一种从发酵液中分离提取胞苷的方法
阅读说明：本技术 一种从发酵液中分离提取胞苷的方法 (Method for separating and extracting cytidine from fermentation liquor ) 是由 应汉杰 陈勇 温庆仕 魏荷芬 周精卫 杨玉晨 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从发酵液中分离提取胞苷的方法,将含有胞苷的液体经阳离子交换树脂吸附洗脱,所得洗脱液浓缩结晶,即得胞苷晶体；其中,所述阳离子交换树脂为NH-1树脂经硫酸银和/或硫酸改性所得。本发明中使用的阳离子交换柱为改性后的NH-1树脂,其胞苷吸附量达到0.3g/g,减少了树脂用量,间接节省了酸碱用量和操作时间。(The invention discloses a method for separating and extracting cytidine from fermentation liquor, which comprises the steps of adsorbing and eluting liquid containing cytidine by cation exchange resin, and concentrating and crystallizing the obtained eluent to obtain cytidine crystals; wherein the cation exchange resin is obtained by modifying NH-1 resin with silver sulfate and/or sulfuric acid. The cation exchange column used in the invention is modified NH-1 resin, and the cytidine adsorption capacity of the cation exchange column reaches 0.3g/g, so that the resin dosage is reduced, and the acid-base dosage and the operation time are indirectly saved.)
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离提取胞苷的方法。
背景技术
胞苷是嘧啶核苷，是胞磷胆碱的中间体，同时又是很多抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病等药物的中间体。胞苷广泛应用在食品、保健品、化妆品和医药等诸多行业。胞苷尤其是当代医学上很重要的药物合成中间体，随着其在应用范围上的不断扩大，对胞苷的需求也越来越大，自然对胞苷的制备研究也越来越深入。目前迫切需要开发廉价的可规模化应用的胞嘧啶核苷生产分离纯化工艺。
目前国内外，关于胞苷的生产，主要有化学合成法、酶法合成法、微生物发酵合成法。其中以微生物发酵合成法为主，关于如何选育高效、高产的微生物菌株的方法报道有很多，但是对于胞苷规模化分离纯化工艺的研究报道却较少。因此，本发明提供了一种从发酵液中分离提取胞苷的方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分离提取胞苷的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种分离提取胞苷的方法，将含有胞苷的液体经阳离子交换树脂吸附洗脱，所得洗脱液浓缩结晶，即得胞苷晶体。
其中，所述阳离子交换树脂为NH-1树脂经硫酸银和/或硫酸改性所得。
其中，所述阳离子交换树脂的吸附量为0.2-0.4g/g；优选地，所述阳离子交换树脂的吸附量为0.3g/g。
其中，所述硫酸银的用量为NH-1树脂质量的2％-8％；优选地，硫酸银的用量为NH-1树脂质量的4％-6％；优选地，硫酸银的用量为NH-1树脂质量的5％。
其中，所述硫酸的用量为树脂体积的10-20倍。
其中，改性过程中的溶剂为二氯乙烷和/或三氯乙烷。
其中，所述NH-1树脂与溶剂的体积比为1：(6-20)。
