阅读说明：本技术 植物甾醇微生物转化制备add的方法 (Method for preparing ADD by phytosterol microbial transformation ) 是由 杨芳 刘喜荣 孟浩 曾春玲 王敬华 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法,具体涉及一种植物甾醇微生物转化制备ADD的方法。本发明包括以下步骤：(1)用分枝杆菌B-NRRL 3683对植物甾醇进行发酵转化,发酵液静置分层得到上层油层；(2)以所述油层为底物,以简单诺卡氏菌的菌液为酶源进行转化反应,反应物经提取精制得到ADD。本发明采用两步转化法,先将植物甾醇转化为4-AD和ADD的混合物,再将富集在油层中的4-AD转化为ADD,两步中采用不同的菌种,整个反应中省略了将4-AD单独提取出来的步骤,转化率高,反应专一性强,转化时间相对较快,同时产物的降解率低,产品质量高,得到的终产物ADD纯度可达99.5％以上,具有极大的应用前景。(The invention relates to a production method of a steroid drug intermediate, in particular to a method for preparing ADD by phytosterol microbial transformation. The invention comprises the following steps: (1) fermenting and converting phytosterol by using mycobacterium B-NRRL 3683, and standing and layering fermentation liquor to obtain an upper oil layer; (2) and (3) carrying out conversion reaction by taking the oil layer as a substrate and a bacterial solution of the nocardia simplicifolia as an enzyme source, and extracting and refining reactants to obtain the ADD. The invention adopts a two-step conversion method, firstly converts the phytosterol into a mixture of 4-AD and ADD, then converts the 4-AD enriched in an oil layer into ADD, adopts different strains in the two steps, omits the step of independently extracting the 4-AD in the whole reaction, has high conversion rate, strong reaction specificity, relatively quick conversion time, low degradation rate of products, high product quality, and high application prospect, and the purity of the obtained final product ADD can reach more than 99.5 percent.)

植物甾醇微生物转化制备ADD的方法

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种植物甾醇微生物转化制备ADD的方法。

背景技术

雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，简称雄烯二酮、AD或4-AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，简称雄二烯二酮、 ADD)均是重要的甾类药物中间体，雄烯二酮(4-AD)既可作为雄性激素、促蛋白合成激素等激素类物质的前体，也可用于合成螺甾内酯、氢化可的松、氧化***，***等药物；而雄二烯二酮(ADD)可用于***、口服避孕药等药物的合成。

目前，雄二烯二酮的合成方法主要有两种：一是用薯蓣皂甙为起始原料，经过11步化学合成反应得到。二是由植物甾醇经过微生物转化直接得到ADD。其中微生物转化具有反应条件温和，节能环保等方面优势，决定其是否具有经济性包括反应底物浓度、转化率和转化特异性，转化特异性是指在转化过程中 ADD和副产物4-AD的比值，其比值越高，说明其转化特异性愈好。美国专利 USP4345029描述了采用分枝杆菌变种(Mycobacterium phlei)转化得到AD和 ADD；美国专利USP7259005描述了采用另一种分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)转化植物甾醇得到AD和ADD，但其转化效率和特异性均不高，转化率最高仅有64％，工业价值较低。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种植物甾醇微生物转化制备 ADD的方法，能够解决目前雄二烯二酮制备方法中转化率低和降解率高的问题，快速且高纯度地将植物甾醇转化为ADD。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种植物甾醇微生物转化制备ADD的方法，包括以下步骤：

(1)将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683经过斜面培养和摇瓶种子培养后对植物甾醇进行发酵转化，待转化完毕，将发酵完毕的发酵液加热、冷却，静置分层，下层水相弃置，得到上层油层；

(2)以步骤(1)得到的油层为底物，以简单诺卡氏菌经过斜面培养和摇瓶种子培养得到的菌液为酶源，加入转化体系中，于28-32℃下进行转化反应，反应完全，反应物经提取精制得到ADD。

进一步地，所述步骤(1)中分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683 的斜面培养基的配方为：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0；

所述步骤(1)中摇瓶种子培养基的配方为：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏 0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0。

