一种酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法
阅读说明：本技术 一种酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法 (Method for semi-synthesizing mogroside V through enzyme catalysis ) 是由 李伟 黄华学 贺进军 黄�俊 宋谷良 江小龙 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶催化半合成罗汉果甜苷V的方法,其特征在于,包括以下步骤：(1)将含有11-O-罗汉果甜苷V的底物和辅助底物投入缓冲溶液中,室温搅拌至全溶,得底物溶液；(2)将羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和辅酶投入上述底物溶液中,保温搅拌；(3)反应结束后调节pH值至碱性,过滤,滤液通过大孔吸附树脂柱,上柱毕,水洗至流出液为中性,再用醇洗脱,将醇洗脱液浓缩、真空干燥,得罗汉果甜苷V。本发明方法以11-O-罗汉果甜苷V为底物原料,采用了酶法辅酶再生,和外加试剂辅酶再生联用的方式,降低成本,按照本发明方法所得罗汉果甜苷V收率和纯度都高,反应条件温和,不使用易燃易爆、有毒有害的化工溶剂满足了工业化生产要求。(The invention relates to a method for semi-synthesizing mogroside V through enzyme catalysis, which is characterized by comprising the following steps: (1) adding a substrate containing 11-O-mogroside V and an auxiliary substrate into a buffer solution, and stirring at room temperature until the substrates are completely dissolved to obtain a substrate solution; (2) adding carbonyl reductase, glucose dehydrogenase and coenzyme into the substrate solution, and stirring while keeping the temperature; (3) adjusting pH to alkalinity after reaction, filtering, passing the filtrate through macroporous adsorbent resin column, washing with water until effluent liquid is neutral, eluting with alcohol, concentrating the alcohol eluate, and vacuum drying to obtain mogroside V. The method takes 11-O-mogroside V as a substrate raw material, adopts a mode of combining enzyme coenzyme regeneration and additional reagent coenzyme regeneration, reduces the cost, has high yield and purity of the mogroside V obtained by the method, has mild reaction conditions, does not use flammable, explosive, toxic and harmful chemical solvents, and meets the requirements of industrial production.)
技术领域
本发明涉及罗汉果甜苷的半合成方法，具体涉及一种酶催化半合成罗汉果甜苷V的方法。
背景技术
罗汉果甜苷作为甜味剂是安全无毒的，在国家强制标准《GB2760食品添加剂使用标准》中规定，罗汉果甜苷可不限量用于各类食品。
罗汉果甜苷V(Mogroside V)，分子式：C60H102O29，分子量:1287.43，是罗汉果中特有的一种葫芦烷型四环三萜皂苷，是罗汉果中主要的甜味成分，属低热量、非营养、非发酵型的天然高倍甜味剂。
11-O-罗汉果甜苷V，又名：11-氧基-罗汉果甜苷V(11-oxo-Mogroside V)，分子式：C60H100O29，分子量:1285.43，同样是罗汉果中特有的一种葫芦烷型四环三萜皂苷，同样是一种天然甜味剂，但是其甜度低于罗汉果甜苷V。
11-O-罗汉果甜苷V与罗汉果甜苷V的四环三萜骨架、取代糖基的数目与位置完全一致，只是11位碳原子上的取代基不同，一个是羰基，一个是羟基。分子结构的细微差别，导致了两者甜度的巨大悬殊：罗汉果甜苷V的甜度是蔗糖的300-400倍，而11-O-罗汉果甜苷V的甜度是蔗糖的50-60倍。
目前，罗汉果提取物产品质量规格的衡量标准，通常是以罗汉果甜苷V的含量作为指标(即：罗汉果甜苷V的含量越高，价值越高)，并未对11-O-罗汉果甜苷V的含量做限定和要求。因此，11-O-罗汉果甜苷V在罗汉果提取物中存在的有与无，多与少，都与产品的实际价值毫不相关。通常情况下，在罗汉果原料中，11-O-罗汉果甜苷V的含量大约是罗汉果甜苷V含量的10％～20％，除罗汉果甜苷V之外，它还是罗汉果总皂苷中含量最高的皂苷。因此通过有效的途径，用11-O-罗汉果甜苷V作为起始原料，半合成罗汉果甜苷V具有重大意义。
