一种姜多糖及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种姜多糖及其制备方法与应用 (Ginger polysaccharide and preparation method and application thereof ) 是由 王一涛 王胜鹏 郝薇 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种姜多糖及其制备方法与应用,属于中药提取物技术领域。该方法包括以下步骤：姜根茎经干燥、粉碎,乙醇回流脱脂,加水提取,加入乙醇醇沉,离心得到粗多糖。进而可采用超滤得到纯化姜多糖。该姜多糖的制备方法简单、易操作、成本低,可实现产业化,能维持溃疡性结肠炎小鼠的体重、降低疾病活动指数、增加结肠长度、降低结肠组织炎症因子水平,具有缓解结肠炎的作用,可制备成食品或治疗结肠炎的药物。(The invention discloses ginger polysaccharide and a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of traditional Chinese medicine extracts. The method comprises the following steps: drying and crushing ginger rhizome, refluxing and degreasing with ethanol, adding water for extraction, adding ethanol for alcohol precipitation, and centrifuging to obtain crude polysaccharide. Further, ultrafiltration can be adopted to obtain purified ginger polysaccharide. The preparation method of the ginger polysaccharide is simple, easy to operate and low in cost, can realize industrialization, can maintain the body weight of an ulcerative colitis mouse, reduce disease activity index, increase colon length and reduce colon tissue inflammatory factor level, has the function of relieving colitis, and can be prepared into food or medicaments for treating colitis.)
技术领域
本发明涉及中药提取物技术领域，具体而言，涉及一种姜多糖及其制备方法与应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，缩写作UC)，是一种病变在结肠与直肠，有发炎与溃疡的消化道慢性疾病。其发作时主要症状包括腹痛、伴有血便的腹泻和体重减轻。溃疡性结肠炎的病因并不明确，与其相关的致病理论有自体免疫性疾病、遗传学、肠道菌群的改变，以及环境因素。当前用于溃疡性结肠炎的常规制剂，包括氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫调节剂和单克隆抗体，但这些经常具有副作用和不良的临床疗效。
姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根茎。其新鲜根茎为生姜，《神农本草经》言其“归五脏，除风邪寒热，伤寒头痛鼻塞，咳逆上气；止呕吐，去痰下气”，具解表散寒、止呕解毒之功；而其干燥根茎为干姜，具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮的功效，用于脘腹冷痛、呕吐泄泻、肢冷脉微、寒饮喘咳。生姜和干姜是历代名家常用的重要中药，如四逆汤、干姜附子汤、黄连汤、保元汤等经典名方均含有干姜或生姜。姜中含有大量的挥发油、姜辣素(姜酚、姜酮类等)、二苯基庚烷、碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物元素。然而，目前对于姜的研究主要集中在挥发油及姜辣素类成分上，其它成分如姜多糖的研究鲜有报道。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种姜多糖的制备方法，该方法简单，易操作，成本低，可有效地从姜(生姜或干姜)中提取出姜多糖。