其中，将NH-1树脂与溶剂混合，于50-70℃下保持0.5-2h；加入硫酸银和/或硫酸，于70-90℃下保持2-4h，再于90-100℃下保持2-3h，过滤、洗涤，即得。
其中，所述洗涤为洗涤至中性。
其中，所述洗涤为用甲醇、乙醇和丙酮中的任意一种或几种有机溶剂洗涤
其中，经上述方法改性后静态吸附实验表明，树脂的吸附量由原来的0.09g/g提升至0.3g/g。
优选地，所述分离提取胞苷的方法包括如下步骤：
(1)胞苷发酵液经陶瓷膜过滤，去除固体杂质，得到第一透过液；
(2)步骤(1)所得第一透过液经阳离子交换树脂吸附，水和/或氨水洗杂、氨水洗脱，在该过程中用HPLC连续检测，检测到胞苷流出时，直接切换为胞苷洗脱，得到洗脱液；
(3)步骤(2)所得洗脱液同步经纳滤膜纳滤脱色，得到第二透过液；
(4)步骤(3)所得第二透过液经纳滤膜浓缩、真空蒸发浓缩，所得浓缩液调节pH，加入少量晶种作为诱导剂，搅拌降温析晶、过滤、洗涤、干燥，得到胞苷晶体。
步骤(1)中，胞苷来源于微生物发酵液，通过系统代谢工程改造所得的尿苷高产菌株大肠杆菌在50L发酵罐中，胞苷的初始产量在30-60g/L。此发酵液中，存在着大量的菌体、培养基与色素及其他杂质，分离难度较大。
步骤(1)中，所述胞苷发酵液调节pH后经陶瓷膜过滤；优选地，pH为2-3.5。
步骤(1)中，所述陶瓷膜的孔径为50-200nm，陶瓷膜的压力为0.1-0.3MPa。
步骤(1)中，所述过滤的温度为常温。
步骤(2)中，第一透过液上样到阳离子交换树脂中的上样速率为1-2BV/h。
步骤(2)中，所述洗杂过程中，氨水的浓度为0-0.05mol/L；优选地，氨水的浓度为0.03mol/L。
步骤(2)中，所述洗杂的流速为1-2BV/h。
步骤(2)中，所述洗杂的体积为4-14BV。
步骤(2)中，所述洗脱过程中，氨水的浓度为0.05-0.1mol/L；优选地，氨水的浓度为0.06mol/L。
步骤(2)中，所述洗脱的流速为1-2BV/h。
步骤(2)中，所述洗脱的体积为10-30BV；优选地，洗脱至洗脱液流出点样不含有胞苷，此时结束洗脱。
步骤(3)中，所述纳滤膜的截留分子量为300-800Da。
步骤(3)中，所述纳滤膜的压力为1-3MPa。
步骤(4)中，所述纳滤膜的截留分子量为60-200Da；优选地，所述纳滤膜的截留分子量为60-120Da；优选地，所述纳滤膜的截留分子量为90Da。
步骤(4)中，所述真空蒸发浓缩的真空度为100mbar以下，水浴温度45-70℃；优选地，水浴温度为50℃。
步骤(4)中，所述浓缩为浓缩至400-800g/L；优选地，所述浓缩为浓缩至400-600g/L；进一步优选地，所述浓缩为浓缩至600g/L。
步骤(4)中，所述pH为5-10；优选地，所述pH为6-8；进一步优选地，所述pH为7。
步骤(4)中，所述搅拌的转速为100-400rpm。
步骤(4)中，所述加入晶种后搅拌1-2h有晶体析出。
步骤(4)中，所述降温为降温至0-10℃；优选地，所述降温为降温至2-6℃；进一步优选地，所述降温为降温至4℃。
步骤(4)中，所述降温为采用梯度降温的方法进行降温；优选地，6-12h内完成结晶。
步骤(4)中，结晶体系为水体系，降低车间改造和生产成本。
步骤(4)中，所述洗涤为用浓度为95％-99％的乙醇溶液对晶体进行洗涤，离心或抽滤收集晶体，能提高晶体的纯度，减少结晶母液内杂质的影响。
步骤(4)中，所述干燥为鼓风干燥、双锥干燥或真空干燥；优选地，所述干燥为真空干燥；优选地，真空度为0-200mbar；优选地，所述真空度10-100mbar。
步骤(4)中，所述干燥的温度为40-100℃；优选地，所述干燥的温度为50-80℃。
步骤(4)中，优选地，通过二次结晶或嵌套结晶提高收率。
经上述方法所得到胞苷的纯度为99％以上，总收率为90％-95％。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)与现有胞苷的结晶方法对比，先形成胞苷盐酸盐在二次结晶为胞苷，本发明的胞苷晶体是采用一步分离直接结晶法获得，省去了胞苷盐酸盐粗品的获得二次结晶的流程。
(2)本发明中使用的阳离子交换柱为改性后的NH-1树脂，其胞苷吸附量达到0.3g/g，减少了树脂用量，间接节省了酸碱用量和操作时间。
