一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法
阅读说明：本技术 一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法 (Magnetic bead nucleic acid extraction method based on cetyl trimethyl ammonium bromide ) 是由 张平 顾越星 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法,采用金属浴、涡旋振荡器、低温离心机、移液器、真空抽吸器、磁力架和离心管作为提取的工具；采用四个步骤提取核酸,第一步是样品裂解；第二步磁珠结合核酸；第三步是磁珠清洗；第四步是核酸洗脱。本发明采用CTAB和SDS结合的方法能提高裂解效率,采用结合表面积大的磁珠法提高核酸结合量,进而提高了核酸产量。本发明不使用传统方法中的苯酚、氯仿等有毒试剂,对实验操作人员的伤害以及对环境的影响减少到最少,更加符合现代环保理念,更适合实现高通量自动化核酸提取。基于上述,本发明具有好的应用前景。(A magnetic bead nucleic acid extraction method based on cetyl trimethyl ammonium bromide adopts a metal bath, a vortex oscillator, a low-temperature centrifuge, a pipettor, a vacuum aspirator, a magnetic frame and a centrifuge tube as extraction tools; extracting nucleic acid by four steps, wherein the first step is sample cracking; second, magnetic beads bind nucleic acids; the third step is magnetic bead cleaning; the fourth step is nucleic acid elution. According to the invention, a CTAB and SDS combination method is adopted to improve the cracking efficiency, and a magnetic bead method with large combination surface area is adopted to improve the nucleic acid combination amount, so that the nucleic acid yield is improved. The invention does not use toxic reagents such as phenol, chloroform and the like in the traditional method, reduces the harm to experiment operators and the influence on the environment to the minimum, better accords with the modern environmental protection concept, and is more suitable for realizing high-flux automatic nucleic acid extraction. Based on the above, the invention has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及动植物成分的核酸提取工艺技术领域，特别是一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法。
背景技术
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法是实验室中一种常见的动植物核酸提取方法。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解动植物细胞膜，它能与动植物核酸形成复合物、复合物在高盐溶液(酚、氯仿等)中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，能从溶液中沉淀，通过离心机离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开，最后通过乙醇或异丙醇沉淀制备出核酸(由于CTAB溶于乙醇或异丙醇能被除去，所以最终能得到动植物核酸)。
然而，受到技术限制，现有的CTAB法需要配合使用酚、氯仿等有害有机溶剂来协助去除蛋白杂质等，从而获得高纯度的核酸溶液。虽然CTAB法与其他主流核酸提取方相比可取得高核酸产量的特点，但存在繁琐的离心步骤多的缺点，且因涉及使用苯酚、氯仿等有害有机溶剂，会对作业人员健康及环境等带来较大不利影响，因此未能获得市场普遍使用。
发明内容
