具体实施方式

I.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为清晰起见和/或为便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且与现有技术中通常理解的术语定义相比，本文包含的这些定义不一定解释成表示与本领域的通常理解存在明显差异。

如本文所用的术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”及“该/所述”包括复数个所指对象。例如，提及“一种分离的肽”是指一种或多种分离的肽。

在整个说明书和权利要求中，词语“包括”或诸如“包含(comprises或comprising)”的变体应被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“抗原结合部分”是指与靶表位、抗原、配体或受体特异性结合的化合物或分子的一部分。具有抗原结合部分的分子包括但不限于抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体和嵌合抗体)、抗体片段或其部分(例如，Fab片段、Fab'2、scFv抗体、SMIP、结构域抗体、双抗体、小抗体、scFv-Fc、亲和体、纳米抗体以及抗体的VH和/或VL结构域)、受体、配体、适体和其他具有已确定结合配偶体的分子。“亲和力成熟的”的抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。

“结合结构域”是指与靶表位、抗原、配体或受体特异性结合的化合物或分子的一部分。结合结构域可以是分子诸如抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、抗体片段或其部分(例如，Fab片段、Fab'2、scFv抗体、SMIP、结构域抗体、双体抗体、微抗体、scFv-Fc、亲和体、纳米抗体以及抗体的VH和/或VL结构域)、受体、配体、适体或其他具有已确定结合配偶体的分子的一部分。

如本文所用，术语“互补决定区”(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个可变结构域典型地具有三个CDR区，其认定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即轻链可变结构域(V_L)中的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域(V_H)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版

Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域(V_L)中的大约残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域(V_H)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环两者的氨基酸。例如，抗体4D5的重链的CDRH1包括氨基酸26至35。

本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，同上所述。

术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。

“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。

在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一％(其可以可替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：

100乘以分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。

抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁，以及IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“受试者”、“患者”、“个体”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，受试者、患者或个体为人。

术语“HER2阳性”癌症包括具有高于正常HER2水平的癌细胞。HER2阳性癌症的实例包括HER2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。在一些实施例中，HER2阳性癌症选自由以下项组成的组：HER2阳性胃食管连接部癌、HER2阳性结直肠癌、HER2阳性肺癌(例如HER2阳性非小细胞肺癌)、HER2阳性胰腺癌、HER2阳性结直肠癌、HER2阳性膀胱癌、HER2阳性唾液管癌、HER2阳性卵巢癌(例如，HER2阳性上皮性卵巢癌)或HER2阳性子宫内膜癌。在一些实施例中，HER2阳性癌症是局部晚期或转移性的。任选地，HER2阳性癌症的免疫组织化学(IHC)评分为2+或3+和/或原位杂交(ISH)扩增比≥2.0。在一些实施例中，HER2阳性乳腺癌是根据HER2Testing in Breast Cancer Guideline:2018Focused Update(Wolff等人J.Clin.Oncol2018,36(20):2105-2122)来定义。

化合物，例如HER2抗体(例如，HER2 TDB、曲妥珠单抗或其组合)的“有效量”至少是实现期望的治疗或预防结果(诸如特定疾患(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性乳腺癌或HER2阳性胃癌)的可测量的改善或预防)所需的最小量。本文的有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引起预期应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防用途、有益或预期结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重程度或延缓疾病发作，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症以及在疾病发展过程中出现的中间病理表型。对于治疗用途、有益或预期结果包括临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患病者的生活质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增强其他药物的效果(诸如通过靶向、延缓疾病进展和/或延长存活)。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可具有以下效应：减少癌细胞(例如HER2阳性癌细胞)的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减慢或期望地停止)癌细胞浸润进入周围器官中；抑制(即在某种程度上减慢和期望地停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤的生长；和/或在某种程度上减轻与疾患有关的一种或多种症状。有效量可以一次或多次施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量为足以直接或间接地进行预防或治疗的量。如在临床背景中所理解的，与另一药物、化合物或药物组合物结合可以达到或不能达到有效量的药物、化合物或药物组合物。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他试剂结合可以获得或实现预期结果，则可以考虑给予有效量的单一药剂。

