d，J＝9.1Hz，2H)，3.65(s，2H)，3.37(q，J＝7.1Hz，8H)，1.20(t，J＝7.0Hz，12H).
将p-Rho-TPA-NH2(174.3mg，0.25mmol)、异硫氰酸苯酯(135mg，1mmol)和三乙胺(1mL)加入10mLDMF溶液中，在氮气气氛下常温搅拌8h。反应结束后，减压蒸馏除去反应体系中的溶剂，残余物用中性氧化铝柱层析柱分离纯化，展开剂为乙酸乙酯-石油醚(1/4)，得到化合物1对三苯胺罗丹明异硫氰酸苯酯(p-RSP-TPA)，产率为：78％，质谱分析确定的分子离子质量为：832.59(计算值为:833.38)。
1HNMR(500MHz，Chloroform-d)δ8.07(d，J＝8.0Hz，1H)，7.82(d，J＝8.2Hz，1H)，7.57(s，1H)，7.46(d，J＝8.6Hz，3H)，7.27(d，J＝7.8Hz，3H)，7.21(t，J＝7.7Hz，2H)，7.14–7.05(m，12H)，6.96(s，1H)，6.69–6.58(m，2H)，6.50(d，J＝13.9Hz，2H)，6.34(s，2H)，3.41–3.33(m，8H)，1.19(t，J＝7.0Hz，12H)。
实施例2：化合物2的合成。
按照上述合成路线，供体D2-1的合成方法为：在干燥的100mL烧瓶中加入对溴碘苯(2.83g,10mmol)、吩噻嗪(1.99g,10mmol)，超干四氢呋喃40mL，于-78℃(液氮+丙酮)下，滴加正丁基锂(1当量)锂化1-2h，于-78℃加入硼酸三甲酯(3当量)，室温20-30℃下搅拌24h后加入饱和氯化铵溶液，分液后保留有机相，除去有机相后得到的残余物用甲醇结晶得到D2-1，无其他处理直接投入下一步。
按照上述合成路线，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物2。产率55％。质谱分析确定的分子离子质量为：831.11(计算值为:831.37)。理论元素含量：C54H53N6O2S2，C,73.52；H,6.06；N,9.53；O,3.63；S,7.27，实测元素含量C,73.32；H,6.10；N,9.43；O,3.33；S,7.47。
实施例3：化合物3的合成。
按照上述合成路线，供体D3-1的合成步骤和D2-1的合成步骤相同，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物3。产率64％。质谱分析确定的分子离子质量为：865.39(计算值为:866.12)。理论元素含量：C54H53N6O3S，C,74.89；H,6.17；N,9.70；O,5.54；S,3.70实测元素含量C,73.62；H,6.10；N,9.43；O,3.40；S,7.40。
实施例4：化合物4的合成。
供体D4-1购买获得，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物4。产率64％。质谱分析确定的分子离子质量为：831.40(计算值为:832.36)。理论元素含量：C54H53N6O2S，C,76.29；H,6.28；N,9.89；O,3.76；S,3.77实测元素含量C,76.62；H,6.10；N,9.63；O,3.40；S,3.56。
实施例5：化合物5的合成。
按照上述合成路线，供体D5-1的合成步骤和D2-1的合成步骤相同，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物5。产率54％。质谱分析确定的分子离子质量为：891.44(计算值为:892.20)。理论元素含量：C57H59N6O2S，C,76.73；H,6.67；N,9.42；O,3.59；S,3.59实测元素含量C,76.62；H,6.50；N,9.43；O,3.40；S,7.40。
实施例6：化合物6的合成。
按照上述合成路线，供体D6-1的合成步骤和D2-1的合成步骤相同，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物6。产率63％。质谱分析确定的分子离子质量为：923.40(计算值为:924.18)。理论元素含量：C59H53N7O2S，C,76.68；H,5.78；N,10.61；O,3.46；S,3.47，实测元素含量：C,76.30；H,5.88；N,10.21；O,3.66；S,3.30。
实施例7：化合物7的合成。
