核苷衍生物及其用途
阅读说明：本技术 核苷衍生物及其用途 (Nucleoside derivatives and use thereof ) 是由 上野义仁 前田雄介 梶野瞭平 于 2018-10-31 设计创作，主要内容包括：提供了更适合实际用作如RNA药物等的核苷以及所述核苷的用途。为此,提供了式(1)或(2)表示的核苷衍生物或其盐。[化16](在式(1)中,R<Sup>1</Sup>表示氢原子、羟基、氢原子被烷基或烯基取代的羟基、或被保护基,在式(2)中,X表示卤素原子。在式(1)和式(2)中,R<Sup>2</Sup>和R<Sup>3</Sup>可以相同或不同,并且各自表示氢原子、羟基保护基、磷酸酯基、被保护的磷酸酯基、或-P(＝O)<Sub>n</Sub>R<Sup>5</Sup>R<Sup>6</Sup>(n表示0或1,R<Sup>5</Sup>和R<Sup>6</Sup>可以相同或不同,并且各自表示氢原子、羟基、被保护的羟基、巯基、被保护的巯基、低级烷氧基、氰基低级烷氧基、氨基、或取代的氨基。注意,当n为1时,R<Sup>5</Sup>和R<Sup>6</Sup>不会同时为氢原子),每一个R<Sup>4</Sup>表示具有连接基团的NHR<Sup>7</Sup>(R<Sup>7</Sup>表示氢原子、烷基、烯基、或氨基保护基)、叠氮基、脒基、或胍基,并且B表示嘌呤-9-基、2-氧代-嘧啶-1-基、取代的嘌呤-9-基、或取代的2-氧代-嘧啶-1-基中的一个。)<Image he="721" wi="674" file="DDA0002552402180000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(Nucleosides more suitable for practical use as, for example, RNA drugs, etc., and uses of the nucleosides are provided. To this end, a nucleoside derivative represented by the formula (1) or (2) or a salt thereof is provided. [ chemical formula 16 ]](in the formula (1), R 1 Represents a hydrogen atom, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a protected group, and in formula (2), X represents a halogen atom. In the formulae (1) and (2), R 2 And R 3 May be the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphate group, a protected phosphate group, or-P (═ O) n R 5 R 6 (n represents 0 or 1, R 5 And R 6 May be the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, a mercapto group, a protected mercapto group, a lower alkoxy group, a cyano lower alkoxy group, an amino group, or a substituted amino group. Note that when n is 1, R 5 And R 6 Not both hydrogen atoms), each R 4 Denotes NHR with a linking group 7 (R 7 Represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, or an amino-protecting group), an azido group, an amidino group, or a guanidino group, and B represents one of a purin-9-yl group, a 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, a substituted purin-9-yl group, or a substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group. ))
技术领域
本说明书涉及核苷衍生物及其用途。
(相关申请的交叉引用)
本申请是日本专利申请号2017-211339(其为2017年10月31日提交的日本专利申请)的相关申请，并且基于该日本专利申请要求优先权，并且该日本申请中描述的所有内容通过引用并入本文。
背景技术
已知包括癌症在内的许多疾病是由基因突变和基因表达异常引起或与之相关。抑制基因表达的RNA药物(如siRNA)可用于治疗此类疾病，并被认为具有极好的药物潜力。
然而，siRNA等的问题在于它们难以通过细胞膜，并且可能被核酸酶破坏。因此，已经将载体如LNP用于siRNA的细胞内递送，并且还已经尝试了核苷的各种化学修饰(非专利文献1至4)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：HELVATICA CHIMICA ACTA Vol.83(2000)128-151
非专利文献2：The Journal of Organic Chemistry 2012,77,3233-3245
非专利文献3：Bioorganic&Chemistry letters(1999)2667-2672
非专利文献4：The Journal of Organic Chemistry 2013,78,9956-9962
发明内容
尽管对细胞膜通透性和核酸酶耐受性进行了这些努力，但是，仍然需要进一步改善RNA药物的有效性。甚至这些RNA修饰没能提供令人满意的细胞膜通透性、核糖核酸酶耐受性和基因抑制能力。
本说明书的目的是提供更适合实际用作如RNA药物等的核苷及其用途。
技术问题的解决方案
发明人专注于对核糖、核糖核苷酸的糖部分的化学修饰，也专注于对5’碳原子的修饰，该5’碳原子是核糖的碳原子，但不是核糖5元环的组成碳原子。我们发现，通过引入具有碱基的取代基至此5’碳原子，可以在保持基因表达抑制能力的同时改善核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性。基于这些发现，本说明书提供了以下手段。
(1)下式(1)或(2)表示的核苷衍生物、或其盐。
[化1]
(在式(1)中，R1表示氢原子、羟基、氢原子被烷基或烯基取代的羟基、或被保护基，在式(2)中，X表示卤素原子。在式(1)和式(2)中，R2和R3可以相同或不同，并且各自表示氢原子、羟基保护基、磷酸酯基(リン酸基)、被保护的磷酸酯基、或-P(＝O)nR5R6(其中n为0或1，并且R5和R6可以相同或不同，各自表示氢原子、羟基、被保护的羟基、巯基、被保护的巯基、低级烷氧基、氰基低级烷氧基、氨基或取代的氨基的任一个，但是当n为1时，R5和R6不都为氢原子)，
R4表示每一个均具有连接基团的NHR7(其中R7表示氢原子、烷基、烯基或氨基保护基)、叠氮基、脒基或胍基，并且B表示嘌呤-9-基、2-氧代-嘧啶-1-基、取代的嘌呤-9-基或取代的2-氧代-嘧啶-1-基中的任一个。)
(2)根据(1)所述的核苷衍生物或其盐，其中在上述式(1)和(2)中，R7表示氢原子或者R4表示具有连接基团的胍基。
(3)根据(1)或(2)所述的核苷衍生物或其盐，其中在上述式(1)和(2)中的R4的连接基团为C1-6亚烷基。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的核苷衍生物或其盐，其中在上述式(1)和(2)中，R4的连接基团为C1-6亚烷基，并且R7表示氢原子。
(5)一种用于寡核苷酸的细胞膜通透性赋予剂，其包含根据(1)至(4)中任一项所述的核苷衍生物。
(6)一种用于寡核苷酸的核糖核酸酶耐受性赋予剂，其包含根据(1)至(4)中任一项所述的核苷衍生物。
(7)一种寡核苷酸衍生物或其盐，其具有至少一个选自以下式(3)和式(4)的部分结构。
[化2]
(在式(3)中，R1表示氢原子、卤素原子、羟基、氢原子被烷基或烯基取代的羟基、或被保护的羟基，在式(4)中，X表示卤素原子。在式(3)和式(4)中，R4表示每一个均具有连接基团的NHR7(其中R7表示氢原子、烷基、烯基或氨基保护基)、叠氮基、脒基或胍基，并且B表示嘌呤-9-基、2-氧代-嘧啶-1-基、取代的嘌呤-9-基或取代的2-氧代-嘧啶-1-基中的任一个。)
(8)根据(7)所述的寡核苷酸衍生物或其盐，其具有至少两个所述部分结构。
(9)根据(7)或(8)所述的寡核苷酸衍生物或其盐，其具有至少三个所述部分结构。
(10)根据(7)至(9)中任一项所述的寡核苷酸衍生物或其盐，其具有至少3个和至多8个所述部分结构。
(11)根据(7)至(10)中任一项所述的寡核苷酸衍生物或其盐，其中所述寡核苷酸为寡核糖核苷酸。
(12)一种siRNA剂，其包含根据(7)至(11)中任一项所述的寡核苷酸衍生物或其盐作为活性成分。
附图说明
图1显示核糖核酸酶耐受性的评价结果。
图2显示由氨基烷基基团修饰引起的细胞膜通透性的评价结果。
图3显示由氨基烷基基团修饰引起的细胞膜通透性的另一评价结果。
具体实施方式
本说明书的公开涉及具有良好效用的作为RNA药物如siRNA的核苷衍生物或其盐，并涉及其用途。使用本说明书中公开的核苷衍生物或其盐(以下有时简称为“核苷衍生物”)，获得了足够的基因表达抑制能力，以及核糖核酸酶耐受性和优异的细胞膜通透性。因此，有可能提供适合于施用的寡核苷酸，而无需使用常规RNA药物中的载体如递送LNP。
核苷衍生物还可用作试剂，如使用RNA的检测探针。也就是说，可以提供适合各种RNA试剂的寡核苷酸。
本说明书中公开的核苷衍生物是基于预料不到的有用特征，这些特征是由于在核糖的5’位引入例如氨基烷基取代基的碱性取代基(这在过去很难完成)并调查其性质而发现的。也就是说，在过去核糖核酸酶耐受性通常是通过在核糖的2’或3’位进行取代来实现的。相比之下，通过取代本说明书中公开的核苷衍生物中的5’碳原子的氢原子而不是修饰核糖环的碳原子，可以使用本发明的核苷衍生物来维持寡核苷酸的siRNA活性，同时还提供了预料不到的高的核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性，这对于RNA药物等是有用的特征。
下面参照附图详细说明本说明书的公开的典型且非限制性的具体实例。这些详细说明仅旨在详细显示本说明书的公开的优选实例，使得它们可以由本领域技术人员实施，并且无意于限制本说明书的公开的范围。以下公开的附加特征和公开可以单独使用或与其他特征和教导一起使用，以提供进一步改进的核苷衍生物及其用途。
在下面的详细说明中公开的特征和步骤的组合对于以最广义的方式实施本说明书的公开不是必不可少的，并且仅出于解释本说明书的公开的典型实例的目的而呈现。此外，在提供说明书的公开的其它有用实施方案时，不必以与此处描述的特定实例相同的方式或以列出的顺序来组合上面和下面的典型实例的各种特征以及独立权利要求和从属权利要求中描述的各种特征。
在本说明书和/或权利要求书中描述的所有特征旨在作为单独的和独立的公开，其与实例和/或权利要求中描述的特征的构成分开地限制了原始公开和限定教导的要求保护的主题。而且，为了限制原始公开和限定教导的要求保护的主题，对数值范围和组或集合的所有描述旨在包括中间构成。
(核苷衍生物)
核苷衍生物可以是由下式(1)或下式(2)表示的核苷衍生物或其盐。可以通过本领域技术人员公知的方法将该核苷衍生物包括在寡核苷酸的部分结构中。
[化3]
因为该核苷衍生物在核糖和脱氧核糖的5’位具有碱性取代基，所以它可以具有电荷控制性，该特性使得至少一部分源自寡核苷酸的磷酸基团等的负电荷能够在具有衍生自核苷衍生物的部分结构的寡核苷酸中被中和。
还可以改善具有这种部分结构的寡核苷酸的细胞膜通透性。
此外，在具有衍生自核苷衍生物的部分结构的寡核苷酸中，也可以改善核糖核酸酶的耐受性。
在本说明书中，由式等表示的化合物的取代基中的“低级”是指构成取代基的碳原子数不大于10。例如，碳原子数通常为1至6，或者例如1至5，或者1至4，或者优选地1至3。
下面说明本说明书中公开的核苷衍生物或其盐及其用途。
(核苷衍生物及其盐)
核苷衍生物或其盐的一个实施方案是由下式(1)表示的核苷衍生物或其盐。
[化4]
核苷衍生物或其盐的另一个实施方案是由下式(2)表示的核苷衍生物或其盐。
[化5]
[R1]
在式(1)中，R1表示氢原子、羟基、氢原子被烷基或烯基取代的羟基、或被保护的羟基。当R1为氢原子时，核苷衍生物为脱氧核糖核苷衍生物。当R1为羟基、氢原子被烷基或烯基取代的羟基、或被保护的羟基时，核苷衍生物为核糖核苷衍生物。
[X]
在式(2)中，X表示卤素原子。卤素原子没有特别限制，但是可以为氯原子、碘原子、氟原子、溴原子等。当X为卤原子时，核苷衍生物为脱氧核糖核苷。从式(2)可知，虽然对卤素原子与核糖的2’碳原子的键合方向没有特别限定，但是优选以与天然核糖的羟基对应的方式连接卤素原子。
(烷基)