为了克服现有技术中，基于CTAB法实验提取动植物核酸，因技术所限存在离心步骤多，采用苯酚、氯仿等有害有机溶剂，会对作业人员健康及环境等带来较大不利影响的弊端，本发明提供了基于CTAB，运用超顺磁性氧化硅纳米磁珠等作为提取的材料，磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，利用氧化硅纳米磁珠的超顺磁性，在外加磁场结合本申请采用的原料及制备方法共同作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中快速分离出核酸，产量更高，不使用传统方法中的苯酚、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害以及对环境的影响减少到最少，更加符合现代环保理念，更加适合实现高通量自动化核酸提取的一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法，采用金属浴、涡旋振荡器、低温离心机、移液器、真空抽吸器、磁力架和离心管作为提取的工具；其特征在于采用四个步骤提取核酸，第一步是样品裂解，具体操作步骤如下：将动植物粉末样本或匀浆样本加入2ml离心管内，并加入CTAB裂解液，用涡旋振荡器涡旋混匀后于在金属浴内一定温度条件下孵育一段时间，然后加入100ul SDS溶液继续于一定温度下孵育一段时间，于一定温度条件下在12000g条件下用低温离心机离心一段时间，接着用移液器转移出试管内400ul的上清、然后把转移上清后混合物样品加入新的2ml离心管内，并加入600ul的蛋白变性剂到含样品的离心管中，用涡旋振荡器数秒涡旋后于一定温度条件下孵育一段时间；第二步磁珠结合核酸，具体操作步骤如下：在含样品的离心管内加入1000ul的异丙醇，再加入10μl充分重悬的磁珠到离心管内，通过涡旋振荡器数秒涡旋混匀，室温放置一段时间，中间可涡旋或颠倒混匀数次，把离心管放到磁力架上一段时间，此时磁珠形成紧密沉淀，上清变清澈；第三步是磁珠清洗，具体操作步骤如下：将离心管留在磁力架上，采用真空抽吸器真空抽吸离心管进而吸掉上清，加入配制好的1ml洗涤剂到离心管，在磁力架上原地旋转2ml离心管数圈，将离心管留在磁力架上一段时间后，然后采用真空抽吸器吸掉上清，重复清洗1ml洗涤剂清洗磁珠一次，再次采用真空抽吸器吸掉上清后室温干燥一段时间；第四步是核酸洗脱，具体操作步骤如下：加入75μl洗脱液到离心管内，并涡旋振荡器涡旋振荡混匀磁珠后于一定温度条件下孵育一段时间，离心管瞬时离心后，把离心管放到磁力架上、直到磁珠形成紧密沉淀，取70ul上清后将沉淀液放入新的1.5ml离心管内，该洗脱液即为提取的核酸成品。
进一步地，所述第一步样品裂解中，加入的CTAB裂解液是1000ul，用涡旋振荡器涡旋混匀后在金属浴内65℃条件下孵育时间为30分钟，加入SDS溶液继续在65℃条件下孵育时间是15分钟，4℃在12000g条件下离心时间为15min，用涡旋振荡器数秒涡旋后65℃条件下孵育时间是15分钟。
进一步地，所述第二步磁珠结合核酸中，通过涡旋振荡器数秒涡旋混匀，室温放置的时间是10分钟，把离心管放到磁力架上时间是2分钟。
进一步地，所述第三步磁珠清洗中，将离心管留在磁力架上时间是1分钟，采用真空抽吸器吸掉上清后室温干燥时间是5分钟。
进一步地，所述第四步核酸洗脱中，涡旋振荡器涡旋振荡混匀磁珠后65℃条件下孵育时间为7分钟。
本发明有益效果是：本发明采用CTAB和SDS组合作为裂解试剂来释放动植物样本中高产量的核酸，采用CTAB去除了反应中PCR(聚合酶链反应)抑制的多糖成分，采用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)去除PCR抑制的酚类物质，采用低温离心法分离去除细胞的残渣、蛋白质、油脂和胆固醇等，采用异丙醇作为核酸结合剂帮助磁珠结合核酸，采用磁力架分离上清和磁珠，吸除含有蛋白质、无机盐和其他有机溶剂的上清，采用80％乙醇2次清洗磁珠来去除残留的蛋白质和盐离子，最后采用洗脱液分离磁珠结合的核酸，最终得到核酸成品。本发明采用CTAB和SDS结合的方法能提高裂解效率，采用结合表面积大的磁珠法提高核酸结合量，进而提高了核酸产量。本发明不使用传统方法中的苯酚、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害以及对环境的影响减少到最少，更加符合现代环保理念，也更合实现高通量自动化核酸提取。基于上述，本发明具有好的应用前景。
附图说明
图1是本发明制备流程框图示意。
具体实施方式
图1所示，一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法，采用金属浴、涡旋振荡器、低温离心机、移液器、真空抽吸器、磁力架和离心管作为提取的工具；采用四个步骤提取核酸，第一步是样品裂解，具体操作步骤如下：将200-300mg动植物粉末样本或匀浆样本加入2ml离心管内，并加入含有CTAB和PVP成分的裂解液，CTAB会结合样品中的部分多糖成分，PVP会结合样品中的部分酚类物质，用涡旋振荡器涡旋混匀后于在金属浴内一定温度条件下孵育一段时间，然后加入100ul SDS(十二烷基硫酸钠)溶液继续于65℃孵育一段时间，于一定温度条件下在12000g条件下用低温离心机离心一段时间，接着用移液器转移出试管内400ul的上清、然后把转移上清后混合物样品加入新的2ml离心管内，并加入600ul的异硫氰酸胍蛋白变性剂到含样品的离心管中，用涡旋振荡器数秒涡旋后于一定温度条件下孵育一段时间；第二步磁珠结合核酸，具体操作步骤如下：在含样品的离心管内加入1000ul的异丙醇，再加入10μl充分重悬的磁珠到离心管内，通过涡旋振荡器数秒涡旋混匀，室温放置一段时间，中间可涡旋或颠倒混匀数次，把离心管放到磁力架上一段时间，此时磁珠形成紧密沉淀，上清变清澈；第三步是磁珠清洗，具体操作步骤如下：将离心管留在磁力架上，采用真空抽吸器真空抽吸离心管进而吸掉上清，加入配制好的1ml洗涤剂(80％乙醇)到离心管，在磁力架上原地旋转2ml离心管数圈，将离心管留在磁力架上一段时间后，然后采用真空抽吸器吸掉上清，重复清洗1ml洗涤剂(80％乙醇)清洗磁珠一次，再次采用真空抽吸器吸掉上清后室温干燥一段时间；第四步是核酸洗脱，具体操作步骤如下：加入75μl TE(Tris三羟甲基氨基甲烷+EDTA乙二胺四乙酸)洗脱液到离心管内，并涡旋振荡器涡旋振荡混匀磁珠后于一定温度条件下孵育一段时间，离心管瞬时离心后，把离心管放到磁力架上、直到磁珠形成紧密沉淀，取70ul上清后将沉淀液放入新的1.5ml离心管内，该洗脱液即为提取的核酸成品。