术语“治疗指数”是指引起毒性作用(例如，非肿瘤毒性作用)的治疗剂(例如，HER2TDB，例如，BTRC4017A)的剂量与足以实现所需治疗效果的治疗剂(例如，HER2 TDB，例如BTRC4017A)的剂量之间的比率。当(a)足以实现所需治疗效果的剂量相对于参考治疗方案减少和/或(b)治疗剂引起毒性作用的剂量(例如，最大耐受剂量)相对于参考治疗方案增加时，可实现增加的治疗指数。在确定治疗指数时，可根据受试者对治疗方案的客观应答来确定足以实现所需治疗效果的剂量。在一些实施例中，根据RECIST v.1.1，客观应答是完全应答(CR)或部分应答(PR)。另外地或可替代地，根据受试者的应答持续时间(DOR)可确定足以实现所需治疗效果的剂量。在一些实施例中，根据RECIST v.1.1，DOR是从记录的客观应答的第一次出现到第一次记录的疾病进展或任何原因的死亡(以先发生者为准)的时间的时间。在确定治疗指数时，治疗剂引起毒性作用的剂量可根据剂量限制性毒性(DLT)的存在来确定，该剂量限制性毒性根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(NationalCancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events)(NCI CTCAE)v5.0进行分级，但细胞因子释放综合征(CRS)除外，它根据经修饰的细胞因子释放综合征分级系统(Modified Cytokine Release Syndrome Grading System)进行分级(参见第II部分中的表1和表2-治疗方法(Therapeutic Methods))。

“存活期”是指受试者保持存活，且包括无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。存活期可以通过Kaplan-Meier方法进行估算，生存期的任何差异都可以通过分层对数秩检验来计算。

“无进展存活期(PFS)”是指从治疗(或随机分组)到首次疾病进展或死亡的时间。例如，它是从治疗最初或从最初诊断开始，受试者保持存活而癌症没有复发的时间，例如持续限定的时间段，诸如约1个月、1.2个月、2个月、2.4个月、2.9个月、3个月、3.5个月、4个月、6个月、7个月、8个月、9个月、1年、约2年、约3年等。在本发明的一方面，PFS可通过实体瘤应答评估标准(RECIST v.1.1)来评估。

“总存活期(OS)”是指从治疗最初或从最初诊断开始，持续限定的时间段，诸如约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年等，受试者保持存活。

如本文所用，术语“在靶/脱肿瘤效应”是指通过治疗剂与健康细胞上表达的疾病相关靶分子的结合相关的效应(例如，通过HER2 TDB(例如，BTRC4017A)与健康细胞上表达的HER2分子结合相关的效应，例如，其中该效应是针对健康细胞的T细胞细胞毒性的结果)。在一些实施例中，在靶/脱肿瘤效应是肺毒性的症状(例如，间质性肺病、急性呼吸窘迫综合征、呼吸困难、咳嗽、疲劳、或肺浸润的存在)、肝酶水平升高、口干、干眼症、粘膜炎、食道炎或泌尿系统症状。另外地或可替代地，在靶/脱肿瘤效应可以是由表达HER2的健康细胞或组织(即，非癌细胞或组织)的异常功能引起的任何效应，其中异常功能归因于施用HER2抗体(例如，在不存在另外的HER2抗体的情况下施用的HER2 TDB抗体(例如，其中HER2 TDB抗体和另外的HER2抗体结合HER2的结构域IV)。在一些实施例中，在靶/脱肿瘤效应是免疫原性效应，诸如CRS，其根据经修饰的细胞因子释放综合征分级系统(Modified CytokineRelease Syndrome Grading System)进行分级(参见第II部分表1和表2-治疗方法(Therapeutic Methods))。

除非另外指明，否则如本文所用的术语“分化簇3”或“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)，包括，例如，CD3ε、CD3γ、CD3α和CD3β链。该术语涵盖“全长”的未加工CD3(例如，未加工或未修饰的CD3ε或CD3γ)，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体。CD3包括，例如，长度为207个氨基酸的人CD3ε蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000724)和长度为182个氨基酸的人CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000064)。