在本说明书中，烷基可以为直链、支链、环状或它们的组合的饱和烃基。通常低级烷基是优选的，C1-6低级烷基或C1-5低级烷基是更优选的，C1-4或C1-3低级烷基是特别合意的。直链C1-4烷基的合意示例包括甲基、乙基、正丙基和正丁基等，其中，优选甲基、乙基或正丙基，例如优选甲基或乙基，例如优选甲基。支链C1-4烷基的合意示例包括异丙基、异丁基、仲丁基和叔丁基等，其中，异丙基是特别合意的。环状C1-4烷基的示例包括环丙基、环丁基和环丙基甲基等。
(烯基)
在本说明书中，烯基可以为直链、支链、环状或它们的组合的饱和烃基。通常，低级烯基是优选的，并且低级烯基的示例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基和2-丁烯基等。
(羟基保护基或被保护的羟基)
在本说明书中，羟基保护基可以是本领域技术人员公知的，例如可以参考“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)”(John Wiley and Sons，2007)。羟基保护基的典型示例包括脂族酰基、芳族酰基、低级烷氧基甲基、任选具有合适取代基的氧基羰基、任选具有合适取代基的四氢吡喃基、任选具有合适取代基的四硫代吡喃基、被芳基取代的甲基(其中芳基可以是未被取代的或总共具有1至3个取代基)(其中取代的芳基中的取代基为低级烷基、低级烷氧基、卤素原子或氰基)、或甲硅烷基等。
在本说明书中，烷氧基可以为直链、支链、环状或它们的组合的饱和烷基醚基。低级烷氧基是优选的，并且低级烷氧基的示例包括C1-6低级烷氧基或C1-5低级烷氧基，其中C1-4或C1-3烷氧基是优选的，和C1-4烷氧基是特别优选的。C1-4烷氧基的示例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基等。其他优选的示例包括异丙氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。其他优选的示例包括环丙氧基、环丁氧基和环丙基甲氧基等。
在本说明书中，烷硫基可以为直链、支链、环状或它们的组合的饱和烷硫基。低级烷硫基是优选的，例如C1-6或C1-5低级烷硫基优选作为低级烷硫基、C1-4低级烷硫基或C1-3烷硫基是特别优选的。C1-4饱和烷硫基的优选示例包括甲硫基、乙硫基、正丙硫基和正丁硫基等。其他优选的示例包括异丙硫基、异丁硫基、仲丁硫基和叔丁硫基等。其他优选的示例包括环丙基硫基和环丁基硫基，并且环丙基甲硫基还是更优选的。
其中，特别优选的示例包括脂族酰基、芳族酰基和甲硅烷基。被未取代的芳基取代的甲基或被总共具有1至3个取代基的芳基取代的甲基(其中取代的芳基的取代基如上所述)也是优选的示例。
脂族酰基的示例包括烷基羰基、羧基烷基羰基、卤代低级烷基羰基和低级烷氧基低级烷基羰基。
烷基羰基中的烷基如上所述。也就是说，烷基羰基的示例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、正戊酰基(ペンタノイル基)、新戊酰基、戊酰基(バレリル基)、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、3-甲基壬酰基、8-甲基壬酰基、3-乙基辛酰基、3,7-二甲基辛酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、1-甲基十五烷酰基、14-甲基十五烷酰基、13,13-二甲基十四烷酰基、十七烷酰基、15-甲基十六烷酰基、十八烷酰基、1-甲基十七烷酰基、十九烷酰基、二十烷酰基和二十一烷酰基。其中，乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、正戊酰基或新戊酰基是优选的，乙酰基是特别优选的。羧基化烷基羰基中的烷基如上所述。可以适当地选择羧基化的取代位置等。也就是说，羧基化烷基羰基的示例包括琥珀酰基、戊二酰基和己二酰基。
卤代低级烷基羰基中的术语卤素、低级和烷基如上说明。卤素的取代位置等也可以适当选择。也就是说，卤代低级烷基羰基的示例包括氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基和三氟乙酰基。
低级烷氧基低级烷基羰基中的术语烷氧基、烷基和低级如上说明。低级烷氧基的取代位置等也可以适当选择。也就是说，例如低级烷氧基低级烷基羰基可以是甲氧基乙酰基。
芳族酰基的示例包括芳基羰基、卤代芳基羰基、低级烷基化的芳基羰基、低级烷氧基化的芳基羰基、羧基化的芳基羰基、硝化的芳基羰基和芳基化的芳基羰基。
芳基羰基的示例包括苯甲酰基、α-萘甲酰基和β-萘甲酰基，苯甲酰基是特别优选的。卤代芳基羰基的示例包括2-溴苯甲酰基和4-氯苯甲酰基。低级烷基化的芳基羰基的示例包括2,4,6-三甲基苯甲酰基、4-甲苯酰基、3-甲苯酰基和2-甲苯酰基。低级烷氧基化的芳基羰基的示例包括4-甲氧苯酰基、3-甲氧苯酰基和2-甲氧苯酰基。
羧基化的芳基羰基的示例包括2-羧基苯甲酰基、3-羧基苯甲酰基和4-羧基苯甲酰基。硝化的芳基羰基的示例包括4-硝基苯甲酰基、3-硝基苯甲酰基和2-硝基苯甲酰基。芳基化的芳基羰基的示例为4-苯基苯甲酰基。
低级烷氧基甲基的示例包括甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基和叔丁氧基甲基。甲氧基甲基是特别优选的。
任选具有合适取代基的氧基羰基的示例包括低级烷氧基羰基、被卤素或甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基、和烯氧基羰基。
低级烷氧基羰基的示例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基和叔丁氧基羰基异丁氧基羰基。被卤素或甲硅烷基取代的低级烷氧基羰基的示例包括2,2-三氯乙氧基羰基和2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基。
烯氧基羰基的示例包括乙烯氧基羰基。任选具有合适的取代基的四氢吡喃基的合意示例包括四氢吡喃-2-基或3-溴四氢吡喃-2-基，并且四氢吡喃-2-基是特别合意的。
任选具有合适的取代基的四硫代吡喃基的示例包括四氢硫代吡喃-2-基和4-甲氧基四氢硫代吡喃-4-基，并且四氢硫代吡喃-2-基是特别合意的。在任选被总共具有1至3个取代基的芳基取代的甲基中，取代或未取代的芳基的取代基的示例包括低级烷基和低级烷氧基、卤素和氰基。
任选被总共具有1至3个取代基的芳基取代的甲基的示例包括苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基、二苯基甲基、三苯基甲基和α-萘基二苯基甲基，并且苄基或三苯基甲基是优选的。其他示例包括9-蒽甲基-4-甲基苄基、2,4,6-三甲基苄基和3,4,5-三甲基苄基，并且2,4,6-三甲基苄基或3,4,5-三甲基苄基是优选的。其他示例包括4-甲氧基苄基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、和4,4’-二甲氧基三苯基甲基，并且4-甲氧基苄基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、和4,4’-二甲氧基三苯基甲基是优选的。其他示例包括4-氯苄基和4-溴苄基。另一个优选的示例为4-氰基苄基。
本说明书中的甲硅烷基的示例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二苯基丁基甲硅烷基和二苯基异丙基甲硅烷基苯基二异丙基甲硅烷基等。其中，三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或二苯基甲基甲硅烷基是优选的，三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或二苯基甲基甲硅烷基是特别优选的。
本说明书中的羟基保护基可以是指通过化学方法(例如，氢解、水解、电解、光解等)或生物学方法(例如，在人体中的水解，或在微生物中理论上诱导等)裂解和消除的取代基。通过氢解或水解消除的取代基作为羟基保护基是特别合意的。注意，被保护的羟基可以说是其中氢原子被这样的保护基团取代的羟基。
[R2和R3]
在式(1)和式(2)中，R2和R3可以相同或不同，并且各自表示氢原子、羟基保护基、磷酸酯基、被保护的磷酸酯基、或-P(＝O)n(R5)R6。上面已经说明了羟基保护基。
(被保护的磷酸酯基)
被保护的磷酸酯基团中的保护基是本领域技术人员公知的，并且可以参考上述参考文献和解释。
磷酸酯基的保护基的示例包括低级烷基、被氰基取代的低级烷基、被甲硅烷基取代的乙基、被卤素取代的低级烷基、低级烯基、被氰基取代的低级烯基、环烷基、被氰基取代的低级烯基、芳烷基、在芳基环上被硝基取代的芳烷基、在芳基环上被卤素取代的芳烷基、被低级烷基取代的芳基、被卤素取代的芳基、和被硝基取代的芳基。
低级烷基的示例如上所述。被氰基取代的低级烷基的示例包括2-氰基乙基和2-氰基-1,1-二甲基乙基，并且2-氰基乙基是特别优选的。被甲硅烷基取代的乙基的示例包括2-甲基二苯基甲硅烷基乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基和2-三苯基甲硅烷基乙基。
被卤素取代的低级烷基的示例包括2,2,2-三氯乙基、2,2,2-三溴乙基、2,2,2-三氟乙基和2,2,2-三氯乙基，并且2,2,2-三氯乙基是特别优选的。低级烯基的示例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基和2-丁烯基等。
被氰基取代的低级烯基的示例包括2-氰基乙基、2-氰基丙基和2-氰基丁烯基。芳烷基的示例包括苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基、茚基甲基、菲基甲基、蒽基甲基、二苯甲基、三苯甲基、1-苯乙基、2-苯乙基、1-萘乙基、2-萘乙基、1-苯丙基、2-苯丙基、3-苯丙基、1-萘丙基、2-萘丙基、3-萘丙基、1-苯基丁基、2-苯基丁基、3-苯基丁基和4-苯基丁基，其中苄基、二苯基甲基、三苯基甲基、1-苯乙基或2-苯乙基是更优选的，并且苄基是特别优选的。
在芳基环上被硝基取代的芳烷基的示例包括2-(4-硝基苯基)乙基、0-硝基苄基、4-硝基苄基、2,4-二硝基苄基和4-氯-2-硝基苄基等。
本说明书中的磷酸保护基可以是指通过化学方法(例如，氢解、水解、电解、光解等)或生物学方法(例如，在人体中的水解，或在微生物中理论上诱导等)裂解和消除的取代基。通过氢解或水解消除的取代基作为磷酸的保护基是特别合意的。
(-P(＝O)n(R5)R6)
本说明书的核苷类似物的R2和R4可以为-P(＝O)n(R5)R6，其中n为0或1，并且R5和R6可以相同或不同，各自表示氢原子、羟基、被保护的羟基、巯基、被保护的巯基、低级烷氧基、氰基低级烷氧基、氨基或取代的氨基。然而，当n为1时，R5和R6不都为氢原子。被保护的羟基和低级烷氧基如上说明。
(被保护的巯基)
被保护的巯基对本领域技术人员是公知的。除了以上作为羟基保护基的示例所给出的那些以外，被保护的巯基的示例包括烷硫基、芳硫基、脂族酰基和芳族酰基。脂族酰基或芳族酰基是优选的，芳族酰基的特别优选的。优选低级烷硫基作为烷硫基，并且合意的示例包括甲硫基、乙硫基和叔丁硫基。芳硫基的示例是苄硫基。芳族酰基的示例为苯甲酰基。
氰基低级烷氧基的优选示例包括氰基取代的直链、支链、环状或它们的组合的C1-5烷氧基(不包括氰基中的碳原子)，并且具体示例包括氰基甲氧基、2-氰基乙氧基、3-氰基丙氧基、4-氰基丁氧基、3-氰基-2-甲基丙氧基和1-氰基甲基-1,1-二甲基甲氧基等，其中2-氰基乙氧基是特别优选的。
R5和R6可以选择取代的氨基。这种氨基的取代基是低级烷氧基、低级烷硫基、氰基低级烷氧基或低级烷基中的任何一个。当R5和R6都是取代的氨基时，取代的氨基可以彼此不同。低级烷氧基、低级烷硫基、氰基低级烷氧基和低级烷基如上说明。
更具体地，-P(＝O)n(R5)R6的优选示例包括亚磷亚酰胺基(ホスホロアミダイト基)、H-磷酸酯基和磷酰基，并且亚磷亚酰胺基是特别合意的。
当n为0且R5和R6中的至少一个为取代的氨基，而另一个可以为任何基团时，-P(＝O)n(R5)R6为亚磷亚酰胺基。其中R5和R6之一为取代的氨基而另一个为低级烷氧基或氰基低级烷氧基的亚磷亚酰胺基是特别合意的，因为它在缩合反应中具有良好的反应效率。取代的氨基的优选示例包括二乙基氨基、二异丙基氨基和二甲基氨基，并且二异丙基氨基是特别合意的。作为R5和R6中的另一个的取代基的低级烷氧基的优选示例为甲氧基。氰基低级烷氧基的优选示例为2-氰基乙基。亚磷酰胺基的具体优选示例包括-P(OC2H4CN)(N(CH(CH3)2)和-P(OCH3)(N(CH(CH3)2)。
当n为1且R5和R6中的至少一个为氢原子而另一个可以为除氢原子以外的任何基团时，-P(＝O)n(R5)R6为H-磷酸酯基。除氢原子以外的取代基的示例包括羟基、甲基、甲氧基和巯基等，并且羟基是特别优选的。
当n为1且R5和R6均为低级烷氧基时，-P(＝O)n(R5)R6为磷酰基。R5和R6的低级烷氧基可以相同或不同。这些低级烷氧基的优选示例包括甲氧基和乙氧基。磷酰基的具体示例为-P(＝O)(OCH3)2。
核苷衍生物中R2的特别优选的示例为-P(＝O)n(R5)R6。-P(＝O)n(R5)R6优选表示亚磷亚酰胺基、H-磷酸酯基或磷酰基。R2也可以优选为磷酸酯基或被保护的磷酸酯基。R2的其他优选示例包括氢原子和羟基保护基。