进一步地，所述步骤(1)中转化培养基的配方(w/v)为：玉米浆1-10％，硝酸钠0.1-1％，磷酸氢二铵0.01-0.1％，PPE0.1-2％，植物甾醇1-10％，大豆油 16％，pH＝7.5-8.0。

优选地，所述步骤(1)中的转化条件为：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa。

进一步地，所述步骤(1)中的发酵液加热至80℃，保温静置2小时，分层，下层水相作废水处理。

进一步地，所述步骤(2)中简单诺卡氏菌的斜面培养基的配方(w/v)为：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.15％，酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉2％，PH＝7.0-7.2；

所述一级种子培养基的配方(w/v)为：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％，PH＝7.0-7.2；

所述二级种子培养基的配方(w/v)为：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。

进一步地，所述步骤(2)中转化培养基的配方(w/v)为：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌 0.02％，PH＝7.0-7.2。

优选地，所述步骤(2)中的转化条件为：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa。

进一步地，所述步骤(2)中的提取方法为：将转化产物加热静置，分去水层，留油层；油层加入甲醇，常温搅拌静置，分出上层甲醇，减压浓缩干，加入少量水，带干其中残留的甲醇，冷却后抽滤出料；分离得到的油层再用甲醇提取两次，得到ADD粗品。

进一步地，所述步骤(2)中的精制方法为：所述ADD粗品中加入质量浓度为2％的氢氧化钠溶液，升温皂化，冷却后抽滤并淋洗至中性，得类白色固体；将所述类白色固体烘干称重，加入甲醇，升温搅拌溶清，加入活性炭搅拌脱色，趁热抽滤并淋洗，滤液减压浓缩，冷却养晶后抽滤，滤饼烘干，即得到ADD精品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用两步转化法，先将植物甾醇转化为4-AD和ADD的混合物，再将富集在油层中的4-AD转化为ADD，两步中采用了不同的菌种，整个反应中省略了将4-AD单独提取出来的步骤，转化率高，反应专一性强，转化时间相对较快，同时产物的降解率低，产品质量高，得到的终产物ADD纯度可达99.5％以上，具有极大的应用前景。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所使用的材料均可自常规途径购买得到。

实施例1

1.植物甾醇转化为4-AD

1.1种子培养

菌种名称：mycobacterium sp.B-NRRL 3683

1.1.1斜面培养基

配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟。凝固成型后，在无菌条件下接种。

接种后，30℃培养4天，入4℃冰箱保存，保存时间不超过1个月。

1.1.2摇瓶种子培养基

配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟。冷却至室温。

1.1.2.1一级培养

在无菌条件下接种，接种量：每100毫升刮取1环。接种后，30℃，200rpm 摇床培养48小时。

1.1.2.2二级培养

在无菌条件下接种，接种量：10％。接种后，30℃，200rpm摇床培养48小时。

1.2 10升罐发酵转化

转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。

1.2.1转化培养基

配方：玉米浆1-10％，硝酸钠0.1-1％，磷酸氢二铵0.01-0.1％，PPE0.1-2％，植物甾醇3％，大豆油16％，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟，冷却至室温，于无菌条件下接种，接种量：20％。

1.2.2转化条件

28-32℃，200rpm，空气流量0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间88 小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

1.3脱氢前物料处理

将发酵完毕的发酵液加热至80℃，保温静置2小时，分层，下层水相作废水处理，得到上层油层。

2.4-AD转化为ADD

2.1种子培养

菌种名称：简单诺卡氏菌

2.1.1斜面培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.15％，酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉2％，PH＝7.0-7.2。

培养条件：30±1℃，3-5天。

2.1.2一级种子培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％，PH＝7.0-7.2。

培养条件：500毫升摇瓶装100毫升培养基，摇床培养，转速200rpm，30 ±1℃，培养时间24小时。

2.1.3二级种子培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。

培养条件：500毫升摇瓶装100毫升培养基，摇床培养，转速200rpm，30±1℃，培养时间16-24小时。

2.1.4 10升罐种子转化培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。121℃灭菌30分钟，冷却到30℃接种，接种量10％。

加入步骤1.3中得到的油层，培养条件：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间64小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