本发明的目的之二在于提供一种由上述制备方法制备而得的姜多糖。
本发明的目的之三在于提供一种上述姜多糖的应用，例如用于制备食品或药物。
本发明的目的之四在于提供一种原料含有上述姜多糖的食品。
本发明的目的之五在于提供一种原料含有上述姜多糖的治疗结肠炎的药物。
本发明可这样实现：
第一方面，本发明提供一种姜多糖的制备方法，其包括以下步骤：用水提取姜根茎，第一次固液分离，收集液相进行醇沉，收集沉淀。
在可选的实施方式中，水提取于70-100℃条件下进行1-3h。
在可选的实施方式中，水提取过程中，姜根茎与水的料液比为1:5-40。
在可选的实施方式中，水提取之前，还包括对姜进行脱脂处理。
在可选的实施方式中，脱脂处理是将姜根茎与乙醇水溶液进行回流脱脂。
在可选的实施方式中，乙醇水溶液中乙醇的浓度为70-100vt％。
在可选的实施方式中，姜根茎经干燥和粉碎后再进行脱脂处理。
在可选的实施方式中，当使用的原材料为新鲜的姜根茎时，先将姜根茎置于45-60℃烘箱中干燥1-5天后再进行粉碎。
在可选的实施方式中，将液相浓缩后再进行醇沉。
在可选的实施方式中，浓缩后的浓缩物的体积为液相的5-40vt％。
在可选的实施方式中，醇沉过程中，醇的用量为浓缩物体积的3-6倍。
在可选的实施方式中，第二次固液分离是于2000-4500g条件下离心5-60min。
在可选的实施方式中，固液分离前，还包括将醇沉后的物质静置30min-12h。
在可选的实施方式中，还包括将第二次固液分离得到的沉淀进行纯化，得到纯化的姜多糖。
在可选的实施方式中，纯化采用超滤方式进行，超滤得到的截留液为纯化的姜多糖。
在可选的实施方式中，超滤是于500-3500g条件下离心5-90min。
在可选的实施方式中，超滤所用的超滤离心管的截留分子量＞3kDa。
第二方面，本发明提供一种姜多糖，经前述实施方式任一项的制备方法制备而得。
在可选的实施方式中，姜多糖的重均分子量为0.1-5.0×106Da。
在可选的实施方式中，姜多糖的多分散系数为0.8-4.0。
在可选的实施方式中，姜多糖的粒径为30.0-60.0nm。
第三方面，本发明提供如前述实施方式的姜多糖的应用，姜多糖用于制备食品或治疗结肠炎的药物。
在可选的实施方式中，姜多糖用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
第四方面，本发明提供一种食品，其原料包括前述实施方式的姜多糖。
第五方面，本发明提供一种治疗结肠炎的药物，其原料包括前述实施方式的姜多糖。
本申请的有益效果包括：
本申请提供的姜多糖的制备方法简单，易操作，成本低，可有效地从姜根茎中提取出姜多糖。制得的姜多糖至少具有缓解溃疡性结肠炎的作用，能维持溃疡性结肠炎小鼠的体重、降低疾病活动指数、增加结肠长度、降低结肠组织炎症因子水平，为其在制备食品或治疗结肠炎的药物中的应用提供了科学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例4中姜多糖的高效凝胶色谱联用多角度激光散射和示差折光仪(HPSEC-MALLS-RID)图谱；
图2为实施例5中小鼠造模及给药时间示意图；
图3为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠体重的影响结果图，其中，****表示p<0.0001，##表示p<0.01；
图4为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠疾病指数值(DAI)的影响结果图，#p表示<0.05，####表示p<0.0001；
图5为实施例5中不同浓度姜多糖对小鼠结肠长度的影响结果图，****表示p<0.0001，###表示p<0.001；
图6为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠结肠组织病理变化的影响(苏木精-伊红染色，×200)；
图7为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠结肠组织病理变化的影响(天狼猩红染色，×200)；
图8为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠结肠组织TNF-α含量的影响结果图，*表示p<0.05，##表示p<0.01；