R2的其他具体示例包括氢原子、乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、-P(OC2H4CN)(N(CH(CH3)2)、-P(OCH3)(N(CH(CH3)2)、或磷酰基。
在核苷衍生物中，优选氢原子或羟基保护基作为R3。例如，磷酸酯基、被保护的磷酸酯基或-P(＝O)n(R5)R6也是合意的。作为R3的具体示例，氢原子、乙酰基、苯甲酰基、苄基、对甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基是优选的。
[R4]
在式(1)和式(2)中，R4可以表示每一个均具有连接基团的NHR7、叠氮基、脒基或胍基。也就是说，NHR7、叠氮基、脒基和胍基各自通过连接基团与5’碳原子连接。
例如，连接基团可以表示具有1个或多个碳原子的二价烃基。也就是说，二价烃基的示例包括C1-8亚烷基和C2-8亚烯基。
用作连接基团的亚烷基可以为直链或支链的，但是优选是直链的。低级烷基是优选的，例如C1-6低级烷基，或优选C1-6低级烷基，或例如C2-4或C2-3低级烷基。直链C1-6烷基的示例包括亚甲基、亚乙基、丙烷-1,3-二基、正丁烷-1,1-二基、正戊基-1,5-二基和正己基-1,6-二基等。其他示例包括丁烷-1,2-二基等。特别合意的示例包括亚乙基、丙烷-1,3-二基和正丁烷-1,1-二基。
用作连接基团的亚烯基可以为直链或支链的，但是优选是直链的。例如，低级亚烯基是优选的，并且低级亚烯基的示例包括乙烯-1,2-二基、丙烯-1,3-二基和丁烯-1,4-二基等。
在式(1)表示的核苷衍生物中，从核酸酶耐受性和寡核苷酸衍生物的细胞膜通透性的角度来看，二价烃基是优选的，如亚乙基或具有2个或多个碳原子的其他亚烷基。此外，在式(2)表示的核苷衍生物中，从核酸酶耐受性和细胞膜通透性的角度来看，二价烃基也是合意的，例如亚乙基或具有1个或多个碳原子的其他亚烷基。
R7可以为氢原子、烷基、烯基、或氨基保护基。除了如上说明的烷基以外，烷基可以优选为低级烷基。除了如上说明的烯基以外，烯基可优选为低级烯基。如果R7为氢原子或这些基团之一，则连接基团优选为具有例如至少2个，或至少3个，或至少4个碳原子，且例如不大于6个，或不大于5个碳原子，或不大于4个碳原子的亚烷基。
当R7为氢原子时，R4为具有连接基团的NH2(氨基)，这是指当该连接基团为亚烷基或亚烯基时，R3为氨基烷基或氨基烯基。当R4是式(1)和式(2)中的氨基烷基等时，具有衍生自核苷衍生物的单体单元的核苷衍生物和寡核苷酸衍生物可以显示与根据周围pH环境改变电荷的性质相关的带电性。例如，电荷在酸性条件下可以是阳离子，但是在生理条件下在中性环境中可以将正电荷还原为零电荷。也就是说，由于该电荷控制能力，可以根据需要使核苷衍生物的电荷动态化，或者可以通过改变pH环境赋予期望的电荷。因此，使用本发明的这种核苷衍生物，可以以不同于以前的方式或以更大的自由度来控制寡核苷酸的电荷。因此，本发明的其中R3为这样的氨基烷基等的核苷衍生物可用作寡核苷酸等的电荷(正电荷)赋予剂或电荷控制剂。
R3可以是叠氮基、脒基或换言之CH3(NH)C(NH)-(脒减去氨基的一个氢原子)、或胍基或换言之NH2(NH)C(NH)-(胍减去氨基的一个氢原子)，每一个均具有连接基团。其中，其可以是例如胍基。当R3具有这些基团时，连接基团可以是例如具有至少1个或至少2个碳原子的亚烯基或亚烷基。当R4为具有连接基团的脒基或胍基时，它总是阳离子性的，与上述氨基烷基的情况不同。当这种核苷衍生物与本发明的其中R4是氨基烷基等的核苷衍生物组合使用时是有用的。
氨基的保护基是本领域技术人员公知的，并且可以参考上述参考文献。除了以上作为羟基保护基的示例所给出的那些以外，示例包括苄基、甲基苄基、氯苄基、二氯苄基、氟苄基、三氟甲基苄基、硝基苄基、甲氧基苯基、甲氧基甲基(MOM)、N-甲基氨基苄基、N,N-二甲基氨基苄基、苯甲酰基甲基(phenacyl)、乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、邻苯二甲酰亚氨基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基(BOM)和2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEM)基团等。苄基、甲氧基苯基、乙酰基、三氟乙酰基(TFA)、新戊酰基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基(Boc)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基甲基(BOM)或2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEM)是优选的，并且苄基、甲氧基苯基、乙酰基、苯甲酰基或苄氧基甲基是特别优选的。
在本发明中的氨基的保护基还可以指通过化学方法(例如，氢解、水解、电解、光解等)或生物方法(例如，在人体中水解，或在微生物中理论上诱导等)裂解和消除的取代基。通过氢解或水解消除的取代基作为氨基保护基是特别合意的。
[B：碱基]
核苷衍生物中的B：碱基可以是已知的天然碱基或人工碱基。例如，B可以选自嘌呤-9-基、2-氧代-嘧啶-1-基、取代的嘌呤-9-基和取代的2-氧代-嘧啶-1-基。
也就是说，B的示例包括嘌呤-9-基和2-氧代-嘧啶-1-基，以及2,6-二氯嘌呤-9-基和2-氧代-嘧啶-1-基。其他示例包括2-氧代-4-甲氧基-嘧啶-1-基、4-(1H-1,2,4-***-1-基)-嘧啶-1-基、和2,6-二甲氧基嘌呤-9-基。
其他示例包括2-氧代-4-氨基-嘧啶-1-基(其中氨基是被保护的)、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基(其中氨基是被保护的)、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(其中氨基是被保护的)、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(其中氨基和/或羟基是被保护的)、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基(其中氨基被保护的)、6-氨基嘌呤-9-基(其中氨基是被保护的)、和4-氨基-5-甲基-2-氧代-嘧啶-1-基(其中氨基是被保护的)。羟基和氨基的各个保护基如上说明。
其他示例包括6-氨基嘌呤-9-基(腺嘌呤)、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(胍)、2-氧代-4-氨基嘧啶-1-基(胞嘧啶)、2-氧代-4-羟基嘧啶-1-基(尿嘧啶)和2-氧代-4-羟基-5-甲基嘧啶-1-基(胸腺嘧啶)。
仍然的其他示例包括4-氨基-5-甲基-2-氧代-嘧啶-1-基(甲基胞嘧啶)、2,6-二氨基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-嘧啶-1-基、和2-氧代-4-巯基-嘧啶-1-基。
还有的其他示例包括6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、和2-氨基-6-溴嘌呤-9-基。
取代的嘌呤-9-基或取代的2-氧代-嘧啶-1-基中的各个取代基可以为羟基、被保护的羟基、低级烷氧基、巯基、被保护的巯基、低级烷硫基、氨基、被保护的氨基、被低级烷基取代的氨基、低级烷基、低级烷氧基甲基、卤素原子中的任何一个、或它们的组合。这些取代基已经在上面进行了说明。
优选取代的嘌呤-9-基或取代的2-氧代-嘧啶-1-基(其中取代基为如上说明)作为核苷衍生物中的B，但添加***基或低级烷氧基甲基也是合意的。
取代的嘌呤-9-基的合意示例包括6-氨基嘌呤-9-基、2,6-二氨基嘌呤-9-基、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基、6-氨基-2-甲氧基嘌呤-9-基、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基和6-巯基嘌呤-9-基。如果取代基包含氨基或羟基，则合意的示例包括其中这些氨基和/或羟基是被保护的取代基。
取代的2-氧代-嘧啶-1-基的示例包括2-氧代-4-氨基-嘧啶-1-基、1H-(1,2,4-***-1-基)-嘧啶-1-基、4-1H-1,4-氨基-2-氧代-5-氯-嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-5-甲基嘧啶-1-基、4-氨基-5-甲基-2-氧代-嘧啶-1-基等。
其他合意的示例包括2-氧代-4-甲氧基-嘧啶-1-基和4-(1H-1,2,4-***-1-基)-嘧啶-1-基。
在这些B碱中，合意的示例包括如果取代基中存在氨基或羟基则其中氨基或羟基是已被保护的取代基。
核苷衍生物也可以是盐。盐的形式没有特别限制，但是常见的示例包括酸加成盐，并且盐也可以采取分子间反离子的形式。取决于取代基的类型，它也可以采取碱加成盐的形式。盐优选是药理学上可接受的盐。用于形成药理学上可接受的盐的酸和碱的类型是本领域技术人员公知的，并且可以参考J.Pharm.Sci.,1-19(1977)中所述的那些等。酸加成盐的示例包括无机酸盐和有机酸盐。当一个或多个取代基包含酸性部分时，碱加成盐可以是优选的。
无机酸盐的示例包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐等。通常，盐酸盐或磷酸盐是优选的。有机酸盐的示例包括乙酸盐、三氟乙酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。通常，乙酸盐等是优选的。碱加成盐的示例包括碱金属盐、碱土金属盐、有机胺盐和氨基酸加成盐。
碱金属盐的示例包括钠盐、钾盐等。碱土金属盐的示例包括镁盐、钙盐等。有机胺盐的示例包括三乙胺盐、吡啶盐、普鲁卡因盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐等。氨基酸加成盐的示例包括精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐、丝氨酸盐、甘氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。
核苷衍生物或其盐可以是水合物或溶剂化物的形式，并且这些物质也在本说明书的公开范围内。核苷衍生物或其盐可以由本领域技术人员通过公知的方法或按照下面的合成实施例容易地制备。
当作为寡核苷酸的至少一部分引入时，核苷衍生物可以改善单链或双链寡核苷酸的核酸酶耐受性，并且还可以改善对于哺乳动物细胞等的细胞膜通透性。也就是说，核苷衍生物本身可用作核酸酶耐受性改善剂和/或细胞膜通透性赋予剂。核苷衍生物还可以在4’位具有碱性取代基。因此，通过调节源自寡核苷酸等中的磷酸酯基团的负电荷，它可以用作正电荷赋予剂或电荷控制剂。
(寡核苷酸衍生物及其盐)
本说明书中公开的寡核苷酸衍生物(以下有时称为“寡核苷酸衍生物”)可以含有至少1个式(3)或(4)表示的部分结构。式(3)和式(4)表示的部分结构可以分别基于式(1)和(2)表示的核苷衍生物、或其盐来获得。
[化6]
式(3)和式(4)表示的部分结构中的R1、X、R4和B如式(1)和式(2)中所定义。
式(3)和式(4)表示的2个或多个部分结构也可以包含在寡核苷酸衍生物中。在这种情况下，这些部分结构可以相同或不同。此外，寡核苷酸衍生物中包含的全部的部分结构可以仅由式(3)表示的部分结构组成，或者仅由式(4)表示的部分结构组成。它们还可包含式(3)表示的1或2个或多个部分结构和式(4)表示的1或2个或多个部分结构。
就式(3)和(4)表示的部分结构的排列而言，它们可以彼此相邻排列或彼此分开排列。例如，本发明的寡核苷酸衍生物可以具有至少三个该部分结构。在这种情况下，部分结构可以大致均等地提供在寡核苷酸衍生物的5’末端、中心和3’末端，尽管不一定是这种情况。对于在寡核苷酸衍生物的这些位置上均等地提供的部分结构，未必意味着在每个位置上提供相同数目的部分结构，并且在每个位置上提供至少一个部分结构就足够了。例如，如果在每个位置上提供大约1至3个的部分结构，则认为它们被均等地提供。例如，当将寡核苷酸衍生物用作siRNA时，其链长通常为18聚体至25聚体，或典型为21聚体至23聚体。寡核苷酸衍生物可以具有至少4个，或例如5个，或例如6个部分结构。寡核苷酸衍生物也可以具有例如不大于8个，或例如不大于7个，或例如不大于6个的部分结构，尽管这不是特别的限制。
由于式(3)表示的部分结构的糖链部分衍生自核糖或脱氧核糖，所以寡核苷酸衍生物可以是寡核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸衍生物也可以是包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的嵌合体。
寡核苷酸衍生物本身是单链的，但是它也可以采取杂合形式，或者换言之是与寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸和寡脱氧核糖/核糖核苷酸形成的双链形式(嵌合链)。