(3)本发明中将胞苷吸附在阳离子交换柱NH-1上，确定了氨水溶液洗杂浓度为0.03mol/L和洗脱浓度0.06mol/L，将最优的工艺参数确定并稳定运行。
(4)本发明采用300-800Da的纳滤膜进行脱色，可得到清澈的淡黄色溶液，并采用60-200Da的膜进行浓缩，过程没有固废产生，速度快，收率高、无污染、成本低。
(5)本发明中的结晶体系为水体系，不必增加任何试剂，大大降低结晶成本。本发明的结晶过程在12h以内完成获得亮白色晶体，一次结晶收率大于50％，经多次结晶或嵌套结晶后总结晶收率在90-95％，同时晶体的纯度大于99％，产品质量、收率、成本高于现有技术。
(6)本发明不仅成功实现了杂质多分离难的问题，还具备高效低能耗、成本低、品质好、收率高等优点。
附图说明
下面结合附图和
具体实施方式
对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为胞苷结晶产品。
图2为胞苷晶体结构。
图3为液相纯度检测图谱。
图4原始发酵液液相图谱。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述NH-1树脂由南京工业大学合成，已公开于中国发明专利CN106632519B一种采用连续离子交换色谱技术分离核苷酸的工艺以及其他专利。
下述实施例中所述含有胞苷的发酵液为大肠杆菌对葡萄糖，玉米浆，维生素，无机盐，酵母膏等进行转化，形成含有胞苷的发酵液(胞苷含量32g/L)；该发酵液中除胞苷外，其成分主要为糖、核酸、盐、色素、氨基酸、蛋白、有机酸等，其液相如图4所示。
下述实施例中所述改性后的阳离子交换树脂NH-1的制备方法为将NH-1树脂与二氯乙烷混合，树脂与溶液的体积比为1：6，70℃下维持1h，加入树脂质量5％的硫酸银催化剂及10倍体积的硫酸，70℃度下维持2h，升温到90℃维持3h，过滤获得改性后的阳树脂，并不断用去离子水洗涤到中性，后改用丙酮涤树脂，水洗后备用。静态吸附实验表明，经改性后的树脂吸附量由原来的0.09g/g树脂提高到0.3g/g。
实施例1：
(1)调节含有胞苷的发酵液的pH为2，经50nm的陶瓷膜过滤，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有胞苷，合并，得到陶瓷膜透过液。
(2)将步骤(1)所得陶瓷膜透过液上样至改性后的阳离子交换树脂NH-1 215g，进行吸附、洗杂，洗脱，收集洗脱液；上样速率为1BV/h，上样量为含有总质量64g的胞苷发酵液清液；洗杂过程中，氨水的浓度为0.01mol/L，流速为1BV/h，洗杂的体积为8BV；洗脱过程中，氨水的浓度为0.05mol/L，流速为1BV/h，洗脱的体积为14BV。
(3)将步骤(2)所得洗脱液经300Da的纳滤膜纳滤，去除色素等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含胞苷为止，收集纳滤膜透过液。
(4)将步骤(3)所得透过液经60Da的纳滤膜浓缩到50g/L，经蒸发浓缩到胞苷浓度为400g/L，用盐酸将pH调节到5.0，室温20℃，加入晶种不断以200rpm搅拌1h，析出晶体，10h梯度降温到4度。
(5)将步骤(4)所得晶体抽滤，去除母液，并加入无水乙醇进行洗涤两次，抽滤获得晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥4h，即得35.6g胞苷晶体，胞苷一次收率为55.6％，所得胞苷产品如图1所示，晶体结构如图2所示，液相如图3所示。
(7)将步骤(5)所得母液经二次和三次结晶后，干燥后的晶体分别得到15.62g和6.45g的胞苷晶体，其纯度为99.9％，总收率为90.1％。
对比例1
(1)调节含有胞苷的发酵液的pH为2，经50nm的陶瓷膜过滤，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有胞苷，合并，得到陶瓷膜透过液。