除非另外指明，否则如本文所用的术语“HER2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然HER2，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”、未加工的HER2，以及细胞中加工产生的任何形式的HER2。该术语还涵盖HER2的天然存在变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体。HER2包括例如，人HER2蛋白(参见例如NCBI RefSeq No.NP_001276865)，其长度为1240个氨基酸。HER2的结构域IV是定位在最靠近细胞膜的细胞外蛋白区。结构域IV具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗的个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程期间执行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文所用，疾患或疾病的“延迟进展”意指延缓、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟疾病或疾患(例如，HER2阳性癌症，例如HER2阳性乳腺癌或HER2阳性胃癌)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或待治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患该病。例如，晚期癌症，诸如转移的发展，可能被延迟。

“减少”或“抑制”意指引起整体降低的能力，例如，总体降低20％或以上、50％或以上，或75％、85％、90％、95％或以上。在某些实施例中，减少或抑制可以指，相对于在不存在另外的HER2抗体的情况下用HER2TDB进行的治疗(例如，使用或不使用剂量分次给药方案)，在用HER2TDB和另外的HER2抗体治疗(例如，使用本发明的剂量分次、剂量递增给药方案)之后，减少或抑制不期望的事件(例如，在靶/脱肿瘤效应或免疫原性效应)，诸如细胞因子驱动的毒性(例如，细胞因子释放综合征(CRS))、输注相关反应(IRR)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、神经系统毒性、严重肿瘤溶解综合征(TLS)、中性粒细胞减少症、血小板减少症、肝酶升高和/或中枢神经系统(CNS)毒性。在其他实施例中，减少或抑制可以指由抗体Fc区介导的抗体的效应子功能，此类效应子功能具体包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有前癌性和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性疾患”、“增生性疾患”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。

如本文所用，“一周”是7天±2天。

如本文所用，“施用”意指给予受试者一定剂量的化合物(例如，HER2抗体或另外的HER2抗体)或组合物(例如，药物组合物，例如，包括HER2抗体的药物组合物)的方法。本文所述方法中使用的化合物和/或组合物可经下列途径施用：例如，静脉内(例如，通过静脉内输注)、皮下、肌内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、外用、瘤内、腹腔内、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳霜或以脂质组合物。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，待施用的化合物或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

II.治疗方法

本发明提供了施用HER2抗体的改进方法(例如，包括施用HER2TDB(例如，BTRC4017A)和另外的HER2抗体(例如，非TDB的HER2抗体，诸如曲妥珠单抗)的治疗方案)。此类方法可提供对HER2阳性肿瘤增加的特异性，从而减少不想要的效应，诸如在靶/脱肿瘤效应。本发明部分地基于以下发现：通过用HER2抗体(例如二价、单特异性HER2抗体，诸如曲妥珠单抗)和HER2 TDB(例如，BTRC4017)共同治疗受试者可实现增加的治疗指数，该HER2 TDB与HER2抗体结合相同的HER2结构域(例如，HER2的结构域IV)。与在不存在HER2抗体的情况下用HER2 TDB进行的治疗相比，治疗指数的增加可与经历在靶/脱肿瘤效应的可能性降低相关。另外地或可替代地，与在不存在第一HER2抗体的情况下用第二HER2抗体进行的治疗相比，治疗指数的增加可与经历免疫原性副作用的可能性降低相关。

由于HER2 TDB与非肿瘤细胞(例如，健康细胞)表达的HER2结合，可能会发生在靶/脱肿瘤效应。在靶/脱肿瘤效应可以是肺毒性的症状，诸如间质性肺病、急性呼吸窘迫综合征、呼吸困难、咳嗽、疲劳或肺浸润的存在。另外地或可替代地，在靶/脱肿瘤效应可能与具有低或中度HER2表达的健康细胞或组织的功能障碍有关，诸如胃肠道、呼吸道、生殖道、泌尿道、皮肤、乳房和胎盘中的上皮细胞。可通过本文所述的方法降低或抑制的此类在靶/脱肿瘤效应包括例如升高的肝酶水平、口干、干眼症、粘膜炎、食管炎或泌尿系统症状。