核苷酸衍生物还可以具有与天然核苷酸、已知的核苷衍生物和/或已知的核苷酸衍生物等相对应的其他部分结构，作为式(3)和式(4)表示的那些以外的部分结构。本说明书中规定的部分结构和其他部分结构可以通过磷酸二酯键、磷酸单酯键或硫代磷酸酯键等连接在一起。
就部分结构和其他核苷衍生物的单元数目而言，本发明的寡核苷酸衍生物可具有至少2个此类单元，或优选至少8个，或特别至少15个此类单元。没有特定的最大值，但是单元数可以例如不大于100，或者不大于80，或者不大于60，或者不大于50，或者不大于40，或者不大于30，或者不大于20。
寡核苷酸衍生物在式(3)和式(4)表示的部分结构以及其他部分结构中可以具有一个或多个不对称中心，并且类似地，当存在立体异构体时，本发明的范围涵盖立体异构体的任何混合物或外消旋混合物。互变异构体也可以存在。
寡核苷酸衍生物也可以是盐。盐的形式没有特别限制，并且合意的示例包括药理学上可接受的盐。上述本发明的核苷衍生物的盐的实施方案可以应用于盐。寡核苷酸衍生物或其盐可以是水合物或溶剂化物的形式，并且这些包括在本发明的范围内。
(制备核苷衍生物和寡核苷酸衍生物)
基于下面具体的合成实施例以及截至申请日的核苷和寡核苷酸的已知合成技术，本领域技术人员可以容易地合成本发明的核苷衍生物和寡核苷酸衍生物。
本发明的核苷衍生物和寡核苷酸衍生物可以通过例如以下方法制备，但是用于制备本发明的核苷类似物和寡核苷酸类似物的方法不限于以下方法。
各个反应中的反应时间没有特别限制，并且由于可以通过下述分析方法容易地追踪反应的进程，因此可以在目标产物的收率达到最大时终止反应。此外，根据需要，各反应还可以在惰性气体气氛如氮气流或氩气流中进行。当在各个反应中需要用保护基进行保护或随后的脱保护时，这些反应可以通过下述方法适当地完成。
在本说明书中，Bn表示苄基，Ac表示乙酰基，Bz表示苯甲酰基，PMB表示对甲氧基苄基，Tr表示三苯甲基，TBAF表示四丁基氟化铵，TEMPO表示2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基，DDQ表示2,3-二氯-5,6-二氰基对苯醌，PPH3表示三苯基膦，BCl3表示三氯化硼，THA表示三氟乙酰基，TSO表示甲苯磺酰氧基，MMTr表示4-甲氧基三苯基甲基，DMTr表示4,4’-二甲氧基三苯基甲基，TMS表示三甲基甲硅烷基，TBDMS表示叔丁基二甲基甲硅烷基，TBDPS表示叔丁基二苯基甲硅烷基，MOM表示甲氧基甲基，BOM表示苄氧基甲基，且SEM表示2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基。
例如，可以根据以下合成方案合成核苷衍生物的一个示例。该方案是使用葡萄糖作为起始原料合成胸腺嘧啶核糖核苷衍生物，然后合成用于合成寡核苷酸衍生物的亚磷亚酰胺试剂的方案的示例。
[化7]
化合物1通过常规方法由葡萄糖获得。化合物3至20可以根据Bioorganic&MedicalChemistry 11(2003),211-2226、Bioorganic&Chemistry Letters(1999),2667-2672、TheJournal of Organic Chemistry 2013,78,9956-9962、HELVATICA CHIMICA ACTA Vol.83(2000),128-151等，以及Bioorganic&Medical Chemistry 11(2003),211-2226,Bioorganic&Chemistry Letters(1999),2667-2672和Nucleic Acids Research,43,(2015),2993-3011的描述由化合物1获得。
具有式(3)和式(4)表示的部分结构的本发明的寡核苷酸衍生物可以通过使用式(1)或式(2)表示的各种核苷衍生物作为亚酰胺试剂等容易地制备。也就是说，可以用已知的DNA合成仪由这种核苷衍生物合成本发明的寡核苷酸衍生物，可以用柱纯化所得的寡核苷酸衍生物，并且可以通过反相HPLC或MALDI-TOF-MS分析产物的纯度以获得纯化形式的寡核苷酸衍生物。将寡核苷酸衍生物制成酸加成盐的方法是本领域技术人员公知的。
因为寡核苷酸衍生物经由连接基团在核糖5’位具有特定的含N基团，所以可以控制RNA的净电荷，可以增加脂肪溶解度(范德华力分子间力)，并且可以降低dsRNA融解温度，同时充分维持RNA功能如体内RNA干扰。因此可以同时改善核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性。也可以中和源自磷酸酯基团等的负电荷，并调节总电荷。
例如，可以在本发明的寡核苷酸衍生物中提供至少一个该部分结构，或者可以提供两个部分结构。通过提供多个这些部分结构，可以有效地改善或调节细胞膜的通透性、核糖核酸酶耐受性等。本发明的寡核苷酸衍生物也可以具有至少3个这些部分结构。
在寡核苷酸衍生物中具有1个或2个或多个部分结构的位点没有特别限制，并且可以是5’末端或3’末端或两者。5’末端和3’末端是包含适当数量的从寡核苷酸的聚合物链的每个末端延伸的核苷酸的区域，并且是每个由例如不大于30％的聚合物链的总结构单元组成的区域。从每个末端开始的范围的百分比根据聚合物链的总长度而不同，并且例如可以不大于25％，或者不大于20％，或者不大于10％，或者不大于5％。更具体地，5’末端和3’末端可以是例如衍生自1至30、或1至25个、或1至20个、或1至15个、或1至10个、或1至8个、或1至6个、或1至5个、或1至4个、或1至3个、或1至2个例如在寡核苷酸的每个末端的核苷衍生物的结构单元的区域。寡核苷酸衍生物可以在这些末端区域的任一个中具有1个或2个或多个部分结构，2个或多个是优选的。此外，寡核苷酸衍生物可以在5’末端或3’末端(也就是说，作为从每个末端开始的第一结构单元)或在两个末端都具有部分结构。
在寡核苷酸衍生物中，也可以在5’末端和3’末端以外的部分的中心具有1个或2个或多个的部分结构。当寡核苷酸衍生物在中心具有部分结构时，核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性甚至更容易改善或调节。从整体上调节寡核苷酸的电荷也变得更加容易。
寡核苷酸衍生物还可以在中心以及5’末端和3’末端中的一个或两个中具有部分结构。优选地，可以在5’末端、3’末端和中心的全部具有1个或2个或多个部分结构。通过这样总体上或多或少地均匀地分配部分结构，可以改善核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性以及电荷控制性。在寡核苷酸衍生物的中心提供2个或多个部分结构对于改善特性是有用的。
衍生自式(3)表示的核糖核苷衍生物的部分结构或衍生自式(4)表示的脱氧核糖核苷酸衍生物的部分结构可以用作寡核苷酸衍生物中的部分结构。式(3)表示的核糖核苷衍生物和式(4)的部分结构可以用作核糖核苷衍生物的替代物，因为它们包含RNA碱基(尿嘧啶(U)等)作为B碱基。
从核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性以及电荷控制的角度来看，在部分结构中，式(3)和式(4)中的R4优选具有NHR7，其含有具有1个或2个或多个碳原子的亚烷基作为连接基团。在这种情况下，R7可以是氢原子或具有大约C1-6烷基的酰基。该亚烷基可以为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基等。例如，它也可以是亚乙基、亚丙基、亚丁基等。例如，它也可以是亚乙基、亚丙基等。通过使用亚乙基或亚丙基作为连接基团，相比于使用亚甲基所获得的，可以获得更大的核糖核酸酶耐受性、细胞膜通透性和电荷控制性。
部分结构也可以是具有连接基团的脒基、叠氮基或胍基。具有这样的官能团，可以获得高的核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性。在这种情况下，连接基团可以为具有1个或多个碳原子的亚烷基。
在部分结构中，式(3)和式(4)中的R4的连接基团优选为大约C1-6烷基，并且碳数的下限优选为至少2个，或更优选为至少3个。这种结构对于获得核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性是有效的。
优选地，寡核苷酸衍生物具有至少6个部分结构。具有6个或更多对获得核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性以及电荷控制性有效。
寡核苷酸衍生物可以例如用作siRNA。也就是说，形成双链的寡核苷酸衍生物可与体内成分(RISC蛋白)形成复合物并且序列特异性地切割mRNA，使得mRNA上的信息不再能被核糖体翻译成特异性蛋白。还认为它可以并入作为miRNA的成分或作为适体RNA的成分，因此可以被使用同时提供改善的核糖核酸酶耐受性和细胞膜通透性的特征。它还可以与其他化合物连接形成缀合物。此外，寡核苷酸衍生物也可以用作核酶的成分。而且，寡核苷酸衍生物可用于试剂如RNA芯片。
因此，由于寡核苷酸衍生物具有天然核苷酸中未发现的性质，因此，预期寡核苷酸衍生物比天然核苷酸作为通过抑制基因作用来治疗疾病的各种RNA药物(例如抗肿瘤剂和抗病毒剂)的组分更有用。也就是说，寡核苷酸衍生物可用作这类RNA药物以及用作原料或中间试剂。此外，核苷衍生物可用作这类RNA药物的原料或中间体。
本领域技术人员可以参照下面的实施方案以及申请时的公知方法容易地评价寡核苷酸衍生物的电荷控制性、核糖核酸酶耐受性、细胞膜通透性和电荷控制能力以及含有该寡核苷酸衍生物的各种RNA的生物活性。
实施例
下面将实施方案描述为用于详细解释本说明书的公开的具体实施例。以下实施方案是为了解释本说明书的公开，并且不限制其范围。
第一实施方案
(1)2’OCH3-5’氨基丙基亚酰胺单元和树脂的合成
根据以下方案合成2’OCH3-5’氨基丙基亚酰胺单元和树脂。
[化8]
1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-阿洛呋喃糖(allofuranose)(1)
使用葡萄糖作为起始原料，通过公知的方法(Bioorganic&Medical Chemistry11(2003),211-2226,Bioorganic&Chemistry Letters(1999),2667-2672)合成目标物质1。
6-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-阿洛呋喃糖(2)
在Ar气氛中将7.25g(21.3mmol)化合物(1)溶解于72mL的吡啶中，加入6.09mL(23.4mmol)TBDPSCl，并于室温搅拌16小时30分钟。用EtOAc和饱和NaHCO3水溶液从反应溶液中萃取产物，将有机层用蒸馏水和饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶1)，得到无色油状化合物(2)(11.34g，19.6mmol，92％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.69-7.65(m,4H),7.44-7.35(m,6H),7.19-7.17(m,2H),6.81-6.80(m,2H),5.71(d,J＝4.2Hz,1H),4.58(d,J＝11Hz,1H),4.48(t,J＝4.1Hz,1H),4.43(d,J＝11.7Hz,1H),4.06(dd,J＝8.6Hz,3.4Hz,1H),4.02-4.04(m,1H),3.89(dd,J＝8.6Hz,4.8Hz,1H),3.79(s,3H),3.75-3.73(m,2H),2.55(d,J＝3.5Hz,1H),1.55(s,3H),1.34(s,3H),1.06(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ159.5,135.8,135.7,129.9,129.9,129.8,127.9,113.9,113.0,104.2,78.0,77.9,77.3,72.1,71.9,64.7,55.4,27.0,27.0,26.7,19.4；HRMS(ESI)m/z C33H42NaO7Si(M+Na)+计算值601.25975；测量值601.25809。
5-O-苄基-6-O-[((1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-阿洛呋喃糖(3)
在Ar气氛中将11.34g(19.6mmol)化合物(2)溶解于113mL DMF中，加入1.57g(39.2mmol)NaH，并于室温搅拌30分钟。将其用冰浴冷却，加入4.66mL(39.2mmol)BnBr和0.59g(3.92mmol)NaI，并使混合物回到室温，然后于90℃搅拌5小时。五小时后，将其用冰浴冷却，并在加入10mL MeOH后搅拌20分钟。用EtOAc和饱和NaHCO3水溶液从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝7∶1)，得到黄色油状化合物(3)(8.69g，13.0mmol，66％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.68-7.64(m,4H),7.44-7.39(m,2H),7.35-7.31(m,5H),7.30-7.26(m,5H),7.12-7.10(m,2H),6.76-6.74(m,2H),5.67(d,J＝4.1Hz,1H),4.47(d,J＝11.6Hz,1H),4.68(d,J＝11.6Hz,1H),4.54(d,J＝11.6Hz,1H),4.47(t,J＝4.1Hz,1H),4.38(d,J＝11.0Hz,1H),4.26(dd,J＝8.2Hz,2.1Hz,1H),4.00-3.96(m,2H),3.80-3.79(m,2H),3.78(s,3H),1.57(s,3H),1.34(s,3H),1.04(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:159.4,139.3,135.8,135.8,133.7,133.6,129.9,129.7,128.3,127.8,127.8,127.6,127.4,113.8,113.0,104.2,79.6,78.0,74.1,71.7,64.1,55.4,27.1,27.0,26.8,19.3,14.3；HRMS(ESI)m/z C40H48NaO7Si(M+Na)+计算值691.30670；测量值691.30739。