发明人于2019年曾申请了如下两篇与罗汉果甜苷V半合成有关的发明申请：
CN201910643082.4公开了《一种罗汉果甜苷V的半合成方法》，是以11-O-罗汉果甜苷V为原料，经催化加氢制得罗汉果甜苷V；
CN201910641262.9公开了《半合成罗汉果甜苷V的方法》，是以11-O-罗汉果甜苷V为原料，经硼氢化钠或硼氢化钾还原制得罗汉果甜苷V。
上述所有的化学半合成方法将中，葫芦烷型四环三萜皂苷11位碳原子上的羰基还原为羟基的过程中，都有发生α、β异构的风险。而且作为食品添加剂，最好能使用更为安全的合成方法。如果采用生物酶催化还原制备罗汉果苷V，则无类似的风险。
目前尚无文献公开报道将采用酶催化半合成罗汉果甜苷V的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术不足，提供一种收率高、工艺简单、成本低廉、适宜于工业化生产的酶催化半合成罗汉果甜苷V的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种酶催化半合成罗汉果甜苷V的方法，包括以下步骤：
(1)将含有11-O-罗汉果甜苷V的底物和辅助底物投入缓冲溶液中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)将羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和辅酶投入上述底物溶液中，保温搅拌；
(3)反应结束后调节pH值至碱性，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，上柱毕，水洗至流出液为中性，再用醇洗脱，将醇洗脱液浓缩、真空干燥，得罗汉果甜苷V。
采用酶催化法制备手性醇，产率高，立体选择型好，但酶的价格昂贵，若不能有效控制成本，则无法开展工业化的大规模生产。本发明采用酶法(葡萄糖脱氢酶)和非酶法(辅酶再生试剂)联合使用，使酶活性在整个反应过程保持较高的水平，最终产物产率高，降低了成本，提供了一种全新的以11-O-罗汉果甜苷V为原料酶催化合成罗汉果甜苷V的方法。
优选的，步骤(1)底物中11-O-罗汉果甜苷V的浓度为60-150g/L，优选100-120g/L。
优选的，步骤(1)中所述的辅助底物为葡萄糖，葡萄糖的用量为底物重量的0.2-1倍，优选0.3-0.5倍。
优选的，步骤(1)中所述的缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液，缓冲溶液的pH范围为5.8-8.0，缓冲溶液的用量为底物重量的10-20倍(L/g)。
优选的，步骤(2)中所述的羰基还原酶可以是来源于动物细胞、植物细胞或微生物，羰基还原酶的用量是底物重量的1-5wt％，优选为2-3wt％。
优选的，步骤(2)中所述的辅酶选自NADPH或NADH，辅酶的用量是底物重量的0.5-2wt％，优选1-1.5wt％。
优选的，步骤(2)中所述的葡萄糖脱氢酶可以是来源于动物细胞、植物细胞或微生物，葡萄糖脱氢酶的用量是底物重量的0.1％-1％，优选0.2-0.3wt％。
若上述各种酶的用量过少，将导致反应液中酶的浓度过低，造成催化反应的速度变慢，生产效率低；若上述各种酶的用量过多，不但会造成浪费，还会增加后处理的难度。
优选的，步骤(2)中在反应第6-10h开始持续补加辅酶再生试剂，或者在初始酶活力降低为60-80％时持续补加辅酶再生试剂，在反应结束前2-5h停止补加。辅酶再生试剂的加入量为底物重量的1-10wt％，优选为3-5wt％。所述辅酶再生试剂为吩嗪甲基硫酸盐/吩嗪乙基硫酸盐，连二亚硫酸钠和有机胺按照摩尔比2-4:1-2:1-1.3的混合物。所述有机胺选自二乙胺，二丙胺，三甲胺，三乙胺，三丙胺中的至少一种。发明人预料不到地发现，以上述比例复配的辅酶再生试剂，能够弥补反应中后期酶活力不足的缺陷，稳定持续地使反应进行。最终罗汉果苷V的收率令人满意，达到了一个可工业化生产的程度。
优选的，步骤(2)中所述的保温反应的温度为25-40℃。若反应的温度过低，将导致各种酶的催化效果降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若反应的温度过高，将导致各种酶变性、失活，同样不利于反应的进行。
优选的，步骤(2)中所述的搅拌的速度为40-100rpm。若搅拌的速度过慢，将导致酶跟底物接触的几率降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若搅拌的速度过快，搅拌器过强的剪切力将破坏酶的空间结构，从而降低酶活，同样会造成催化反应的速度变慢或反应不完全。
优选的，步骤(2)中所述的反应时间为24-48小时。
优选的，步骤(3)中所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液，所述的pH值为10-12。将反应液用碱液调节pH值至碱性的目的，是终止反应并灭酶。
步骤(3)中，过滤的目的是除去已经失活、变性的各种酶，并防止大孔吸附树脂柱堵塞。
优选的，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为非极性，弱极性和中极性大孔吸附树脂，利用其能够吸附罗汉果甜苷V，而不吸附其他物质的特性型号包括但不局限于D101、AB-8、LX-T28、HP20。将反应液调碱、灭酶、过滤之后，通过大孔吸附树脂柱，是利用大孔树脂只会吸附滤液中的罗汉果甜苷V、而不会吸附滤液中其它成分(葡萄糖、葡萄糖酸和盐等)，从而达到分离纯化的目的。
本发明方法的合成反应式如下：
本发明方法的有益效果如下：
(1)本方法提供了一种全新的高含量罗汉果甜苷V获得途径——酶催化半合成；同时也最大程度了提高了罗汉果甜苷V分离纯化之副产物，即11-O-罗汉果甜苷V的附加值，丰富了罗汉果资源综合利用方式；