在确定治疗指数时，可根据受试者对治疗方案的客观应答(OR)来确定足以实现所需治疗效果的剂量。在一些实施例中，根据RECIST v.1.1，OR是完全应答(CR)或部分应答(PR)。另外地或可替代地，根据受试者的应答持续时间(DOR)可确定足以实现所需治疗效果的剂量。在一些实施例中，根据RECIST v.1.1，DOR是从记录的客观应答的第一次出现到第一次记录的疾病进展或任何原因的死亡(以先发生者为准)的时间的时间。因此，在一些实施例中，本发明的方法增加了DOR和/或延长了受试者的存活期(例如，总存活期(OS)或无进展存活期(PFS))。

在一些实施例中，与治疗相比，由本发明的治疗方案引起的增加的治疗指数与经历免疫原性副作用(例如，抗药物抗体水平升高、输注/给药相关反应(ARR)、心功能不全、肺部反应和细胞因子释放综合征)的降低的可能性相关。

在确定治疗指数时，可根据剂量限制性毒性(DLT)的存在来确定治疗剂引起毒性作用的剂量，该剂量限制性毒性是根据NCI CTCAE v5.0进行分级(细胞因子释放综合征(CRS)除外)。在一些实施例中，DLT是在评估期(例如，第一给药周期)期间发生的任何以下不良事件：

(a)左心室射血分数(LVEF)从基线下降≥15％或下降≥10％至低于50％LVEF；

(b)肝功能异常，例如，由以下确定：

(i)AST或ALT>3x正常上限(ULN)且总胆红素>2x ULN，以下情况除外：如果上述发生在≤2级CRS(由Lee等人Blood 2014,124:188-195建立的标准来定义)的情况下，在<3天内解决至≤1级，并且没有单个实验室值是>3级，这不被视为DLT；

(ii)任何3级AST或ALT升高，但以下情况除外：如果上述发生在≤2级CRS(由Lee等人Blood 2014,124:188-195建立的标准来定义)的情况下，在<3天内解决为≤1级，这不被视为DLT。在患有转移性肝病变的患者中，输注后开始并在1周内恢复至≤2级或基线的胆红素、转氨酶和/或γ-谷氨酰转移酶(GGT)的3级瞬时升高不被视为DLT；

(c)≥3级淋巴细胞减少症持续>7天；

(d)≥4级中性粒细胞减少症(ANC<500个细胞/μL)持续>7天；

(e)≥3级发热性中性粒细胞减少症；

(f)≥4级贫血症；

(g)≥4级血小板减少症或与临床显著出血相关的3级血小板减少症；

和/或

(h)≥3级非血液学、非肝脏不良事件，不归因于其他明确可识别的原因，但以下情况除外：(i)3级恶心或呕吐，在≤3天内用标准护理疗法解决至≤2级；(ii)3级腹泻、结肠炎或肠炎，用适当治疗在7天内解决至≤1级；(iii)3级疲劳，在≤7天内解决至≤2级；(iv)3级发烧(定义为>40℃持续≤24小时)；(v)3级实验室异常，它是无症状的且研究者认为无临床意义；(vi)3级皮疹，用等效于泼尼松10mg/天或更少的疗法，在≤7天内解决至≤2级；(vii)3级关节痛，可用支持性护理充分控制或在7天内解决至≤2级；(viii)3级肿瘤突发，定义为位于已知或疑似肿瘤部位的局部疼痛、刺激或皮疹，在输注的24小时内开始，并在≤7天内解决至≤2级；(ix)3级缺氧，在输注的24小时内开始，并在事件开始后2天内解决至≤2级；或(x)在患有转移性肺病变的患者中，继发于局部肺水肿的3级呼吸困难，在输注的24小时内开始并在事件开始后2天内恢复至1级或基线，并且支气管痉挛在24小时内解决。

CRS是根据描述于Russell等人N.Engl.J.Med.2008,358:877-887和Lee等人Blood2014,124:188-195中的经修饰的细胞因子释放综合征分级系统(Modified CytokineRelease Syndrome Grading System)进行分级，并总结于下面的表1和表2中。

表1：经修饰的细胞因子释放综合征分级系统

^a小剂量血管加压药：低于下表2所示剂量的单一血管加压药。

^b大剂量血管加压药：如下表2所定义。

表2：大剂量血管加压药(持续时间≥3小时)