按照上述合成路线，供体D7-1的合成步骤和D2-1的合成步骤相同，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物7。产率43％。质谱分析确定的分子离子质量为：884.39(计算值为:885.14)。理论元素含量：C57H52N6O2S，C,77.35；H,5.92；N,9.49；O,3.62；S,3.62实测元素含量：C,77.33；H,5.50N,9.20；O,3.33；S,3.15
实施例8：化合物8的合成。
按照上述合成路线，供体D8-1的合成步骤和D2-1的合成步骤相同，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物8。产率43％。质谱分析确定的分子离子质量为：884.39(计算值为:885.14)。理论元素含量：C57H52N6O2S，C,77.35；H,5.92；N,9.49；O,3.62；S,3.62实测元素含量：C,77.52；H,5.10N,9.45；O,3.48；S,3.66。
实施例9：化合物9的合成。
按照上述合成路线，供体D9-1的合成步骤和D2-1的合成步骤相同，依照化合物1的合成，步骤相同，合成得到化合物9。产率63％。质谱分析确定的分子离子质量为：998.43(计算值为:999.29。理论元素含量：C66H58N6O2S，C,79.33；H,5.85；N,8.41；O,3.20；S,3.21实测元素含量：C,77.23；H,5.30N,9.35；O,3.55；S,3.52。
实施例10：
以化合物1为例，测得荧光探针p-RSP-TPA的一系列性质。
荧光探针母液的配制：称取83.4mg实施例1制备的荧光探针，溶解于DMSO中，用10mL容量瓶定容至刻度线，配制成1mM的荧光探针母液，4℃冰箱保存。
金属离子待测液的配制：用去离子水将各个金属氯化盐配制成1mM的待测液，4℃冰箱保存。上述金属离子包括：Zn2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Cu2+、Fe3+Mg2+、Na+、K+、Mn2+、Pb2+、Ag+、Hg2 +。
所有测试均在室温下进行。
取100μL上述配制的1mM的p-RSP-TPA溶液于10mL容量瓶中，再分别用移液管量取9mL、8mL、7mL、6mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1mL去离子水分别放入9个10mL容量瓶中，溶液混合均匀后用THF溶液定容至刻度线，得到含水量(水/四氢呋喃，v/v)为90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％的10μM的p-RSP-TPA荧光探针溶液。然后进行荧光光谱测试，激发波长为355nm，狭缝宽度为5nm。结果见图1，溶液中水含量为0％-60％时荧光强度比较弱，并且随着水含量的增加，发射峰由485nm逐渐红移至515nm。在水含量大于60％时，荧光强度增加，并且在水含量为70％时在475nm处达到最大值，光谱由515nm蓝移至475nm。之后随着水含量的增加至80％，荧光强度逐渐减弱，光谱继续蓝移。水含量增加到90％时，有两个发射峰，分别在460nm和595nm。选择含水量60％作为测试条件。
实施例11：
将1mM的p-RSP-TPA溶液用四氢呋喃稀释至20μM，取稀释后的20μM的p-RSP-TPA溶液1mL于2mL的容量瓶中，分别加入pH为1-6的盐酸溶液，去离子水，
和pH为8-14的NaOH溶液定容至刻度线，混合后的荧光探针溶液浓度为10μM，混合溶液中四氢呋喃和水的体积比为1：1。将上述溶液进行荧光光谱测试，激发波长为355nm，狭缝宽度为5nm。结果见图2，pH为2-10区间，对的荧光基本无影响。当pH大于10，荧光逐渐猝灭。当pH＝12时，基本无荧光。荧光探针在酸性到弱碱性条件下有荧光发射，碱性较强时荧光猝灭。选择在pH为中性的水与有机溶剂作为共同的反应溶液。
实施例12：
将1mM的p-RSP-TPA溶液用四氢呋喃稀释至25μM，取800μL稀释后的p-RSP-TPA溶液于2mL容量瓶中，加入不同浓度的Hg2+溶液定容至刻度线，得到浓度为10μM的荧光探针和Hg2 +浓度分别为12μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM的混合溶液。进行荧光光谱测试，激发波长355nm，狭缝宽度5nm。结果见图3，随着Hg2+浓度的增加，515nm处的荧光强度逐渐减弱并逐渐消失，逐渐蓝移。同时，580nm处有荧光峰出现，逐渐红移至595nm，当Hg2+浓度达到12μM时，595nm处的荧光强度达到最大值。
实施例13：