5-O-苄基-1,2-O-亚亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-呋喃呋喃糖(4)
在Ar气氛中将3.67g(5.49g)化合物(3)溶解在37mL THF中，加入1M TBAF(8.24mmol)，并将混合物于室温搅拌19小时。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶1)，得到澄清的油状化合物(4)(2.11g，4.91mmol，89％)。
1HNMR(600MHz,CDCl3)δ:7.34-7.32(m,2H),7.30-7.28(m,5H),6.88-6.86(m,2H),5,72(d,J＝4.1Hz,1H),4.72(d,J＝12.4Hz,1H),4.70(d,J＝11.0Hz,1H),4.64(d,J＝11.7Hz,1H),4.56(t,J＝3.42,1H),4.50(d,J＝11.7Hz,1H),4.21(dd,J＝8.94Hz,2.04Hz,1H),4.03(dd,J＝8.9Hz,4.1Hz,1H),3.89-3.87(m,1H),3.80(s,3H),3.67-3.65(m,2H),2.42(t,J＝5.5Hz,1H),1.59(s,1H),1.36(s,1H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:159.6,138.5,129.9,128.9,128.3,127.6,127.5,113.8,112.9,104.0,80.0,77.9,77.2,76.3,73.3,71.7,61.9,55.2,26.8,26.5；HRMS(ESI)m/z C24H30NaO7(M+Na)+计算值453.18892；测量值453.18636。
(R)-5-O-苄基-5-C-[2-乙氧基羰基-(E)-乙烯基]-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-核糖(5)
将4.47g(10.4mmol)化合物(4)溶于17.3mL CH2Cl2中，并用冰浴冷却。加入16mg(0.10mmol)TEMPO和0.5mL 2M KBr水溶液，并将混合物在冰浴中搅拌。将0.15g NaHCO3溶解在8.5mL NaClO水溶液中，将其加入反应溶液中，然后在冰浴中搅拌40分钟。将反应溶液在CHCl3和蒸馏水之间分配，并将有机层用10％HCl水溶液、10％Na2S2O3水溶液、蒸馏水和饱和NaCl水溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂。在Ar气氛中，将所得残余物溶于25mL THF中的2.43mL(EtO)2P(O)CH2COOEt中，加入0.49g NaH，并将该混合物在冰浴中搅拌10分钟。滴加溶解在25mL THF中的残余物，并于室温搅拌30分钟。加入30mL蒸馏水并于室温搅拌。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶1)，得到黄色油状化合物(5)(4.15g，8.33mmol，80％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.34-7.32(m,2H),7.29-7.27(m,3H),7.23-7.22(m,2H),6.86-6.83(m,3H),5.88(d,J＝13.7Hz,1H),5.71(d,J＝4.1Hz,1H),4.63(d,J＝11.7Hz,1H),4.62(d,J＝11.6Hz),4.50(m,2H),4.21(d,J＝11.6Hz,1H),4.26-4.22(m,2H),4.19(q,J＝6.9Hz,2H),3.82-3.80(m,1H),3.80(s,3H),1.58(s,3H),1.35(s,3H),1.29(t,J＝7.6Hz,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:165.9,159.6,143.6,138.0,130.0,129.6,128.5,127.8,127.8,123.8,114.0,113.3,104.4,80.8,77.6,77.2,76.6,72.2,71.8,60.6,55.4,27.1,26.8,14.4；HRMS(ESI)m/z C28H34NaO8(M+Na)+计算值521.21514；测量值521.21582。
(R)-5-O-苄基-5-C-[2-乙氧基羰基乙基]-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-核糖(6)
将5.07g(10.1mmol)化合物(5)溶于25mL EtOAc中，加入1.45g(13.6mmol)5％Pd/C和3.18g(50.5mmol)甲酸铵，并于室温搅拌混合物5小时30分钟。通过硅藻土过滤反应溶液，并在减压下蒸馏滤液。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶1)，得到澄清的油状化合物(6)(4.57g，9.13mmol，90％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.34-7.27(m,5H),7.23-7.22(m,2H),6.85-6.83(m,2H),5.65(d,J＝3.4Hz,1H),4.67(d,J＝11.7Hz,1H),4.65(d,J＝11.7Hz,1H),4.52(d,J＝11.7Hz,1H),4.50(d,J＝11.0Hz,1H),4.48(t,J＝4.1Hz,1H),4.17(dd,J＝8.94Hz,2.1Hz,1H),3.94(dd,J＝8.6Hz,4.1Hz,1H),3.78(s,3H),3.73-3.70(m,1H),2.42-2.37(m,1H),2.33-2.28(m,1H),1.96-1.90(m,1H),1.80-1.74(m,1H),1.57(s,3H),1.33(s,3H),1.20(t,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:173.5,159.5,138.9,129.9,129.8,128.4,127.8,127.5,113.9,113.0,104.0,81.1,77.9,77.3,77.1,73.5,71.9,60.5,60.4,55.4,31.0,27.1,26.8,26.2,14.3；HRMS(ESI)m/z C28H36KO8(M+K)+计算值539.20472；测量值539.20262。
(R)-5-O-苄基-5-C-羟丙基-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-核糖(7)
在Ar气氛的冰浴中，将35mL THF加入到0.55g(14.4mmol)LiAlH 4中，并搅拌。滴加3.61g化合物(6)溶于10mL THF的溶液，并在冰浴中搅拌30分钟。加入(+)-酒石酸钾钠四水合物的饱和水溶液，并于室温搅拌30分钟。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶1)，得到澄清的油状化合物(7)(3.28g，7.14mmol，99％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.35-7.27(m,7H),6.87-6.85(m,2H),5.67(d,J＝3.7Hz,1H),4.71(d,J＝11.9Hz,1H),4.68(d,J＝12.8Hz,1H),4.56(d,J＝11.5Hz,1H),4.51(t,J＝4.1Hz,1H),4.49(d,J＝11.0Hz,1H),4.20(dd,J＝8.7Hz,1.8Hz,1H),3.96(dd,J＝8.7Hz,4.6Hz,1H),3.80(s,3H),3.72-3.69(m,1H),3.57-3.53(m,1H),1.70-1.63(m,2H),1.59(s,3H),1.56-1.52(m,1H),1.45-1.42(m,1H),1.36(s,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:159.5,138.9,129.9,129.8,128.4,127.9,127.6,113.9,113.0,104.0,88.2,78.2,77.9,77.0,73.5,71.8,62.8,55.4,29.6,27.4,27.1,26.8；HRMS(ESI)m/z C26H34NaO7(M+Na)+计算值481.22022；测量值481.22082。
(R)-5-O-苄基-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-5-C-对甲苯磺酰氧基丙基-α-D-核糖(8)
在Ar气氛中将0.10g(0.23mmol)化合物(7)溶于1.0mL CH2Cl2中，并在冰浴中搅拌。加入0.15g p-TsCl和0.13mL吡啶，并将混合物于室温搅拌3小时。用CHCl3和饱和NaHCO3从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶1)，得到澄清的油状化合物(8)(0.13g，0.217mmol，96％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.74(d,J＝8.3Hz,2H),7.32-7.27(m,5H),7.25-7.21(m,4H),6.88-6.85(m,2H),5.65(d,J＝4.1Hz,1H),4.64(d,J＝11.7Hz,2H),4.50(t,J＝4.1Hz,1H),4.46(d,J＝11.6Hz,1H),4.46(d,J＝12.4Hz,1H),4.10(dd,J＝6.5Hz,2.1Hz,1H),3.94-3.87(m,3H),3.81(s,3H),3.59-3.58(m,1H),2.42(s,3H),1.82-1.74(m,1H),1.64-1.59(m,2H),1.56(s,3H),1.47-1.42(m,1H),1.35(s,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:159.6,144.8,138.8,133.2,129.9,129.9,129.7,128.4,128.0,127.8,127.6,113.9,113.0,104.0,81.1,77.8,77.4,77.0,73.4,71.8,70.6,60.5,55.4,27.1,26.9,26.8,25.7,21.8,21.2,14.3；HRMS(ESI)m/z C33H40NaO9S(M+Na)+计算值635.22907；测量值635.22816。
(R)-5-C-叠氮基丙基-5-O-苄基-1,2-O-亚异丙基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-核糖(9)
在Ar气氛中将4.10g(6.70mmol)化合物(8)溶解在40mL的DMF中，加入3.65g(56.2mmol)NaN3并于60℃搅拌。用EtOAc和饱和NaCl水溶液从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝5∶1)，得到澄清的油状化合物(9)(2.63g，5.43mmol，81％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.34-7.27(m,7H),6.88-6.85(m,2H),5.68(d,J＝3.4Hz,1H),4.70(d,J＝11.6Hz,1H),4.67(d,J＝11.7Hz,1H),4.54(d,J＝11.7Hz,1H),4.52(t,J＝4.1Hz,1H),4.49(d,J＝11.6,1H),4.17(dd,J＝8.6Hz,1.4Hz,1H),3.96(dd,J＝8.6Hz,4.8Hz,1H),3.80(s,3H),3.70-3.68(m,1H),3.17(t,J＝6.8Hz,2H),1.75-1.64(m,2H),1.59(s,3H),1.53-1.46(m,2H),1.36(s,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:159.6,138.9,129.9,129.8,128.4,127.9,127.6,113.9,113.0,104.0,81.2,77.9,77.5,77.1,73.5,71.8,55.4,51.5,28.2,27.1,26.8,25.7；HRMS(ESI)m/z C26H33N3NaO6(M+Na)+计算值506.22670；测量值506.22941。