^a去甲肾上腺素等效剂量＝[去甲肾上腺素(mcg/min)]+[多巴胺(mcg/kg/min)]+[去氧肾上腺素(mcg/min)/10]

在一些情况下，相对于对照治疗方案(例如，HER2 TDB单一疗法(在不存在另外的HER2抗体的情况下)，或非分级给药方案中的HER2TDB治疗)，遵从本发明的治疗方案，通过施用HER2 TDB(例如，在剂量分次、剂量递增给药方案的情况下，HER2 TDB与另外的HER2抗体和/或HER2 TDB的组合)使用本文所述的方法进行的治疗导致不良事件(诸如上述事件中的任何一个或多个)的减少(例如，减少20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多)或完全抑制(100％减少)。

在一些情况下，由本发明的方法导致的增加的治疗指数相对于对照组增加至少1％(例如，增加1％至1,000％(10倍)、增加2％至5,000％、增加3％至4,000％、增加4％至3,000％、增加5％至2,000％、增加10％至1,000％、增加20％至500％、或增加50％至100％、例如，增加1％至5％、增加5％至10％、增加10％至20％、增加20％至30％、增加30％至40％、增加40％至50％、增加50％至60％、增加60％至70％、增加70％至80％、增加80％至90％、增加90％至100％、增加100％至150％、增加150％至200％、增加200％至300％、增加300％至400％、增加400％至500％、或增加500％至1,000％)。

HER2阳性癌症

本文所述的方法可用于治疗HER2阳性癌症。在一些情况下，HER2阳性癌症是HER2阳性实体瘤。另外地或可替代地，HER2阳性癌症可以是局部晚期或转移性HER2阳性癌症。在一些情况下，HER2阳性癌症为HER2阳性乳腺癌或HER2阳性胃癌。在一些实施例中，HER2阳性癌症选自由以下项组成的组：HER2阳性胃食管连接部癌、HER2阳性结直肠癌、HER2阳性肺癌(例如HER2阳性非小细胞肺癌)、HER2阳性胰腺癌、HER2阳性结直肠癌、HER2阳性膀胱癌、HER2阳性唾液管癌、HER2阳性卵巢癌(例如，HER2阳性上皮性卵巢癌)或HER2阳性子宫内膜癌。与HER2 TDB和另外的HER2抗体的共同治疗

本文所述的方法包括向患有癌症(例如，HER2阳性癌症)的受试者施用HER2 TDB；例如，与HER2和CD3结合的TDB，诸如BTRC4017)和HER2抗体(例如，与HER2结合的另外的抗体，例如非HER2 TDB的HER2抗体，诸如HER2单特异性抗体(例如，单特异性、二价HER2抗体))。在一些实施例中，HER2 TDB和HER2抗体两者均结合HER2的结构域IV。例如，HER2 TDB和HER2抗体可以与HER2的结构域IV竞争性结合。在一些实施例中，HER2 TDB和HER2抗体在相同表位或在重叠表位(例如，HER2的相同表位或重叠表位)处结合HER2。在一些实施例中，相对于另外的抗体，HER2 TDB具有比另外的HER2抗体更低的HER2结合亲和力，这可能至少部分是由于HER2 TDB的更低的HER2价(例如，其中HER2 TDB与HER2单价结合，而另外的HER2抗体与HER2二价结合)。另外地或可替代地，HER2 TDB的HER2结合结构域可具有与另外的HER2抗体大约相同的HER2结合亲和力(例如，HER2 TDB和另外的HER2抗体可共享一个、两个、三个、四个、五个或所有六个CDR；或一个或两个可变区)。在一些实施例中，HER2 TDB的V_H和/或V_L与另外的HER2抗体的V_H和/或V_L共享至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，HER2 TDB和HER2抗体共享相同的HER2结合结构域(例如，4D5的HER2结合结构域(例如，hu4D5)，诸如在HER2 TDB是BTRC4017A并且HER2抗体是曲妥珠单抗或其Fc修饰的变体的情况下。