图9为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠结肠组织IL-1β含量的影响结果图，**表示p<0.01，##表示p<0.01；
图10为实施例5中不同浓度姜多糖对UC小鼠结肠组织IL-6含量的影响结果图，*表示p<0.05，#表示p<0.05。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的姜多糖及其制备方法与应用进行具体说明。
本申请提出一种姜多糖的制备方法，其包括以下步骤：用水提取姜根茎，第一次固液分离，收集液相进行醇沉，收集沉淀。此处的“姜”可以为生姜(新鲜的姜)或干姜。
其中，水提取可以于70-100℃条件下进行1-3h。具体的，水提取的温度可以为70℃、75℃、85℃、90℃或100℃，优选100℃(也即可理解为沸水提取)，也可以为70-100℃范围内的其它任意值。水提取的时间可以为1h、1.5h、2h、2.5h或3h等，也可以为1-3h范围内的其它任意值。
上述水提取过程中，姜根茎与水的料液比可以为1:5-40，如1:5、1:10、1:20、1:25、1:35或1:40等，也可以为1:5-40范围内的其它任意值。
在优选的实施方式中，水提取是于100℃的条件下进行2h，姜根茎与水的料液比为1:20。
在可选的实施方式中，水提取之前，还包括对姜根茎进行脱脂处理。可参考地，脱脂处理可以是将姜根茎与乙醇水溶液进行回流脱脂。其中，乙醇水溶液中乙醇的浓度可以为70-100vt％，如75vt％、80vt％、85vt％、90vt％、95vt％或100vt％等，也可以为70-100vt％范围内的其它任意值。优选地，乙醇水溶液中乙醇的浓度可以为80vt％，上述优选的浓度范围内能够将姜根茎原料中的脂溶性小分子物质充分提取出来。
较佳地，姜根茎先经干燥和粉碎后再进行脱脂处理，粉碎可提高原料与提取剂的接触面积，从而提高功效成分的溶出率。
在可选的实施方式中，醇沉所用的醇优选为乙醇。具体操作时，可以将液相浓缩后再进行醇沉。浓缩可以是将液相浓缩至20％体积左右(如5-40vt％)，得到浓缩物。可参考地，醇沉过程中，醇的用量可以为浓缩物体积的3-6倍，如3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或6倍等，优选4倍。
随后，将醇沉后的物质静置30min-12h，如30min、1h、100min、2h、5h、8h、10h或12h，优选12h。
进一步地，静置后进行第二次固液分离。
在可选的实施方式中，第二次固液分离可以于2000-4500g(如2000g、3000g或4500g，优选4000g)的条件下离心5-60min(如5min、10min、20min、30min、40min、50min或60min，优选30min)。
上述第二次固液分离后所得的沉淀为姜粗多糖。
较佳地，还可将上述沉淀加水复溶，冷冻干燥，获得易保存的姜粗多糖。
进一步地，对姜粗多糖进行纯化，也即将第二次固液分离得到的沉淀进行纯化，从而得到纯化的姜多糖。
在可选的实施方式中，纯化可采用超滤方式进行，超滤得到的截留液为纯化的姜多糖。
可参考地，超滤可以于500-3500g(如500g、2500g、3000g或3500g等，优选2500g)条件下离心5-90min(如5min、10min、20min、50min、70min或90min等，优选30min)。
超滤所用的超滤离心管的截留分子量＞3kDa。
具体的，上述纯化过程可参照：将姜粗多糖加去离子水配成浓度为1-20mg/mL的溶液，转移入超滤离心管(截留分子量：>3kDa,Millipore,Billerica,MA,USA)，500-3500g离心5-90min，弃滤液，多次补水离心，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，直至滤液中基本无糖检出，截留液冷冻干燥，得到纯化后的姜多糖(以GP表示)。
值得说明的是，本申请中上述纯化步骤也不排除其他现有的常规纯化方式，在此不做过多赘述。
相应地，本申请还提供由上述制备方法制备而得的姜多糖。
采用高效凝胶色谱联用多角度激光散射和示差折光仪法分析，所得的姜多糖的重均分子量约为0.1-5.0×106Da，姜多糖的多分散系数为0.8-4.0，姜多糖的粒径为30.0-60.0nm。在某些具体实施方式中，所得的姜多糖的重均分子量约为1.217×106Da，多分散系数约为1.81，粒径约为44.6nm。