(2)将步骤(1)所得陶瓷膜透过液上样至阳离子交换树脂001*7 650g，进行吸附、洗杂，洗脱，收集洗脱液；上样速率为1.5BV/h，上样量为含有总质量64g的胞苷发酵液清液；洗杂过程中，氨水的浓度为0.01mol/L，流速为1.5BV/h，洗杂的体积为10BV；洗脱过程中，氨水的浓度为0.05mol/L，流速为1BV/h，洗脱的体积为15BV。
(3)将步骤(2)所得洗脱液经300Da的纳滤膜纳滤，去除色素等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含胞苷为止，收集纳滤膜透过液。
(4)将步骤(3)所得透过液经60Da的纳滤膜浓缩到50g/L，经蒸发浓缩到胞苷浓度为400g/L，用盐酸将pH调节到5.0，室温20℃，加入晶种不断以200rpm搅拌1h，析出晶体，10h梯度降温到4度。
(5)将步骤(4)所得晶体抽滤，去除母液，并加入无水乙醇进行洗涤两次，抽滤获得晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥4h，即得30.7g胞苷晶体，胞苷一次收率为47.9％。
(7)将步骤(5)所得母液经二次和三次结晶后，干燥后的晶体分别得到15.65g和7.4g的胞苷晶体，其纯度为98.8％，总收率为84％。
因树脂的变更，造成吸附量和分离度的减小，树脂用量的增大，整体洗脱液的体积变大，流程时间变长，再生树脂的酸碱量变多。
对比例2
(1)调节含有胞苷的发酵液的pH为2，经50nm的陶瓷膜过滤，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有胞苷，合并，得到陶瓷膜透过液。
(2)将步骤(1)所得陶瓷膜透过液上样至原始阳离子交换树脂NH-1 600g，进行吸附、洗杂，洗脱，收集洗脱液；上样速率为1.5BV/h，上样量为含有总质量64g的胞苷发酵液清液；洗杂过程中，氨水的浓度为0.01mol/L，流速为1.5BV/h，洗杂的体积为10BV；洗脱过程中，氨水的浓度为0.05mol/L，流速为1BV/h，洗脱的体积为15BV。
(3)将步骤(2)所得洗脱液经300Da的纳滤膜纳滤，去除色素等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含胞苷为止，收集纳滤膜透过液。
(4)将步骤(3)所得透过液经60Da的纳滤膜浓缩到50g/L，经蒸发浓缩到胞苷浓度为400g/L，用盐酸将pH调节到5.0，室温20℃，加入晶种不断以200rpm搅拌1h，析出晶体，10h梯度降温到4度。
(5)将步骤(4)所得晶体抽滤，去除母液，并加入无水乙醇进行洗涤两次，抽滤获得晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥4h，即得32.64g胞苷晶体，胞苷一次收率为51％。
(7)将步骤(5)所得母液经二次和三次结晶后，干燥后的晶体分别得到15.68g和8g的胞苷晶体，其纯度为99％，总收率为88％。
因树脂未改性，造成吸附量减小，树脂用量的增大，整体洗脱液的体积变大，流程时间变长，再生树脂的酸碱量变多。
实施例2：
(1)调节含有胞苷的发酵液的pH为3.5，经200nm的陶瓷膜过滤，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有胞苷，合并，得到陶瓷膜透过液。
(2)将步骤(1)所得陶瓷膜透过液上样至改性后的阳离子交换树脂NH-1 215g，进行吸附、洗杂，洗脱，收集洗脱液；上样速率为1.5BV/h，上样量为含有总质量64g的胞苷发酵液清液；洗杂过程中，氨水的浓度为0.05mol/L，流速为1.5BV/h，洗杂的体积为10BV；洗脱过程中，氨水的浓度为0.1mol/L，流速为2BV/h，洗脱的体积为12BV。
(3)将步骤(2)所得洗脱液经800Da的纳滤膜纳滤，去除色素等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含胞苷为止，收集纳滤膜透过液。
(4)将步骤(3)所得透过液经200Da的纳滤膜浓缩到70g/L，经蒸发浓缩到胞苷浓度为600g/L，调节pH调节到10.0，室温20℃，加入晶种不断以400rpm搅拌2h，析出晶体，10h梯度降温到1度。