在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用HER2 TDB，该HER2 TDB包括具有HER2结合结构域的抗HER2臂，该HER2结合结构域包含选自以下项的至少一个(种)、两个(种)、三个(种)、四个(种)、五个(种)或六个(种)互补决定区(CDR)：(a)包含(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些情况下，HER2 TDB包含抗HER2臂，该抗HER2臂包含HER2结合结构域，该HER2结合结构域包含：(a)重链可变结构域(V_H)，其包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；(b)轻链可变结构域(V_L)，其包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH结构域和如(b)中所述的VL结构域。因此，在一些情况下，HER2结合结构域包含：V_H，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和V_L，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。具有上述CDR和可变区序列的示例性HER2结合结构域是hu4D5的结合结构域，例如描述于WO 2015/095392中，其通过引用以其整体并入本文。

在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用HER2 TDB，该HER2 TDB包括具有CD3结合结构域的抗CD3臂，该CD3结合结构域包含选自以下项的至少一个(种)、两个(种)、三个(种)、四个(种)、五个(种)或六个(种)CDR：(a)包含(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些情况下，双特异性抗体包含抗CD3臂，该抗CD3臂包含CD3结合结构域，该CD3结合结构域包含：(a)V_H，其包含与SEQ ID NO:15的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；(b)V_L结构域，其包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH结构域和如(b)中所述的VL结构域。因此，在一些情况下，CD3结合结构域包含：V_H结构域，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和V_L结构域，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。具有上述CDR和可变区序列的示例性CD3结合结构域是40G5c的结合结构域，例如描述于WO2015/095392中，其通过引用以其整体并入本文。

在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用HER2 TDB，该HER2 TDB包括：(i)具有HER2结合结构域的抗HER2臂，该HER2结合结构域包含选自以下项的至少一个(种)、两个(种)、三个(种)、四个(种)、五个(种)或六个(种)互补决定区(CDR)：(a)包含(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含(SEQID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3；以及(ii)具有CD3结合结构域的抗CD3臂，该CD3结合结构域包含选自以下项的至少一个(种)、两个(种)、三个(种)、四个(种)、五个(种)或六个(种)CDR：(a)包含(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含(SEQ IDNO:11)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些情况下，HER2 TDB包含：(i)抗HER2臂，该抗HER2臂包含HER2结合结构域，该HER2结合结构域包含：(a)重链可变结构域(V_H)，其包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；(b)轻链可变结构域(V_L)，其包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH结构域和如(b)中所述的VL结构域；以及(ii)抗CD3臂，该抗CD3臂包含CD3结合结构域，该CD3结合结构域包含：(a)V_H，其包含与SEQ ID NO:15的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；(b)V_L结构域，其包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH结构域和如(b)中所述的VL结构域。因此，在一些情况下，HER2结合结构域包含：V_H，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和V_L，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且CD3结合结构域包含：V_H结构域，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和V_L结构域，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。示例性的此类HER2 TDB是BTRC4017A，一种全长、“杵臼”抗体，其在抗HER2臂中具有hu4D5HER2结合结构域，与具有40G5c CD3结合结构域的抗CD3臂配对。

在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用如WO 2015/063339中所述的HER2TDB。在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用HER2 TDB GBR1302。

在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用具有单价臂和二价臂的HER2TDB。单价臂可包括CD3结合结构域，而二价臂可包括两个HER2结合结构域，并且每个臂可具有与另一个Fc亚基相关联的Fc亚基(例如，通过杵臼结构)以形成Fc结构域。在该实施例中，CD3结合结构域的C末端与Fc亚基的N末端融合，一个HER2结合结构域的C末端与第二HER2结合结构域的N末端融合，并且第二HER2结合结构域的C末端与另一个Fc亚基的N末端融合。在一些情况下，具有单价臂和二价臂的HER2 TDB结合HER2的结构域IV。例如，HER2结合结构域可具有hu4D5序列(例如曲妥珠单抗)和/或CD3结合结构域可具有40G5c序列。此类二价HER2TDB的实例描述于国际专利申请号PCT/US2019/17251中。