(2)本发明采用了酶法辅酶再生，和外加试剂辅酶再生联用的方式，降低成本，按照本发明方法所得罗汉果甜苷V收率和纯度都高，满足了工业化生产要求；
(3)本发明方法工艺简单，可操作性强，设备要求低，反应条件温和，生产成本低，不使用易燃易爆、有毒有害的化工溶剂，安全、绿色、环保，适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例所使用的11-O-罗汉果甜苷V，纯度含量为97.5％(HPLC)购于湖南华诚生物资源股份有限公司；所使用的大孔吸附树脂购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；所使用的羰基还原酶购于苏州汉酶生物技术有限公司，型号KRED-101；葡萄糖脱氢酶采购自湖北新德晟材料科技有限公司，比活性≥150U/mg。
本发明实施例中，采用高效液相色谱外标法测定11-O-罗汉果甜苷V及罗汉果甜苷V的含量。
实施例1
(1)底物溶液的配制：将底物(11-O-罗汉果甜苷V，10g)和辅助底物葡萄糖3g投入100ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(pH＝6.5)中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)酶催化：将0.2g羰基还原酶、0.1g葡萄糖脱氢酶和0.02gNADPH投入上述底物溶液中，27℃保温，以60rpm的速度搅拌，反应6小时后持续补加辅酶再生试剂，至反应第25h停止补加，辅酶再生试剂为吩嗪甲基硫酸盐，连二亚硫酸钠和二乙胺按照摩尔比3.5：1.5：1的混合物，辅酶再生试剂加入量为0.3g，继续反应5h直至反应完全，得反应液；
(3)后处理：反应毕，将反应液用氢氧化钾水溶液调节pH值至10，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(树脂型号：D101)，上柱毕，用纯水洗至大孔吸附树脂柱流出液为中性，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得9.12g罗汉果甜苷V。
经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得罗汉果甜苷V的含量为96.3％，罗汉果甜苷V的收率为90.08％。
实施例2
(1)底物溶液的配制：将底物(11-O-罗汉果甜苷V，12g)和辅助底物(葡萄糖5g)投入100ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(pH＝7.0)中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)酶催化：将0.36g羰基还原酶、0.18g葡萄糖脱氢酶和0.03g NADPH投入上述底物溶液中，35℃保温，以40rpm的速度搅拌，反应8小时后持续补加辅酶再生试剂，至反应第30h停止补加，辅酶再生试剂为吩嗪乙基硫酸盐，连二亚硫酸钠和三乙胺按照摩尔比3：1.3：1的混合物，辅酶再生试剂加入量为0.5g，继续反应5h直至反应完全，得反应液；
(3)后处理：反应毕，将反应液用氢氧化钠水溶液调节pH值至11，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(树脂型号：AB-8)，上柱毕，用纯水洗至大孔吸附树脂柱流出液为中性，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得11.25g罗汉果甜苷V。
经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得罗汉果甜苷V的含量为97.1％，罗汉果甜苷V的收率为93.36％。
实施例3
(1)底物溶液的配制：将底物(11-O-罗汉果甜苷V，10g)和辅助底物(葡萄糖5g)投入100ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(pH＝7.5)中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)酶催化：将0.5g羰基还原酶、0.2g葡萄糖脱氢酶和0.03gNADPH投入上述底物溶液中，30℃保温，以80rpm的速度搅拌，反应8小时后持续补加辅酶再生试剂，至反应第30h停止补加，辅酶再生试剂为吩嗪乙基硫酸盐，连二亚硫酸钠和三乙胺按照摩尔比4：1.5：1的混合物，辅酶再生试剂加入量为0.5g，继续反应5h直至反应完全，得反应液；
(3)后处理：反应毕，将反应液用氢氧化钾水溶液调节pH值至10，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(树脂型号：LX-T28)，上柱毕，用纯水洗至大孔吸附树脂柱流出液为中性，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得9.82g罗汉果甜苷V。
经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得罗汉果甜苷V的含量为95.2％，罗汉果甜苷V的收率为95.88％。
实施例4
其他条件和步骤和实施例1相同，区别在于步骤(2)中不补加辅酶再生试剂。最终得到7.41g罗汉果甜苷V，罗汉果甜苷V的含量为96.4％，收率为73.26％。
实施例5
其他条件和步骤和实施例1相同，区别在于步骤(2)中不补加辅酶再生试剂，并且葡萄糖脱氢酶的用量为0.5g。最终得到8.93g罗汉果甜苷V，罗汉果甜苷V的含量为95.8％，收率为87.74％。
通过实施例1，4，5结果的比较，可以发现，通过补加辅酶再生试剂，可以减少葡萄糖脱氢酶的用量，提高收率，降低成本。