(5)将步骤(4)所得晶体抽滤，去除母液，并加入无水乙醇进行洗涤两次，抽滤获得晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥4h，即得41.2g胞苷晶体，胞苷一次收率为64.3％。
(7)将步骤(5)所得母液经二次和三次结晶后，干燥后的晶体分别得到14.64g和5g的胞苷晶体，其纯度为99.1％，总收率为95％。
实施例3：
(1)调节含有胞苷的发酵液的pH为2.5，经100nm的陶瓷膜过滤，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有胞苷，合并，得到陶瓷膜透过液。
(2)将步骤(1)所得陶瓷膜透过液上样至改性后的阳离子交换树脂NH-1 215g，进行吸附、洗杂，洗脱，收集洗脱液；上样速率为2BV/h，上样量为含64g胞苷得发酵液；洗杂过程中，氨水的浓度为0.03mol/L，流速为2BV/h，洗杂的体积为14BV；洗脱过程中，氨水的浓度为0.06mol/L，流速为1.5BV/h，洗脱的体积为13BV。
(3)将步骤(2)所得洗脱液经500Da的纳滤膜纳滤，去除色素等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含胞苷为止，收集纳滤膜透过液。
(4)将步骤(3)所得透过液经90Da的纳滤膜浓缩到60g/L，经蒸发浓缩到胞苷浓度为500g/L，调节pH调节到7.0，室温20℃，加入晶种不断以400rpm搅拌1.5h，析出晶体，10h梯度降温到4度。
(5)将步骤(4)所得晶体抽滤，去除母液，并加入无水乙醇进行洗涤两次，抽滤获得晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥4h，即得38.1g胞苷晶体,胞苷一次收率为59.5％。
(7)将步骤(5)所得母液经二次和三次结晶后，干燥后的晶体分别得到15.28g和6.27g的胞苷晶体，其纯度为99.6％，总收率为93.2％。
实施例4：
(1)调节含有胞苷的发酵液的pH为3.0，经150nm的陶瓷膜过滤，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有胞苷，合并，得到陶瓷膜透过液。
(2)将步骤(1)所得陶瓷膜透过液上样至改性后的阳离子交换树脂NH-1 215g，进行吸附、洗杂，洗脱，收集洗脱液；上样速率为1.5BV/h，上样量为含有总质量64g的胞苷发酵液清液；洗杂过程中，氨水的浓度为0.02mol/L，流速为1.5BV/h，洗杂的体积为11BV；洗脱过程中，氨水的浓度为0.07mol/L，流速为1BV/h，洗脱的体积为12.5BV。
(3)将步骤(2)所得洗脱液经400Da的纳滤膜纳滤，去除色素等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含胞苷为止，收集纳滤膜透过液。
(4)将步骤(3)所得透过液经150Da的纳滤膜浓缩到65g/L，经蒸发浓缩到胞苷浓度为450g/L，调节pH调节到7.0，室温20℃，加入晶种不断以400rpm搅拌0.5h，析出晶体，10h梯度降温到10度。
(5)将步骤(4)所得晶体抽滤，去除母液，并加入无水乙醇进行洗涤两次，抽滤获得晶体。
(6)将步骤(5)所得晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥4h，即得36.1g胞苷晶体，苷一次收率为56.4％。
(7)将步骤(5)所得母液经二次和三次结晶后，干燥后的晶体分别得到15.63g和6.45g的胞苷晶体，其纯度为99.4％，总收率为90.9％。
本发明创新采用发酵液直接过膜，并采用三套膜系统进行粗分离去除菌体和大分子杂质，并通过实验室合成的阳离子交换树脂进行一步法精细化色谱分离，其最大胞苷吸附量为0.3g/g；并确定了最佳的洗杂浓度和洗脱浓度：洗杂过程中，氨水的浓度为0.03mol/L；洗脱过程中，氨水的浓度为0.06mol/L。洗脱液经浓缩后，加入晶种水体系结晶，晶体经洗涤干燥后获得。整个分离收率在90％以上和纯度高高于99％，优于现有技术的收率，分离成本低。
本发明提供了一种从发酵液中分离提取胞苷的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。