图1所示，第一步样品裂解中，加入的CTAB裂解液是1000ul，用涡旋振荡器涡旋混匀后在金属浴内65℃条件下孵育时间为30分钟，加入SDS溶液继续在65℃条件下孵育时间是15分钟，4℃在12000g条件下离心时间为15min，用涡旋振荡器数秒涡旋后65℃条件下孵育时间是15分钟。第二步磁珠结合核酸中，通过涡旋振荡器数秒涡旋混匀，室温放置的时间是10分钟，把离心管放到磁力架上时间是2分钟。第三步磁珠清洗中，将离心管留在磁力架上时间是1分钟，采用真空抽吸器吸掉上清后室温干燥时间是5分钟。第四步核酸洗脱中，涡旋振荡器涡旋振荡混匀磁珠后65℃条件下孵育时间为7分钟。
图1所示，本发明中，核酸提取的第一步通常是裂解来释放核酸。裂解涉及2个层面：1)细胞膜溶解来释放核酸；2)蛋白与核酸解离来释放核酸。本发明采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)作为一种可溶解细胞膜的裂解试剂，通常在65℃时作为高效的植物细胞裂解试剂，获得的核酸产量通常高于其他核酸提取试剂。CTAB裂解试剂同样也适用于动物细胞，因此可作为同时提取动物和植物组织核酸的裂解试剂。细胞裂解后的核酸有游离的，也有和蛋白质结合的。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)裂解试剂在65℃工作半小时后，加入SDS(十二烷基硫酸钠)可促进核酸与蛋白质分离。SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子除垢剂，它和蛋白上的氨基酸残基1:1结合使蛋白带负电，这样就使得蛋白的二级结构完全打开并且都会带上负电，从而获得更多的游离的核酸。
图1所示，本发明中，涉及去除杂质步骤中，杂质包括蛋白，植物多糖和多酚，动物油脂和胆固醇，盐离子，提取试剂成分。经第一步裂解后的样品放入4℃的低温离心机，12000g离心15分钟。低温可让油脂和胆固醇等在样品溶液中析出，从而出现在离心后样本漂浮的表层。CTAB在高离子强度的裂解液中,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)与蛋白质和多糖形成复合物，而这些CTAB复合物和细胞残渣出现在离心的沉淀部分。取出中间澄清液体部分到新的离心管，再加入离液盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)。不同于传统的CTAB法需要苯酚、氯仿等有害有机溶剂来萃取蛋白质，本方法通过破坏分子力(氢键)稳定性的离液盐使疏水性的蛋白质更易溶于水。同时，裂解液中PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，是一种水溶性聚合物，可结合植物组织中特定的酚类物质。采用异丙醇来溶解CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，并让需要提取的核酸在溶液中析出。至此，本方法把需要去除的杂质成分尽可能的溶解于后续会丢弃的上清溶液中。
图1所示，本发明中，采用磁珠来作为核酸结合的载体，不同于常规的离心柱法核酸提取，结合核酸的磁珠表面积远大于离心柱内的硅膜，而且可以增加磁珠的量来加大结合核酸的概率，通常磁珠法DNA结合的产量也是常规离心柱法的几倍。在结合剂异丙醇的作用下，析出的核酸与磁珠结合。经磁力架分离磁珠和上清，含有CTAB、蛋白、植物多糖、多酚和异丙醇的上清被吸除。采用80％的乙醇清洗磁珠，可洗去可溶于乙醇的盐离子。
图1所示，一，综上所述，发本明采用CTAB和SDS组合作为裂解试剂来释放动植物样本中高产量的核酸，采用CTAB去除了反应中PCR(聚合酶链反应)抑制的多糖成分，采用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)去除PCR抑制的酚类物质，采用低温离心法分离去除细胞的残渣、蛋白质、油脂和胆固醇等，采用异丙醇作为核酸结合剂帮助磁珠结合核酸，采用磁力架分离上清和磁珠，吸除含有蛋白质、无机盐和其他有机溶剂的上清，采用80％乙醇2次清洗磁珠来去除残留的蛋白质和盐离子，最后采用洗脱液分离磁珠结合的核酸，最终得到核酸成品。本发明采用CTAB和SDS结合的方法提高了裂解效率，采用结合表面积大的磁珠法提高核酸结合量，进而提高了核酸产量。本发明不使用传统方法中的苯酚、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害以及对环境的影响减少到最少，更加符合现代环保理念，也更加适合实现高通量自动化核酸提取。本发明背景技术如下：磁珠法核酸提取原理；磁珠法依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在外加磁场的结合本申请采用的原料及制备方法共同作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本核酸分离出来，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。