3.提取及精制

3.1提取

(1)将转化完毕的发酵液加热到80℃，静置2小时，分去水层，留油层；

(2)油层加入3升甲醇，常温搅拌20分钟，静置2小时，分出上层甲醇， 50℃减压浓缩干，加入少量水，带干其中残留的甲醇，冷却到30℃以下，抽滤出料；

(3)步骤(2)分离得到的油层再用甲醇提取两次，每次使用3升甲醇，将步骤(2)和步骤(3)分离出的甲醇合并，升温减压浓缩；

(4)浓缩得到的混合物过滤，得到的固体即ADD粗品。

3.2精制

(1)得到的ADD粗品，加入2％浓度的氢氧化钠溶液500毫升，升温至60℃，皂化2小时；

(2)冷却至10-20℃，抽滤并淋洗至中性，得类白色固体；

(3)得到的固体50℃烘干，称重，加入4V甲醇，升温至60℃，搅拌溶清，加入0.1W活性炭，搅拌脱色2小时，趁热抽滤并淋洗，滤液减压浓缩至2V体积，冷却至4℃，养晶1小时，抽滤；

(4)滤饼烘干，收ADD 55.2克，纯度99.5％。

以上反应过程如下所示：

实施例2

1.植物甾醇转化为4-AD

1.1按照实例1的方法进行种子培养

1.2 10升罐发酵转化

转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。

1.2.1转化培养基

配方：玉米浆1-10％，硝酸钠0.1-1％，磷酸氢二铵0.01-0.1％，PPE0.1-2％，植物甾醇5％，大豆油16％，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟，冷却至室温，于无菌条件下接种，接种量：20％。

1.2.2转化条件

28-32℃，200rpm，空气流量0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间102 小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

1.3脱氢前物料处理

将发酵完毕的发酵液加热至80℃，保温静置2小时，分层，下层水相作废水处理，得到上层油层。

2.4-AD转化为ADD

2.1按照实施例1的方法进行种子培养

2.1.4 10升罐种子转化培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。121℃灭菌30分钟，冷却到30℃接种，接种量10％。

加入步骤1.3中得到的油层，培养条件：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间72小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

3.提取及精制

按照实施例1的方法进行提取及精制步骤，滤饼烘干，收ADD 94.5克，纯度99.6％。

实施例3

1.植物甾醇转化为4-AD

1.1按照实例1的方法进行种子培养

1.2 10升罐发酵转化

转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。

1.2.1转化培养基

配方：玉米浆1-10％，硝酸钠0.1-1％，磷酸氢二铵0.01-0.1％，PPE0.1-2％，植物甾醇1％，大豆油16％，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟，冷却至室温，于无菌条件下接种，接种量：20％。

1.2.2转化条件

28-32℃，200rpm，空气流量0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间60 小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

1.3脱氢前物料处理

将发酵完毕的发酵液加热至80℃，保温静置2小时，分层，下层水相作废水处理，得到上层油层。

2.4-AD转化为ADD

2.1按照实施例1的方法进行种子培养

2.1.4 10升罐种子转化培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。121℃灭菌30分钟，冷却到30℃接种，接种量10％。

加入步骤1.3中得到的油层，培养条件：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间48小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

3.提取及精制

按照实施例1的方法进行提取及精制步骤，滤饼烘干，收ADD 18.8克，纯度99.8％。

实施例4

1.植物甾醇转化为4-AD

1.1按照实例1的方法进行种子培养

1.2 10升罐发酵转化

转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。

1.2.1转化培养基

配方：玉米浆1-10％，硝酸钠0.1-1％，磷酸氢二铵0.01-0.1％，PPE0.1-2％，植物甾醇10％，大豆油16％，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟，冷却至室温，于无菌条件下接种，接种量：20％。

1.2.2转化条件

28-32℃，200rpm，空气流量0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间180 小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

1.3脱氢前物料处理

将发酵完毕的发酵液加热至80℃，保温静置2小时，分层，下层水相作废水处理，得到上层油层。

2.4-AD转化为ADD

2.1按照实施例1的方法进行种子培养

2.1.4 10升罐种子转化培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。121℃灭菌30分钟，冷却到30℃接种，接种量10％。

加入步骤1.3中得到的油层，培养条件：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间120小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

3.提取及精制

按照实施例1的方法进行提取及精制步骤，滤饼烘干，收ADD 186.4克，纯度99.5％。