具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1马鞭草总糖的提取工艺优化

实验方法：采用单因素法和响应曲面实验法优化马鞭草总糖提取工艺，通过研究液料比，提取时间和提取温度几个因素，优化马鞭草总糖提取率。单因素实验是在固定两个实验因素条件下，只考察第3个实验因素，从而可以得到该因素的最适实验水平。

为了优化马鞭草总糖的提取工艺，采用响应曲面实验和Box-Behnken设计方案，以液料比、提取时间和提取温度为实验因素，称取1g马鞭草粉末加入适量蒸馏水，进行每个实验，采用苯酚-硫酸法检测粗提液的马鞭草总糖提取率。

实验结果：

研究料液比、提取时间和提取温度对马鞭草总糖提取率的影响，单因素实验结果如图1、图2和图3所示。根据单因素实验结果，选取每个因素的3个实验水平，以便进行后续响应曲面实验。

根据单因素实验结果，料液比的三个水平确定为20:1、60:1、100:1，以65℃、80℃、95℃作为提取温度的三个水平，提取时间的三个水平为30min、120min、210min，马鞭草总糖提取率代码定为Y。响应面试验设计因素与水平见表1，试验设计方案及试验结果如表2所示。

表1 响应面试验设计因素水平及编码

表2 马鞭草总糖提取率的Box-Behnken试验设计与结果

采用Design-Expert.V11.1.0软件对试验结果进行统计处理，利用数据拟合计算出回归方程模型为

Y＝7.45-0.4662A+1.68B+0.6100C+0.0125AB-0.4450AC-0.7700BC-2.2153A²-0.6702B²-0.7178C²。为验证该模型对提取方案进行预测的效果，进一步确定各因素对马鞭草多糖提取率的影响程度，对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程方差分析和显著性结果

根据数据结果得出的建议模型为Quadratic模型，此模型的p值为0.0224(<0.05)，回归模型显著，失拟项p为0.2381(>0.05)，失拟项不显著，说明模型对试验结果拟合性较好。方程的R²为0.8660，方程拟合程度较好，可利用此模型来分析和预测马鞭草多糖的提取率。从回归方程中各参数对马鞭草总糖的提取率的影响程度来看，B对响应值(提取率)的影响极显著(p<0.01)。

不仅方差分析结果可以分析模型是否可用，诊断图也可以诊断预测模型是否具有充分性。残差的正态图如图4所示，残差分布在对角线上表明残差服从正态分布，模型可靠。诊断图如图5所示，所有数据点在可接受范围内(±4.82)，线性拟合图表明实际收益率和预测收益率之间存在良好的相关性。

通过响应面法优化，软件分析给出提取马鞭草总糖的最优条件为A(液料比)＝20：1，B(时间)＝210min，C(温度)＝83℃，此时预测的Y值＝8.72829。按此方案进行3次平行试验，实际测得马鞭草总糖的平均提取率为8.37±0.04％。通过响应曲面法优化马鞭草总糖提取工艺，建立了提取率预测模型，得到了最佳提取条件。

实施例2马鞭草多糖的分离纯化，包括如下步骤：

(1)马鞭草晒干，取干燥的马鞭草粉末200g，加入4000mL蒸馏水，恒温水浴锅83℃水浴提取210min，5000r/min离心10min，去除沉淀，得到粗提液；

(2)将步骤(1)所得的粗提取液利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，加入200mL无水乙醇，4℃冰箱放置过夜，5000r/min离心5min，取沉淀干燥后得马鞭草粗提物(命名为VO1)；

(3)将步骤(2)所得马鞭草粗提物500mg溶解于20mL蒸馏水，加入4mg胰蛋白酶和4mg蛋白酶K，37℃水浴保温48h，5000r/min离心5min，去除沉淀，得到酶解液；

(4)取步骤(3)所得酶解液上DEAE-Sepharose CL-6B层析柱(直径4.6cm，高35cm)，调节流速1mL/min，用蒸馏水洗脱16h，不收集洗脱液，然后使用0.2-0.4mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部分收集器设定每管收集12mL洗脱液，根据糖及蛋白质含量分布情况，合并第20～40管洗脱液，用截留分子量3500的透析袋对收集液进行透析，流水和蒸馏水各透析24h，透析液浓缩后冷冻干燥，得到马鞭草多糖VOP。

结果：步骤(4)中使用0.2-0.4mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱曲线如图6所示，根据图6可以看出20～40管洗脱液检测出一个糖峰，同时280nm也检测出蛋白质峰，其中20～40管蛋白质分布情况与糖分布曲线峰型和管数吻合，说明是结合蛋白，收集20～40管洗脱液得到本发明所述马鞭草多糖VOP。图7是VOP的高效液相色谱图，可以看出，峰型单一对称，说明VOP均一性好。图8是VOP的紫外吸收光谱图，可以看出，280nm有吸收峰，是VOP的结合蛋白，除此之外无其它杂质。