(R)-5-C-叠氮基丙基-5-O-苄基-1,2-O-二乙酰基-3-O-(4-甲氧基苄基)-α-D-核糖(10)
将化合物(9)溶解在50％乙酸水溶液中，并于70℃搅拌24小时。加入EtOH，减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到澄清的油状化合物(2.07g，4.67mmol，60％)。在Ar气氛中将该化合物溶于10.1mL吡啶中，加入6.7mL(72.4mmol)Ac2O，并将混合物于室温搅拌6小时。将反应溶液用冰浴冷却，并置于冰水中。用EtOAc和蒸馏水萃取反应溶液，将有机层用饱和NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝4∶1)，得到化合物(10)(6.49g，10.5mmol，97％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.36-7.27(m,5H),7.20(d,J＝8.3Hz,2H),6.86-6.85(m,2H),6.11(s,1H),5.33(d,J＝4.8Hz,1H),4.71(d,J＝11.7Hz,1H),4.55(d,J＝11.7Hz,1H),4.53(d,J＝10.3Hz,1H),4.41(d,J＝10.3Hz,1H),4.40(dd,J＝8.3Hz,4.8Hz,1H),4.15(dd,J＝2.8Hz,7.6Hz,1H),3.80(s,3H),3.67-3.65(m,1H),3.18-3.15(m,2H),2.13(s,3H),1.85(s,3H),1.70-1.50(m,4H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:170.0,169.5,159.7,130.1,129.4,128.5,127.7,127.6,114.0,98.6,83.8,77.5,75.9,74.0,73.1,73.0,55.4,51.5,28.0,25.3,21.0,20.9；HRMS(ESI)m/z C27H33N3NaO8(M+Na)+计算值550.21653；测量值550.21745。
2’-O-乙酰基-(R)-5’-C-叠氮基丙基-5’-O-苄基-3’-O-(4-甲氧基苄基)-尿苷(11)
在Ar气氛中将2.04g(3.87mmol)化合物(10)和0.74g(6.60mmol)尿嘧啶溶解在20mL的CH3CN中，加入3.6mL(13.9mmol)BSA，并将混合物于55℃搅拌1小时。将其在冰浴中冷却，逐滴加入1.6mL(8.75mmol)TMSOTf，并使混合物回到室温，然后于55℃搅拌2小时。将其在冰浴中冷却，加入25mL饱和NaHCO3水溶液并搅拌。用EtOAc和饱和NaCl水溶液从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到澄清的泡沫状化合物(11)(2.04g，3.51mmol，91％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.82(s,1H),7.39-7.29,7.22(d,J＝8.3Hz,2H),6.88(d,J＝8.2Hz,2H),6.04(d,J＝4.1Hz,1H),5.23(t,J＝5.5Hz,1H),5.18(dd,J＝7.9Hz,2.1Hz,1H),4.73(d,J＝11.6Hz,1H),4.53(d,J＝11.0Hz,1H),4.45(d,J＝11.0Hz,1H),4.40(d,J＝11.0Hz,1H),4.30(t,J＝6.2Hz,1H),4.10(dd,J＝5.5Hz,2.8Hz,1H),3.81(s,3H),3.75-3.74(m,1H),3.24(t,J＝6.8Hz,2H),2.12(s,3H),1.77-1.72(m,1H),1.66-1.52(m,3H)；13CNMR(151MHz,CDCl3)δ:170.1,162.9,159.7,150.2,140.1,137.7,130.0,129.2,128.8,128.3,127.7,114.0,102.7,87.4,83.8,78.4,74.5,74.2,73.0,72.9,55.4,51.4,27.4,25.4,20.9；HRMS(ESI)m/z C29H33KN5O8(M+Na)+计算值618.19662；测量值618.19882。
(R)-5’-C-叠氮基丙基-5’-O-苄基-3’-O-(4-甲氧基苄基)-尿苷(12)
在Ar气氛中将0.53g(0.91mmol)化合物(11)溶解在5.2mL的MeOH中，加入0.38g(2.75mmol)K2CO3，并将混合物搅拌1小时。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶2)，得到白色固体化合物(12)(0.46g，0.86mmol，95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.04(s,1H),7.40-7.34(m,3H),7.29-7.27(m,3H),7.25-7.21(m,2H),6.91-6.89(m,2H),5.85(d,J＝5.5Hz,1H),5.26(dd,J＝8.3Hz,2.3Hz,1H),4.74(d,J＝11.0Hz,1H),4.60(d,J＝11.4Hz,1H),4.53(d,J＝11.0Hz,1H),4.41(d,J＝1H),4.17-4.07(m,3H),3.82(s,3H),3.71-3.69(m,1H),3.29-3.27(m,2H),2.87(d,J＝7.3Hz,1H),1.78-1.59(m,4H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:163.0,159.9,150.6,140.3,137.7,130.0,128.8,128.7,128.3,127.7,114.2,102.7,89.4,83.7,78.8,75.9,73.5,72.8,72.6,55.4,51.5,27.5,25.2；HRMS(ESI)m/z C28H33N5NaO7(M+Na)+计算值560.21212；测量值560.21286。
(R)-5’-C-叠氮基丙基-5’-O-苄基-3’-O-(4-甲氧基苄基)-2’-O-甲基-尿苷(13)
在Ar气氛中将0.46g(0.86mmol)化合物(12)溶解在4.6mL THF中，在冰浴中冷却，加入0.10g(2.55mmol)NaH，并将混合物在冰浴中搅拌5分钟。当滴加0.27mL(4.34mmol)CH3I时，将其用铝箔避光，并将混合物在冰浴中搅拌4小时。然后将其于室温搅拌3小时。加入少量饱和NaHCO3水溶液并于室温搅拌。用EtOAc和饱和NaHCO3从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝2∶3)，得到澄清的泡沫状化合物(13)(0.43g，0.78mmol，90％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.31(s,1H),7.55(d,J＝7.5Hz,1H),7.39-7.33(m,H),5.94(d,J＝2.1Hz,1H),4.96(dd,J＝8.3Hz,2.1Hz,1H),4.77(d,J＝11.0Hz,1H),4.56(d,J＝11.6Hz,1H),4.49(d,J＝11.0Hz,1H),4.41(d,J＝11.0Hz,1H),4.21(dd,J＝7.2Hz,2.8Hz,1H),4.11(dd,J＝7.2Hz,4.8Hz,1H),3.83-3.82(m,1H),3.82(s,3H),3.64(dd,J＝4.8Hz,2.8Hz,1H),3.31-3.24(m,2H),1.88-1.83(m,1H),1.72-1.65(m,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:163.4,159.7,150.1,140.3,137.7,129.9,129.2,128.8,128.3,127.7,114.0,102.0,87.9,82.5,82.5,78.2,73.9,72.6,58.6,55.4,51.5,27.1,25.3；HRMS(ESI)m/z C28H33N5NaO7(M+Na)+计算值574.22777；测量值574.22525。
(R)-5’-C-叠氮基丙基-5’-O-苄基-2’-O-甲基-尿苷(14)
在Ar气氛中将0.43g(0.78mmol)化合物(13)溶解在1.85mL的CH2Cl2中，加入96μl的蒸馏水，并将混合物在冰浴中冷却。加入0.21g(0.94mmol)DDQ，并在冰浴中搅拌2小时。然后于室温搅拌2小时。加入5mL饱和NaHCO3水溶液并于室温搅拌。通过硅藻土过滤反应溶液，用CHCl3和饱和NaCl水溶液从滤液中萃取产物，并将有机层用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶2)，得到白色固体化合物(14)(0.27g，0.62mmol，79％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.33(s,1H),7.57(d,J＝8.3Hz,1H),7.41-7.32(m,5H),5.96(d,J＝2.3Hz,1H),4.98(dd,J＝8.2Hz,2.3Hz,1H),4.81(d,J＝11.0Hz,1H),4.45(d,J＝11.0Hz,1H),4.41-4.36(m,1H),3.99(dd,J＝6.9Hz,2.3Hz,1H),4.01-3.97(m,1H),3.63(dd,J＝5.5Hz,2.3Hz,1H),3.58(s,3H),3.34(t,J＝6.9Hz,2H),2.75(d,J＝8.2Hz,1H),1.96-1.68(m,4H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:163.3,150.2,140.0,137.6,128.8,128.3,127.8,102.2,86.7,84.7,84.2,78.3,72.9,67.8,58.8,51.5,27.2,25.4；HRMS(ESI)m/zC20H25N5NaO6(M+Na)+计算值454.17025；测量值454.16755。
(R)-5’-C-叠氮基丙基-5’-O-苄基-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-尿苷(15)
在Ar气氛中将0.27g(0.62mmol)化合物(14)溶解在2.7mL的DMF中，加入0.42g(6.17mmol)咪唑和0.80mL(3.08mmol)TBDPSCl，并将混合物于室温搅拌18小时。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶2)，得到白色泡沫状化合物(15)(0.39g，0.59mmol，95％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.91(s,1H),7.73-7.71(m,2H),7.67-7.66(m,2H),7.44(t,J＝7.6Hz,2H),7.39-7.33(m,8H),7.23-7.22(m,2H),5.88(d,J＝3.5Hz,1H),4.94(dd,J＝8.2Hz,2.8Hz,1H),4.74(d,J＝11.9Hz,1H),4.41(dd,J＝6.2Hz,4.8Hz,1H),4.38(d,J＝11.0Hz,1H),4.22(dd,J＝6.2Hz,2.1Hz,1H),3.74-3.72(m,1H),3.24-3.15(m,2H),3.10(dd,J＝4.8Hz,3.4Hz,1H),3.07(s,3H),1.80-1.75(m,1H),1.64-1.56(m,3H),1.09(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:163.1,149.9,140.1,137.7,136.2,136.0,133.0,130.2,130.2,128.8,128.2,127.9,127.8,127.5,101.9,86.5,84.1,83.3,78.7,72.7,69.9,57.6,51.3,27.1,27.1,25.8,19.5；HRMS(ESI)m/z C36H43KN5O6Si(M+K)+计算值708.26197；测量值708.26246。
(R)-5’-C-叠氮丙基-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-尿苷(16)