此外，本申请还提供了上述姜多糖的应用，例如用于制备食品(如功能性食品等)或治疗结肠炎的药物。
在优选的实施方式中，姜多糖用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
进一步地，本申请还提供一种食品，其原料包括上述姜多糖。可参考地，上述食品可包括乳与乳制品、脂肪制品、冷冻饮品、粮食制品、焙烤食品、肉制品、蛋制品、营养食品、功能性食品或饮料类等，此外，也不排除其它类型的食品。
本申请还提供一种治疗结肠炎(尤其是治疗溃疡性结肠炎)的药物，其原料包括上述姜多糖。以上述姜多糖作为药物原料，可使药物具有安全、有确定的作用和较少的不良反应的优势。
该姜多糖具有良好的抗炎作用和免疫调节活性，可缓解和治疗溃疡性结肠炎的作用，能维持溃疡性结肠炎小鼠的体重、降低疾病活动指数、增加结肠长度、降低结肠组织的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)含量。上述姜多糖对溃疡性结肠炎的影响可能与炎症细胞因子、肠道菌群和免疫系统的调节以及对结肠溃疡表面的粘附有关。此外，姜多糖作为药物载体具有良好的控释效果、高亲和力和可生物降解性。
本申请提供的姜多糖可通过调节免疫细胞水平，干扰信号传导途径，调节炎症性细胞因子的分泌和肠道菌群的丰度以及保护肠粘膜的免疫屏障来缓解溃疡性结肠炎，还可以与其他药物结合进行综合治疗。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种干姜多糖的制备方法：
(1)干姜根茎干燥、打粉，用乙醇浓度为80vt％的乙醇水溶液回流脱脂，随后加沸水使得料液比为1:20，提取2小时，减压浓缩至20％体积。
(2)于减压浓缩后的浓缩物中加入4倍体积的乙醇进行沉淀，静置12h，4000g离心30min，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖。
(3)将上述粗多糖加去离子水配成浓度为10mg/mL的溶液，转入超滤离心管(截留分子量：>3kDa,Millipore,Billerica,MA,USA)，2500g离心30min，弃滤液，多次补水离心，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，直至滤液中基本无糖检出，截留液冷冻干燥，得到纯化后的干姜多糖(GP)。
实施例2
本实施例提供一种干姜多糖的制备方法：
(1)干姜根茎干燥、打粉，用乙醇浓度为70vt％的乙醇水溶液回流脱脂，随后加水使得料液比为1:5，70℃提取3小时，减压浓缩至5％体积。
(2)于减压浓缩后的浓缩物中加入3倍体积的乙醇进行沉淀，静置30min，4500g离心5min，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖。
(3)将上述粗多糖加去离子水配成浓度为1mg/mL的溶液，转入超滤离心管(截留分子量：>3kDa,Millipore,Billerica,MA,USA)，3500g离心5min，弃滤液，多次补水离心，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，直至滤液中基本无糖检出，截留液冷冻干燥，得到纯化后的干姜多糖(GP)。
实施例3
本实施例提供一种生姜多糖的制备方法：
(1)生姜根茎干燥、打粉，用乙醇浓度为100vt％的乙醇水溶液回流脱脂，随后加使得料液比为1:40，98℃提取1小时，减压浓缩至40％体积。
(2)于减压浓缩后的浓缩物中加入6倍体积的乙醇进行沉淀，静置6h，2000g离心60min，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖。
(3)将上述粗多糖加去离子水配成浓度为20mg/mL的溶液，转入超滤离心管(截留分子量：>3kDa,Millipore,Billerica,MA,USA)，500g离心90min，弃滤液，多次补水离心，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，直至滤液中基本无糖检出，截留液冷冻干燥，得到纯化后的生姜多糖(GP)。
实施例4
干姜多糖的分子参数及构象分析