步骤(2)使用2倍体积无水乙醇进行初步分离，得到马鞭草粗提物，其中乙醇的使用倍数比较重要。为了对比，实验还使用了4倍体积无水乙醇进行分离，得到的粗多糖命名为VO2。将粗提物VO2经同样方法进行层析，按照糖分布曲线将洗脱的主要糖进行收集，透析、浓缩后干燥，得到多糖命名为VO2-P。VO2-P高效液相色谱分析结果如图9所示，可以看出VO2-P在5min后出现2个峰，说明可能含有其它成分或杂质，VO2-P与VOP的高效液相色谱分析结果不同，说明二者所含成分不同。进一步说明，使用4倍体积乙醇分离得到的粗提物经后续同样方法纯化后，得到的多糖含有其它成分。

步骤(3)使用酶解后的糖样进行步骤(4)层析，效果显著。为了对比，不使用酶解液进行后续层析结果如图10，与酶解后洗脱图6对比，可以看出二者糖含量分布曲线没有变化，只有1个糖峰。但是图10蛋白质分布杂乱，峰型宽，说明蛋白质多，而图6的蛋白质分布明显区分出2个以上峰。蛋白质与糖都属于大分子，难以分离，经常聚合缠绕在一起，将糖样进行酶解，蛋白质被降解，释放出原本缠绕在一起的多糖，再上层析柱后，层析柱的离子交换功能可以轻易的将电荷含量通常较多的蛋白质留在后面洗脱出来，从而简单的达到了去除蛋白质杂质的目的。

步骤(4)中使用的0.2-0.4mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，使用浓度非常重要。浓度过大则离子强度大，随着马鞭草多糖的洗脱会随之洗脱出其它杂质，浓度太小则洗脱不出目标多糖，经试验摸索NaCl浓度为0.2-0.4mol/L为宜。图11是使用更大范围0-1mol/LNaCl溶液进行洗脱后结果，对比图6可以看出，蛋白质分布杂乱，没有进行有效的分离。进一步的收集洗脱液，浓缩后冻干得到多糖，将所得多糖进行紫外光谱扫描，结果图12，在280nm和350nm检测到两个吸收峰，说明含有蛋白质和羰基类化合物。对比使用0.2-0.4mol/LNaCl洗脱所得VOP的紫外吸收光谱图(图8)，使用0-1mol/L NaCl溶液洗脱所得多糖含有杂质，主要是350nm所示物质，如羰基类化合物。

实施例3马鞭草多糖的均一性及特征分析

实验方法：采用高效液相色谱法鉴定马鞭草多糖VOP的均一性和分子量。具体方法是：使用超纯水为流动相，sugar ks-804色谱柱，柱温使50℃，流速为1mL/min，使用示差折光检测器检测。根据葡聚糖标准品的出峰时间，制作分子量标准曲线，计算VOP的重均分子质量。取0.5mg/mL的VOP水溶液进行紫外-可见光全波长扫描(190-800nm)。使用红外光谱(FTIR)法分析样品的主要官能团，确认化合物类型。

为分析VOP的单糖组成，取20-30mg VOP用1mol/L硫酸在100℃水解8h，碳酸钡中和样品，离心取上清液进行冷冻干燥，得到干燥的水解产物。将彻底干燥的VOP水解产物进行三甲基硅醚化衍生，衍生物进行气相色谱分析，使用hp-5毛细管色谱柱，程序升温160℃→180℃(20℃/min)→220℃(8℃/min,保持2min)→250℃(2min)。

结果：马鞭草多糖VOP的高效液相色谱结果如图7所示，结果显示VOP在6.349min仅有1个单一峰出现，峰型尖锐且对称，说明VOP均一性好。VOP水溶液经190-800nm全波长扫描(图8)，结果显示不含有杂质，纯度高。根据分子质量标准曲线(y＝-4x+6.31，R²＝0.99)和VOP的出峰时间，计算得出VOP的重均分子量为290kDa。VOP的红外光谱显示其在3400cm^-1、2900cm^-1、1100cm^-1和1650cm^-1均出现糖类物质的特征吸收峰。VOP水解产物经衍生化，衍生产物的气相色谱结果如图13所示，参照标准单糖衍生物的气相色谱结果，得出VOP由半乳糖，葡萄糖，甘露糖，鼠李糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为2.8:1.5:1:1:1.4。