在Ar气氛中将0.39g(0.59mmol)化合物(15)溶于6.0mL CH2Cl2中，并于-78℃搅拌10分钟。加入3.5mL(3.5mmol)1M BCl3，并于-78℃搅拌3小时。将温度升至-30℃，加入10mLCH2Cl2∶MeOH的1∶1(v/v)混合溶液，并将混合物搅拌10分钟。将其于室温进一步搅拌，将产物用CHCl3和饱和NaHCO3水溶液萃取，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶2)，得到白色泡沫状化合物(16)(0.34g，0.58mmol，99％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.09(s,1H),7.73-7.72(m,2H),7.68-7.66(m,2H),7.42-7.38(m,5H),5.73(dd,J＝8.3Hz,2.1Hz,1H),5.55(d,J＝6.9Hz,1H),4.35(dd,J＝4.8Hz,2.0Hz,1H),4.09(dd,J＝6.9Hz,4.8Hz,1H),4.00(t,J＝2.1Hz,1H),3.66-3.62(m,1H),3.54(d,J＝2.1Hz,1H),3.19(s,3H),3.17-3.11(m,2H),1.64-1.60(m,1H),1.46-1.41(m,1H),1.09(s,9H),1.02-0.98(m,1H),0.92-0.88(m,1H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:163.1,150.4,143.8,136.2,136.1,133.2,133.0,130.3,130.2,128.0,127.8,102.7,92.7,89.9,81.0,71.3,70.2,58.5,51.2,29.4,27.0,25.7,19.5；HRMS(ESI)m/z C29H37N5NaO6Si(M+Na)+计算值602.24108；测量值602.23893。
(R)-5’-C-叠氮基丙基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-尿苷(17)
在Ar气氛中将0.71g(1.22mmol)化合物(16)溶解在4.1mL吡啶中，加入2.07g(6.11mmol)DMTrCl和0.85mL(7.34mmol)2,6-二甲基吡啶，并将混合物于40℃搅拌48小时。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶2)，得到黄色泡沫状化合物(17)(0.81g，0.92mmol，75％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.96(s,1H),7.76-7.75(m,2H),7.72-7.71(m,2H),7.51-7.40(m,6H),6.75(d,J＝8.9Hz,4H),5.93(d,J＝5.5Hz,1H),5.06(d,J＝6.2Hz,1H),4.504.49(m,1H),4.12-4.11(m,1H),3.77(s,3H),3.77(s,3H),3.29-3.27(m,2H),3.04(s,3H),2.83-2.80(m,1H),2.75-2.71(m,1H),1.20-1.13(m,1H),1.10(s,9H),1.03-0.99(m,1H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:163.3,158.8,158.7,150.2,146.2,136.4,136.0,135.9,135.8,133.5,133.0,130.7,130.4,130.2,130.1,128.1,127.9,127.7,127.0,113.3,113.2,113.1,102.4,87.4,86.4,84.9,82.6,73.7,70.7,57.9,55.3,55.3,51.1,27.8,27.0,25.3,19.5；HRMS(ESI)m/z C50H55KN5O8Si(M+K)+计算值920.34570；测量值920.34581。
(R)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-5’-C-三氟乙酰氨基丙基-尿苷(18)
在Ar气氛中将0.17g(0.19mmol)化合物(17)溶解在1.7mL THF中，加入0.13g(0.50mmol)Ph3P和0.15mL(8.32mmol)蒸馏水并于40℃搅拌3小时。减压蒸馏除去溶剂，将残余物溶于1.65mL CH2Cl2中，加入40μl(0.29mmol)Et3N和70μl(0.59mmol)CF3COOEt并搅拌25小时。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝3∶2)，得到黄色泡沫状化合物(18)(0.16g，0.17mmol，87％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.93(s,1H),7.75-7.74(m,2H),7.70-7.69(m,2H),7.51-7.47(m,4H),7.41(t,J＝7.6Hz,4H),7.28-7.27(m,2H),7.21-7.17(m,1H),6.95(d,J＝8.2Hz,1H),6.74(d,J＝7.6Hz,4H),5.89(d,J＝5.5Hz,1H),5.87(s,1H),5.13(dd,J＝8.2Hz,2.0Hz,1H),4.45(t,J＝4.1Hz,1H),4.11(t,J＝3.4Hz,1H),3.77(s,3H),3.76(s,3H),3.31(t,J＝5.5Hz,1H),3.28-3.26(m,1H),3.05(s,3H),2.88-2.84(m,2H),1.30-1.24(m,2H),1.09(s,9H),1.04-0.95(m,2H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:162.8,158.9,158.8,150.1,146.1,140.6,136.4,136.1,135.8,133.8,132.8,130.6,130.4,130.3,130.1,128.1,128.0,127.9,127.9,127.1,113.3,113.2,102.5,87.4,87.1,85.2,82.3,73.5,70.7,58.0,55.4,55.4,39.6,27.7,27.0,25.1,19.6；HRMS(ESI)m/z C52H56F3KN3O9Si(M+K)+计算值990.33750；测量值990.33913。
(R)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5’-C-三氟乙酰氨基丙基-尿苷(19)
在Ar气氛中将0.86g(0.91mmol)化合物(18)溶解在8.6mL的THF中，加入1.4mL(1.4mmol)1M TBAF并于室温搅拌6小时。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶2)，得到白色固体化合物(19)(0.55g，0.77mmol，85％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:11.41(d,J＝1.4Hz,1H),9.28(t,J＝5.5Hz,1H),7.42(d,J＝7.6Hz,2H),7.31-7.29(m,6H),7.22(t,J＝7.6Hz,1H),6.89(dd,J＝8.9Hz,2.1Hz,4H),5.69(d,J＝6.2Hz,1H),5.29(dd,J＝8.3Hz,2.0Hz,1H),5.16(d,J＝6.8Hz,1H),4.11(dd,J＝11.0Hz,6.2Hz,1H),3.74(s,6H),3.58(t,J＝5.5Hz,1H),3.30-3.29(m,1H),3.27(s,3H),2.92-2.86(m,2H),1.33-1.23(m,4H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ:162.8,158.2,150.4,146.3,140.6,136.2,136.1,130.3,130.2,127.9,127.7,126.7,113.0,102.0,86.1,85.7,84.4,81.2,72.7,67.7,57.6,55.0,55.0,27.1,24.2；HRMS(ESI)m/z C36H38F3N3NaO9(M+Na)+计算值736.24578；测量值736.24725。
3’-O-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-(R)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5’-C-三氟乙酰氨基丙基-尿苷(20)
在Ar气氛中将0.19g(0.27mmol)化合物(19)溶解在1.5mL DMF中，加入溶解在0.5mL DMF中的17mg(0.25mmol)1H-四唑，进一步加入7.8μl(0.098mmol)1-甲基咪唑和0.13mL(0.40mmol)CEOP(N(i-Pr)2)2，并将混合物于室温搅拌两个半小时。用EtOAc和饱和NaHCO3水溶液萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到无色泡沫状化合物(20)(0.18g，0.20mmol，73％)。
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ:150.5,148.7；HRMS(ESI)m/z C45H55F3KN5NaO10P(M+K)+计算值952.32757；测量值952.32498。
(CPG树脂的合成方法)
将以上获得的核苷衍生物如下转化为CPG树脂衍生物。
在Ar气氛中将化合物19溶解于1.5mL吡啶中，加入0.056g琥珀酸酐和0.034gDMAP，并将混合物于室温搅拌20小时。然后将产物用EtOAc和蒸馏水萃取，将有机层用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，在Ar气氛中将所得残余物溶于1.4mL DMF中，加入0.21g CPG树脂(CPG-
第二实施方案
(寡核苷酸合成)
使用自动核酸合成仪，通过亚磷亚酰胺法以0.2μmol规模进行寡核苷酸合成。用MeCN将天然核苷亚酰胺稀释至0.1M，将结合有3’末端核苷的CPG树脂以各自的活性为基础，以相当于0.2μmol的量填充在柱中，并开始合成。
合成完成后，将CPG树脂转移到采样管中，加入900μl CH3CN和100μl Et2NH，并将树脂涡旋5分钟。旋转减慢后，弃去上清液，并用1mL CH3CN洗涤树脂两次。加入500μl CH3NH2和500μl NH3水溶液，并将混合物于65℃孵育10分钟。使溶液回到室温，将上清液转移至Eppendorf管中，将CPG树脂用1mL的3∶1(v/v)H2O/EtOH洗涤两次，并将溶液真空干燥。这既可以从CPG树脂上切除寡核苷酸，又可以使寡核苷酸脱保护。
将孵育的样品真空干燥，然后溶解在DMSO(100μl)中以脱保护TBDMS基团，并在加入TEA·3HF(125μl)之后搅拌样品，然后于65℃孵育90分钟。用0.1M TEAA缓冲液将孵育的样品增加至10mL，将稀释的溶液通过平衡的Sep-Pac tC18反相柱，并吸附在柱上。用无菌水洗涤该柱以除去盐，并用50％CH3CN的H2O溶液(3mL)洗脱，进行粗纯化。
将粗纯化的样品真空干燥，将残余物溶解在载样溶液(1×TBE在90％甲酰胺中，200μl)中，并通过20％PAGE(500V，20mA)分离目标寡核苷酸。收集目标寡核苷酸带，加入0.1M TEAA缓冲液和1mM EDTA水溶液(20mL)，并将混合物摇动过夜。摇动后，使滤液通过平衡的Sep-Pac tC18反相柱，并吸附在柱上。用无菌水洗涤柱以除去盐，用50％MeCN的H2O溶液(3mL)洗脱，并真空干燥。
将寡核苷酸溶解在H2O(1mL)中，并由稀释溶液在260nm的吸光度确定产率。还真空干燥相当于60pmol的寡核苷酸，与3μl无菌水和3μl基质溶液充分混合，在平板上干燥，并通过MALDI-TOF/MS测定质量。合成的寡核苷酸如下所示。
[表1]
在上表中，“U”表示以下所示的结构，并且F表示荧光标记。
[化9]
下面解释所用的试剂。
(TEAA缓冲液)
对于0.1M TEAA缓冲液，将2N TEAA缓冲液(通过将277.6mL的Et3N加入到114.38mL乙酸中，然后将H2O加入到总计1000mL并将pH值调节到7.0来制备)稀释20倍并使用。
(PAGE)
加入40％丙烯酰胺(19：1)溶液(40mL)、尿素(33.6g)和10×TBE缓冲液(8mL)并溶解，加入H2O至总共80mL。最后加入APS(55mg)并溶解，加入TEMED(40μl)并摇动，然后将混合物倒入两块玻璃板之间，两块玻璃板之间的距离为1.5mm，放置至少一小时以固定。1×TBE缓冲液也用作电泳缓冲液。
(1mM EDTA水溶液)
将0.1M EDTA水溶液(1.80g EDTA·4Na用水配制为40mL)稀释100倍并使用。
(寡核苷酸水溶液)
通过稀释获得水溶液，使得在260nm的波长处的吸光度(Abs260)在吸光度计的有效范围内。使用吸光度测量石英池于室温测量Abs260，该池的光程长度(1)为1cm。以下公式用于计算OD260。此处的V代表溶液的总量。
[化10]
0D260(Mε-1·ml-1·cm-1)＝Abs260(Mε-1)·V-1(ml-1)·l-1(cm-1)
由下式计算由N1pN2pN3p...Nn-1Nn表示的单链寡核苷酸的摩尔消光系数(ε260)。
[化11]
ε＝2{ε(N1pN2)+ε(N2pN3)+…+ε(Nn-1pNn)}