将1mM的p-RSP-TPA溶液用四氢呋喃稀释至25μM，取800μL稀释后的p-RSP-TPA溶液于2mL容量瓶中，加入不同浓度的Hg2+溶液定容至刻度线，得到浓度为10μM的荧光探针和Hg2 +浓度分别为12μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM的混合溶液。进行紫外吸收光谱测试。结果见图4，没加入Hg2+时，溶液在570nm处几乎无吸收峰，当加入Hg2+后，溶在570nm处的吸收峰逐渐增强，并且Hg2+浓度为12μM时达到最大值。计算570nm处与276nm处吸收强度的比值，即A570/A276。结果见图5，HgCl2浓度在0-5μM范围内具有良好的线性关系。
实施例14：
将1mM的p-RSP-TPA溶液用四氢呋喃稀释至25μM，1mM的各金属阳离子溶液用去离子水分别稀释至167μM，取800μL稀释后的25μM的荧光探针溶液于2mL容量瓶中，加入上述稀释后的各种167μM的金属阳离子溶液于2mL的容量瓶中，至刻度线，即得到荧光探针浓度为10μM，金属阳离子浓度为100μM的混合待测液，待测液中四氢呋喃与水的体积比为2/3。进行荧光光谱测试，激发波长355nm，狭缝宽度5nm。上述金属阳离子溶液分别为氯化镁、氯化钠、氯化钾、氯化铝、氯化铁、氯化锰、氯化汞、氯化锌、氯化镍、氯化汞、氯化钴、硝酸银溶液。结果见图6，只有在加入Hg2+后，在595nm处才有发射峰。说明荧光探针p-RSP-TPA能选择性识别金属Hg2+。
实施例15：
细胞生物成像测试。在5％CO2及37℃条件下，将HeLa细胞在含10％胎牛血清和1％双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM最低必需培养基中培养30min。使用激光扫描共聚焦显微镜(LeicaDMI8)对HeLa细胞进行比例成像。蓝色通道为450～490nm，红色通道为570～610nm，激发波长为405nm。在成像之前，用HBSS缓冲溶液洗涤细胞三次。比例图像使用图像分析程序ImageJ处理而得。使用共聚焦激光扫描显微镜可以在HeLa细胞中进行比例型Hg2+的成像。在不存在Hg2+的情况下，用p-RSP-TPA(10μM)染色2h的HeLa细胞在蓝色通道(450～490nm)中显示出荧光发射，而在红色通道(570～610nm)中只显示出微弱荧光，这表明细胞内的无Hg2+。进一步将10μM和50μM的Hg2+分别加入培养基中反应30min后，可以观察到蓝色通道中的荧光强度减弱，而红色通道中的荧光明显增强，比例图像则由绿色变为橙色，这表明随着Hg2+浓度的不断加增加，荧光发射会发生相应的变化，发射不断红移，如图7所示。具体样品成分和荧光强度对比如表1：
表1：样品成分和荧光强度对照
结果证实，p-RSP-TPA可以作为一种效果良好的比例计量型成像剂应用于生物Hg2+检测。
实施例16：
取1.0g取1.0g聚乙烯醇PVA(分子量75000)、1.0g聚乙二醇PEG(分子量20000)、5g质量分数10％的聚丙烯酰胺(PAM，分子量400000～800000)水溶液溶于20mL水中，95℃加热8h，得到质量分数分别为3.7％PVA、3.7％PEG和18.5％PAM的混合溶液。将上述混合液涂覆到滤纸上，60℃烘干滤纸。再用10μM的p-RSP-TPA(溶剂为乙醇)溶液涂覆上述滤纸，60℃烘干。得到含有p-RSP-TPA荧光探针试剂的检测纸。所述检测纸的结构示意图见图8，从上到下分别为荧光探针染料层、聚乙二醇/聚乙烯醇/聚丙烯酰胺层、滤纸基底层。
采用海绵蘸取的方法将各种金属阳离子溶液(C2H5OH/H2O＝3/2，100μM)蘸涂到制备好的检测纸材料上，实现荧光探针材料对金属离子的检测；在365nm的UV灯激发下观察检测纸上与金属阳离子接触区域的荧光变化。该材料遇Hg2+离子后，会在365nm紫外灯照射下发出红色荧光。而遇到其他金属阳离子，在紫外灯照射下荧光没有变化。结果见图9，第一排从左到右依次为蘸取了含有乙醇/水体积比为3/2的金属阳离子溶液后，在紫外灯下的效果图：Zn2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Cu2+、Fe3+，第二排依次为蘸取Mg2+、Na+、K+、Mn2+、Pb2+、Ag+的金属阳离子后的效果图，第三排为蘸取了含有乙醇/水体积比为3/2的Hg2+后的效果图。第一、二排在紫外灯下与第三排相比，蘸取了含有Hg2+溶液的检测纸发出红色荧光。而第一排和第二排无明显荧光变化。结果证明，p-RSP-TPA检测纸材料可以应用于快速检测溶液中是否含有Hg2+。
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