阅读说明：本技术 一种低成本制备7-酮石胆酸的生物酶催化方法 (Bio-enzyme catalysis method for preparing 7-ketolithocholic acid at low cost ) 是由 傅荣昭 谷绪顶 周文俊 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种低成本制备7-酮石胆酸的生物酶催化方法,该方法是将苏氨酸脱氨酶催化苏氨酸制备2-酮丁酸,然后2-酮丁酸作为辅底物,在7ɑ羟基类固醇脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶、鹅去氧胆酸以及辅酶NAD+的作用下,生成7-酮石胆酸,且酶催化的转化率能够达到99.5％以上,而且成本比现有工艺路线极具优势,有工业化应用的潜力。(The invention relates to a biological enzyme catalysis method for preparing 7-ketolithocholic acid at low cost, which is characterized in that threonine deaminase catalyzes threonine to prepare 2-ketobutyric acid, then the 2-ketobutyric acid is used as an auxiliary substrate, and 7-ketolithocholic acid is generated under the action of 7 alpha hydroxyl steroid dehydrogenase, alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase, chenodeoxycholic acid and coenzyme NAD +, and the conversion rate of the enzyme catalysis can reach more than 99.5 percent, and the cost is superior to that of the existing process route and has the potential of industrial application.)

一种低成本制备7-酮石胆酸的生物酶催化方法

技术领域

本发明涉及一种低成本制备7-酮石胆酸的生物酶催化方法，属于生物酶催化领域。

背景技术

熊去氧胆酸主要用于治疗胆结石、胆囊炎、胆管炎、胆汁消化不良。对胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化及药物诱发的肝炎，也有非常好的疗效。美国等一些发达的西方国家，主要用来预防胆结石形成，这些国家饮食以肉类物质为主要来源，能量及热量高且密集、富于油脂等特点，患胆结石的几率较高，本着预防等目的，普通民众食用熊去氧胆酸来预防胆结石形成。目前熊去氧胆酸的制备方法主要有化学合成法和生物转化法，其中合成熊去氧胆酸最重要的中间体为7-酮石胆酸。合成7-酮石胆酸的路线较多，化学法中一般使用氧化剂将CDCA氧化生成7-酮石胆酸，最后还需进行产品纯化。传统化学合成7-酮石胆酸的方法存在反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大，污染大等一系列问题，因此UDCA的工业化规模受到限制。

目前基于酶催化技术制备7-酮石胆酸的方法有很多，酶催化技术克服了传统化路线的各种缺点。而在制备7-酮石胆酸的酶催化路线，需要辅酶NAD⁺再生，用于辅酶再生的底物有丙酮酸钠和苹果酸钠等，工业级的丙酮酸纳价格在80元/kg，而苹果酸钠为30-40元/kg。而本发明所用辅酶再生的底物为2-酮丁酸，通过苏氨酸酶催化苏氨酸制备，苏氨酸价格在10元/kg，通过酶催化制备2-酮丁酸，成本不高于15元/kg。因此辅酶再生底物选择苏氨酸路线极具工业化优势。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种低成本制备7-酮石胆酸的生物酶催化方法，能显著降低成本极具工业化优势。

本发明通过如下步骤实现目的：

一种低成本制备7-酮石胆酸的生物酶催化方法，由以下方式制备得到：

(1)以鹅去氧胆酸为底物，在水相反应体系，20～40℃、6.0-8.0pH下，加入生物催化剂、辅因子和辅酶再生系统，发生氧化反应生成目标产物7-酮石胆酸；

(2)生物催化剂为7ɑ羟基类固醇脱氢酶；所述的辅酶再生系统为苏氨酸、苏氨酸脱氨酶和α-羟丁酸脱氢酶。

所述鹅去氧胆酸：苏氨酸、苏氨酸脱氨酶和α-羟丁酸脱氢酶的质量比为1：2～3.2:0.01～0.03：0.05～0.2。

所述骤(1)中的辅因子为NAD⁺，所述辅因子与鹅去氧胆酸的投料质量比为0.0001～0.01:1。

所述步骤1中的苏氨酸脱氨酶酶活大于3000U/g，α-羟丁酸脱氢酶酶活大于200U/g和7ɑ羟基类固醇脱氢酶酶活大于100u/g。

所述苏氨酸脱氨酶、α-羟丁酸脱氢酶和7ɑ羟基类固醇脱氢酶均是在大肠杆菌中的表达产物。

本发明的有益效果

(1)生物酶催化的转化率能够达到99.5％以上。

(2)而且成本比现有工艺路线极具优势，有工业化应用的潜力。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在反应瓶中加入鹅去氧胆酸10g，苏氨酸，4g，然后加入水50ml，苏氨酸脱氨酶0.2g，α-羟丁酸脱氢酶0.5g，7ɑ羟基类固醇脱氢酶2g，NAD⁺0.01g，室温下，ph为7.5，反应4-6h，CDCA(鹅去氧胆酸)最终残留0.5％。

反应结束后，调酸至4.0，升温至70度，然后降至常温，过滤得滤饼。滤饼加入30ml甲醇，升温至50度，过滤得滤液，滤液减压蒸去15ml甲醇，缓慢滴加12ml水，最后降温至5度，抽滤得晶体，并烘干，重量为9.5g。

实施例2

在反应瓶中加入鹅去氧胆酸10g，苏氨酸，4g，然后加入水50ml，苏氨酸脱氨酶0.2g，α-羟丁酸脱氢酶0.5g，7ɑ羟基类固醇脱氢酶3g，NAD⁺0.01g，室温下，ph为7.5，，反应4-6h，CDCA(鹅去氧胆酸)最终残留0.3％。

反应结束后，调酸至4.0，升温至70度，然后降至常温，过滤得滤饼。滤饼加入30ml甲醇，升温至50度，过滤得滤液，滤液减压蒸去15ml甲醇，缓慢滴加12ml水，最后降温至5度，抽滤得晶体，并烘干，重量为9.6g。

实施例3

在反应瓶中加入鹅去氧胆酸10g，苏氨酸，4g，然后加入水50ml，苏氨酸脱氨酶0.2g，α-羟丁酸脱氢酶0.5g，7ɑ羟基类固醇脱氢酶3g，NAD+0.1g，室温下，ph为7.5，，反应4-6h，CDCA(鹅去氧胆酸)最终残留0.1％。

反应结束后，调酸至4.0，升温至70度，然后降至常温，过滤得滤饼。滤饼加入30ml甲醇，升温至50度，过滤得滤液，滤液减压蒸去15ml甲醇，缓慢滴加12ml水，最后降温至5度，抽滤得晶体，并烘干，重量为9.5g。