-{ε(N2)+ε(N3)+…+ε(Nn--1)}
此处的ε(Nn)表示核酸Nn的ε260，而ε(Nn-1pNn)表示核酸二聚体Nn-1pNn的ε260。将寡核苷酸制成水溶液并稀释，以使得在260nm的波长处的吸光度(Abs260)在吸收计的有效范围内。使用吸光度测量石英池于室温测量Abs260，该池的光程长度(1)为1cm。浓度C(mol/l)通过下式计算。
[化12]
C＝Abs260·ε260 -1·l-1
(基质溶液)
通过将3-羟基吡啶甲酸(3-HPA，4.85mg)和柠檬酸氢二铵(0.8mg)溶解在50μl50％MeCN的H2O中来制备基质溶液。加入柠檬酸氢二铵以防止Na+和K+附着。
(40％丙烯酰胺(19：1)溶液)
这是通过将丙烯酰胺(190g)和N，N’-双丙烯酰胺(10g)溶解在H2O中至总共500mL来制备的。
(10×TBE缓冲液)
通过将Tris(109g)、硼酸(55g)和EDTA·2Na(7.43g)溶解在H2O中至总共1000mL来制备。
第三实施方案
(测量核酸酶耐受性)
将300pmol第二实施方案中合成的寡核苷酸ON4溶解在37.5μl的OPTI-MEM中，将1.1μl分配到Eppendorf管中，并加入5μl的载样缓冲液以获得0分钟的样品。将1.2μl牛血清(BS)作为核糖核酸酶来源加入到剩余的样品中，并于37℃孵育。在15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时和24小时之后，将2.4μl移入在冰上的含有10μl载样缓冲液的Eppendorf管中。对这些样品进行电泳，然后用FUJIFILM LAS 4000进行分析。结果显示在图1中。
如图2所示，虽然具有与寡核苷酸ON4相同的序列的天然存在的寡核苷酸在核酸酶处理后6至12小时几乎被分解，但是即使在核酸酶处理后12小时和24小时，寡核苷酸ON4本身也以未分解的状态保存。
第四实施方案
(测量基因表达抑制能力)
通过双重荧光素酶报告基因分析评价RNA干扰。
将HeLa细胞制备至8000个细胞/mL，加入100μl到96孔板的每个孔中，并培养24小时。将各自合成的siRNA的链溶解于TE缓冲液(100mM NaCl)中，于100℃加热3分钟，放置至少1小时后，返回室温。将0.5μl siRNA溶液、48μl介质(OPTI-MEM)和0.5μl RNAiMAX混合至50μl的总体积，将40μl OPTI-MEM加入到96孔板的每个孔中，其中介质已被吸出，然后将10μl制备的样品加入到每个孔中。然后将其于37℃在CO2培养箱中放置1小时，向每个孔中加入100μl D-MEM，并将细胞于37℃在CO2培养箱中培养24小时。24小时后，吸出介质，并将板冷冻保存24小时。解冻后，通过加入24μl双重发光底物(萤火虫荧光素酶底物)，摇晃五分钟，将23μl样品转移到96孔板中进行荧光测量，并测量萤火虫荧光素酶，来测量萤光素酶的发光。然后加入23μl的终止和发光底物(海肾荧光素酶底物)，将板摇动10分钟，并测量海肾荧光素酶。将海肾荧光素酶的发光测量值除以萤火虫荧光素酶的值，并使用对照％进行比较。具有相同序列的天然存在的寡核苷酸(Native)也用作比较例。Luminescenser JNRII用于荧光素酶测量。结果示于图2中。
如图2所示，寡核苷酸ON1至ON3表现出与天然存在的寡核苷酸(Native)等同的基因表达抑制能力。
第五实施方案
(细胞膜通透性测试)
将HeLa细胞制备至20000个细胞/mL，加入400μl到48孔板的每个孔中，并培养24小时。将在Eppendorf管上干燥的寡核苷酸ON4(40pmol)溶解在OPTI-MEM(400μl)中，并在从每个孔中吸出介质后，将全部量加入到孔中。孵育1小时后，加入200μl/孔的含牛血清的培养介质(10％BS D-MEM(WAKO))。24小时后，从每个孔中吸出介质，并用1×PBS洗涤孔两次。然后用倒置荧光显微镜(IX70，Olympus)观察细胞，结果示于图3中。具有相同序列的天然存在的寡核苷酸(Native)也用作比较例。
如图3所示，虽然天然存在的寡核苷酸(Native)几乎不穿透细胞膜，但是寡核苷酸ON4表现出优异的细胞膜通透性。
第六实施方案
(2)2’OCH3-5’氨基乙基亚酰胺基单元的合成
根据以下方案合成2’OCH3-5’氨基乙基亚酰胺基单元和树脂。
[化13]
(S)-5’-C-叠氮基乙基-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-尿苷(3)。
根据Marie Maturano等人,Eur.J.Org.Chem.,721-730(2012)中描述的方案2，使用尿苷(化合物(1))作为起始原料，得到化合物(2)(Marie等人的方案2中的化合物15)，在Ar气氛中将0.25g(0.36mmol)化合物(2)溶于2.5mL DMF中，加入0.20g(3.0mmol)NaN3，并将混合物于60℃搅拌18小时。用EtOAc和饱和NaCl水溶液从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶2)，得到白色泡沫状化合物(3)(0.19g，0.34mmol，95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.01(s,1H),7.71-7.57(m,4H),7.58(d,J＝8.2Hz,1H),7.51-7.39(m,6H),5.67(d,J＝4.1Hz,1H),5.63(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),4.19(t,J＝4.6Hz,1H),3.91(dd,J＝5.0,1.8Hz,1H),3.78(t,J＝4.6Hz,1H),3.41(s,3H),3.34(t,J＝6.0Hz,1H),2.21(s,1H),1.77-1.71(m,1H),1.52-1.51(m,1H),1.11(s,9H)。
(S)-5’-C-叠氮基乙基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-尿苷(4)
在Ar气氛中将0.19g(0.34mmol)化合物(3)溶于2.0mL吡啶中，加入0.58g(1.70mmol)DMTrCl和0.23mL(2.03mmol)2,6-二甲基吡啶，并将混合物于40℃搅拌3天。用EtOAc和蒸馏水从反应溶液中萃取产物，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到黄色泡沫状化合物(4)(0.21g，0.24mmol，71％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.99(d,J＝2.0Hz,1H),7.60-7.58(m,2H),7.47(d,J＝6.9Hz,2H),7.44-7.39(m,2H),7.33(t,J＝7.6Hz,2H),7.28-7.25(m,3H),7.23(s,4H),7.13-7.08(m,4H),6.77-6.73(m,4H),6.14(d,J＝5.5Hz,1H),5.63(dd,J＝8.2,2.7,1H),4.38(dd,J＝4.8,3.4Hz,1H),3.96(t,J＝2.7Hz,1H),3.80(s,3),3.79(s,3H),3.68(t,J＝5.5Hz,1H),3.28(m,1H),3.13(s,3H),2.57-2.52(m,1H),2.74-2.70(m,1H),1.80-1.74(m,1H),1.36-1.30(m,1H),0.99(s,9H)。
(S)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-[(1,1-二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]-2’-O-甲基-5’-C-三氟乙酰氨基丙基-尿苷(5)
在Ar气氛中将0.21g(0.24mmol)化合物(4)溶于4.0mL THF中，加入0.15g(0.60mmol)Ph3P和0.17mL(9.68mmol)蒸馏水，并将混合物于40℃搅拌14小时。减压蒸馏除去溶剂，将残余物溶解在2.5mL CH2Cl2中，加入50μl(0.36mmol)Et3N和87μl(0.73mmol)CF3COOEt，并将混合物搅拌11小时。减压蒸馏反应溶液，产物用EtOAc和蒸馏水萃取，有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，并用Na2SO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到黄色泡沫状化合物(5)(0.19g，0.20mmol，83％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.11(s,1H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.60-7.59(m,2H),7.48(d,J＝6.2Hz,2H),7.45-7.38(m,2H),7.34(t,J＝7.6Hz,2H),7.28-7.22(m,6H),7.15-7.11(m,4H),6.77-6.74(m,4H),6.08(s,J＝5.5Hz,1H),5.84(s,1H),5.66(dd,J＝8.2,2.7Hz,1H),4.41(t,J＝4.8Hz,1H),3.92(dd,J＝3.4,2.0Hz,1H),3.79(s,3H),3.79(s,3H),3.64(t,J＝5.5Hz,1H),3.24-3.21(m,1H),3.13(s,3H),2.80-2.69(m,2H),1.72-1.66(m,1H),1.32-1.28(m,1H),0.98(s,9H)。
(S)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5’-C-三氟乙酰氨基丙基-尿苷(6)
在Ar气氛中将0.19g(0.20mmol)化合物(5)溶解于2.0mL的THF中，并加入0.30mL(0.30mmol)1M TBAF，并于室温搅拌10小时。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到白色泡沫状化合物(6)(0.12g，0.17mmol，85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.56(s,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.43-7.41(m,2H),7.35-7.23(m,6H),6.85-6.81(m,4H),6.23(s,1H),5.84(d,J＝2.3Hz,1H),5.65(dd,J＝8.3,2.3Hz,1H),4.16-4.11(m,1H),3.94(dd,J＝7.4,3.4Hz,1H),3.83-3.81(m,1H),3.80(s,3H),3.79(s,3H),3.70-3.68(m,1H),3.59(s,3H),3.28-3.12(m,2H),2.53(d,J＝8.3Hz,1H),1.80-1.71(m,1H),1.65-1.61(m,1H)。
3’-O-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-(S)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5’-C-三氟乙酰氨基丙基-尿苷(7)
在Ar气氛中将0.14g(0.20mmol)化合物(6)溶于1.5mL THF中，加入0.17mL(0.96mmol)DIPEA和0.088mL(0.39mmol)CEP-Cl，并将混合物于室温搅拌30分钟。将产物用CHCl3和饱和NaHCO3水溶液萃取，将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤并用NaSO4干燥。减压蒸馏除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(己烷∶EtOAc＝1∶2)，得到白色泡沫状化合物(7)(0.14g，0.15mmol，77％)。
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ:150.8,150.6。
使用上述方案，可以使用尿苷或核苷衍生物如2’-O-烷基尿苷作为起始原料，经由立体选择性醛醇缩合反应，通过短流程得到5’-甲苯磺酰氧基乙基化合物如化合物2，因此，可以有效地得到合意的亚酰胺试剂。
本申请说明书中提及的所有文献均通过引用全文并入本文。
独立文本的序列表
SEQ ID NOs.1-2：人工siRNA
序列表
<110> 国立大学法人岐阜大学
<120> 核苷衍生物及其用途
<130> K170683PCT
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成siRNA
<400> 1
ggccuuucac uacuccuacu u 21
<210> 2
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成siRNA
<400> 2
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