采用高效凝胶排阻色谱-多角度激光光散射法测定实施例1制得的干姜多糖的分子参数以及在溶液中的链构象，称取约3mg干姜多糖，溶解于1.0mL 0.9％(w/v)的氯化钠水溶液中，HPLC-MALLS-RID-DAD检测条件：流动相为0.9％(w/v)的氯化钠水溶液；色谱柱柱温35℃；流速0.5mL/min；色谱柱Shodex OHpak SB-806M HQ(300mm×8.0mm,i.d.)凝胶柱串联Shodex OHpak SB-G 6B(50mm×6mm)凝胶柱；进样量100μL，并联用DAD检测样品UV吸收。
其结果如图1所示：干姜多糖重均分子量Mw、多分散系数Mw/Mn和粒径分别为1.217×106Da，1.81和44.6nm，有紫外吸收，说明含糖蛋白。
实施例5
姜多糖对溃疡性结肠炎的治疗作用
(1)动物
25只雄性SPF级C57BL/6J小鼠，体重17～24g，由广东省医学实验动物中心提供。
(2)分组及造模
动物被随机分为5组，对照组、模型组、阳性对照组、干姜多糖低剂量组、干姜多糖高剂量组，每组5只。将所有小鼠适应性饲养一周后开始试验，从第0天开始，对照组小鼠饮用蒸馏水，其余各组均自由饮用3％硫酸葡聚糖钠(DSS)溶液10天诱导溃疡性结肠炎模型，分别于第1、3、5、7、9天给药(如图2所示)。干姜多糖各个剂量组分别按照100和200mg/kg剂量灌胃，阳性对照组剂量为100mg/kg的美沙拉嗪溶液，空白对照组与模型组分别予以相应体积的蒸馏水灌胃。上述姜多糖为实施例1制备得到的干姜多糖。
(3)小鼠体重和疾病活动指数(disease activity index，DAI)评价
实验期间，每天观察记录各组小鼠体重、粪便性状及便血情况，进行小鼠DAI评分，评分标准为：体质量下降百分比、粪便性质和大便出血情况。
从体重结果图可以看出(如图3所示)，从第6天开始，小鼠体重开始有下降，第10天模型组体重已显著低于空白组(p<0.0001)，而高剂量干姜多糖组小鼠的体重较模型组有明显改善(p<0.01)。
从图4的DAI结果来看，与模型组比较，干姜多糖给药组显著降低(p<0.05，p<0.0001)，并呈剂量依赖性。
(4)小鼠结肠长度测定
处死小鼠后将小鼠解剖，将整个结肠自盲肠到肛门段取出，预冷的PBS溶液冲洗结肠，无张力状态下拉展平铺，测量各组小鼠结肠长度。
其结果如图5所示：与空白组相比，模型组小鼠结肠长度显著缩短(p<0.0001)；与模型组相比，干姜多糖高剂量组小鼠结肠长度显著变长(p<0.001)。
(5)小鼠结肠组织病理变化
各组小鼠取靠近直肠的结肠组织，于4％多聚甲醛中固定48h，分别进行苏木素-伊红(HE)染色和天狼猩红染色后，于显微镜下观察结肠组织病理变化。
HE染色结果如图6所示，对照组小鼠结肠组织腺体排列整齐，杯状细胞未见破坏，组织结构完整；模型组结肠组织出现严重肠上皮损伤、隐窝萎缩或缺失，细胞水肿并伴有大量的炎性细胞浸润；各给药组小鼠结肠组织上皮损伤和炎性细胞浸润减少，隐窝炎和坏死现象改善，其中干姜多糖高剂量组小鼠结肠组织仅出现轻度的肠上皮损伤和少量炎性细胞浸润。图7为天狼猩红染色结果，通过对比可以看出，予以天狼猩红染色后，模型组呈现出红色，对照组肠道纤维化严重，黏膜组织及黏膜组织下层胶原蛋白的沉积量逐渐增加，染色程度、染色面积也随之增加；各给药组纤维化情况较模型组均有缓解，干姜多糖高剂量组结肠组织纤维化情况改善最为明显。
(6)结肠组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)含量测定
取结肠组织3cm，用预冷的PBS溶液清洗后，剪碎后置于RPMI1640培养基中，于二氧化碳孵箱中孵育24h，然后离心后取组织培养液，按照ELISA试剂盒的操作说明进行TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定。
其结果如图8至图10所示显示：与空白组相比，模型组的TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高(p<0.05，p<0.01，p<0.05)，而较模型组相比，干姜多糖高剂量组可以显著降低结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量(p<0.01，p<0.01，p<0.05)。
综上所述，本申请提供的姜多糖的制备方法简单，易操作，成本低，可有效地从姜根茎中提取出姜多糖。制得的姜多糖至少具有缓解溃疡性结肠炎的作用，能维持溃疡性结肠炎小鼠的体重、降低疾病活动指数、增加结肠长度、降低结肠组织炎症因子水平，为其在制备食品或治疗结肠炎的药物中的应用提供了科学依据。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。