实施例4马鞭草多糖VOP的抗炎症作用研究

实验方法：

1.RAW264.7细胞的培养：使用DMEM完全培养基(含有10％血清和1％双抗)，37℃，5％二氧化碳培养箱，48h传代一次。

2.细胞毒检验：使用MTT法检测马鞭草多糖VOP对RAW264.7的细胞毒性，实验共设置五个质量浓度(600，300，150，75和25μg/mL)。

3.抗炎症实验：使用1μg/mL脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞表达各种炎症因子，建立炎症模型。实验设置空白组，阴性对照组和阳性对照组(地塞米松组，DXMS)，样品组(VOP75)。首先提取各组细胞内总RNA，反转录后得到相应的cDNA，实时荧光定量PCR测定CT值，2^-ΔΔCT法计算mRNA相对表达量(以持家基因GAPDH为内参基因)，上述具体实验步骤均按照试剂盒说明书进行。

实验结果：细胞毒实验结果如图14所示，添加75μg/mL的马鞭草多糖VOP对RAW264.7细胞生长抑制率在20％以下，说明基本没有细胞毒性。抗炎症实验结果如图15所示，相较于空白组，TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2四种炎症因子的阴性对照组(LPS)mRNA相对表达量均显著增加(P<0.05)，说明已经成功建立了四种炎症模型。在RAW264.7细胞中添加1μg/mL脂多糖，同时添加75μg/mL质量浓度的马鞭草多糖，与阴性对照组相比，马鞭草多糖能显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2四种炎症因子的mRNA相对表达量(P<0.05)，说明马鞭草多糖VOP有较好抗炎效果。

如图16所示，相较于阴性对照组和阳性对照组，添加75μg/mL马鞭草多糖VOP能够显著降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞中iNOS基因的mRNA相对表达量(P<0.05)，且效果与阳性对照组无显著差异(P>0.05)。iNOS基因的过量表达，可以刺激机体产生过量的一氧化氮，从而损伤神经元，造成细胞损伤。

实施例5马鞭草多糖VOP的抗氧化作用研究

抗氧化实验研究：将样品配制成浓度为30mg/mL～0.0075mg/mL的水溶液。

1.超氧阴离子清除能力的测定：参照Robak的方法，取0.1mL样品液加入1mL含557uM NADH的16mM Tris–HCl(pH8.0)，1mL含45uM PMS的16mM Tris–HCl(pH 8.0)，以及1mL含108uM NBT的16mM Tris–HCl(pH 8.0)，25℃温浴5min，取出在560nm下测吸光值，按照清除率＝(1-样品管/对照管)×100％计算抑制率。

2.羟自由基清除作用的测定：参照Ghiselli等的方法并改进，取0.1mL样品液分别加入0.6mL反应缓冲液(含2.67mM脱氧核糖和0.13mM EDTA)，0.4mM硫酸亚铁0.2mL，2.0mM抗坏血酸0.05mL，以及20mM的H₂O₂ 0.05mL，37℃下温浴15min，取出后加入1％硫代巴比妥酸1mL和2％三氯乙酸1mL，沸水浴15min，立即放在冰上冷却，532nm测吸光值，按照清除率＝(1-样品管/对照管)×100％计算抑制率。

3.ABTS自由基的测定，取100ul样品液，加入100ul ABTS工作液，室温暗处反应10min，734nm下测OD，按照清除率＝(1-样品管/对照管)×100％计算抑制率。

马鞭草多糖VOP的抗氧化结果如图17所示，以维生素c(Vc)作为阳性对照，VOP和Vc对超氧自由基、羟自由基和ABTS自由基的清除作用随浓度的增加而增加，均呈现量效关系。马鞭草多糖VOP对超氧自由基和ABTS自由基清除作用显著，经计算EC₅₀分别是287μg/mL和390μg/mL，清除作用与维生素C相当。

综上所述，添加75μg/mL马鞭草多糖VOP能够显著降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS的mRNA相对表达量(P<0.05)，抗炎效果显著，且无细胞毒。马鞭草多糖VOP对超氧自由基和ABTS自由基的清除效果相当于Vc，抗氧化作用显著。

炎症因子过多的表达会引起多种疾病，如中枢神经系统疾病、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾患、类风湿性关节炎等，所以天然无毒抗炎制剂的开发被医药企业列为主要的研发方向之一。

人体因与外界接触，包括呼吸，放射线，空气污染等因素，体内会不断产生自由基。科学研究表明，过量产生的自由基与衰老、心血管疾病、关节炎、癌症等密切关联，抗炎和抗氧化相辅相成，因为自由基也是导致肌肤产生炎症的“元凶”之一，所以市面上很多化妆品都含有抗炎和抗氧化成分，寻找天然无毒的抗炎和抗氧产品也是市场上最重要的功能性诉求之一。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。