用于与HER2 TDB共同治疗的HER2抗体包括单特异性HER2抗体和多特异性(例如，双特异性)HER2抗体(例如，其中双特异性HER2抗体不是T细胞依赖性双特异性抗体)。在一些实施例中，HER2抗体对HER2是多价的(例如，二价的)。另外地或可替代地，用于本文所述的共同治疗的HER2抗体包括全长HER2抗体及其HER2结合片段。在涉及全长HER2抗体的情况下，Fc区可包括一个或多个修饰，例如，以降低效应子功能。示例性Fc修饰在下文第5.c部分中进一步讨论。

在一些情况下，本文所述的任何方法可包括施用HER2抗体(例如，加上HER2 TDB)，该HER2抗体包括HER2结合结构域，该HER2结合结构域包含选自以下项的至少一个(种)、两个(种)、三个(种)、四个(种)、五个(种)或六个(种)互补决定区(CDR)：(a)包含(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含(SEQID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。在一些情况下，HER2抗体包含HER2结合结构域，该HER2结合结构域包含：(a)重链可变结构域(V_H)，其包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；(b)轻链可变结构域(V_L)，其包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％的序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列；或(c)如(a)中所述的VH结构域和如(b)中所述的VL结构域。因此，在一些情况下，HER2结合结构域包含：V_H，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和V_L，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。具有上述CDR和可变区序列的示例性HER2结合结构域是hu4D5的结合结构域。在一些实施例中，HER2抗体为曲妥珠单抗。在其他实施例中，HER2抗体是Fc修饰的曲妥珠单抗变体(例如，曲妥珠单抗-LALAPG)。

HER2 TDB和/或另外的HER2抗体可以使用重组方法和组合物来产生，例如，如美国专利号4,816,567中所述，该专利通过引用整体并入本文。

在一些情况下，根据上述任何上述实施例的HER2 TDB和/或另外的HER2抗体可以单独或以组合并入任何特征，如下面第1-5部分所述。

1.抗体亲和力

在某些实施例中，关于HER2结合结构域、CD3结合结构域或两者，本文中的HER2TDB和/或另外的HER2抗体的解离常数(K_D)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如，10^-8M或更小，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

在一个实施例中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量K_D。在一个实施例中，用目标抗体的Fab形式及其抗原执行RIA。例如，通过在一系列未标记的抗原滴定存在下用最小浓度(¹²⁵I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为确定测定条件，用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微孔板(Thermo Scientific)过夜，随后在室温(大约23℃)用在PBS中2％(w/v)牛血清白蛋白阻断二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的连续稀释液(例如，遵循在Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体(Fab-12)的评定)混合。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下孵育(例如，一小时)。随后移除溶液并且用在PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-)洗涤该板八次。当板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并且在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上对板计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。

根据另一实施例，使用表面等离子体共振测定法测量K_D。例如，在25℃下用固定的抗原CM5芯片以约10个应答单位(RU)进行使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定。在一个实施例中，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM醋酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流量进行注射以获得大约10个应答单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃下，以大约25μl/min的流量，注射在含有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(Evaluation Software 3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(k_on)与解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_off/k_on。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若通过上述表面等离子体共振测定得出缔合速率超过10⁶M-¹s-¹，则可通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，所述荧光淬灭技术测量在浓度增加的抗原的存在下的在25℃下PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如在分光计诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测量的。

2.抗体片段

在某些实施例中，HER2 TDB和/或另外的HER2抗体是抗体片段，例如，HER2 TDB的抗体片段与HER2和CD3结合。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv和scFv片段以及下文所述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün在The harmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,NewYork),pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，请参见美国专利号5,869,046。

双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。

单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。

3.嵌合抗体和人源化抗体

在某些实施例中，根据本文描述的方法使用的HER2 TDB和/或另外的HER2抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.杵臼双特异性抗体工程化

HER2 TDB和/或另外的HER2抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。制备双特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBOJ.10:3655(1991))和“杵臼”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。可以利用双特异性抗体的“杵臼(knob-in-hole)”工程化以产生包含杵的第一臂和包含臼的第二臂，其中第一臂的杵可以结合在该臼中。在一个实施例中，TDB的突起(knob，杵)可以在抗CD3臂上。可替代地，本发明的TDB的突起可以在抗HER2臂上。在一个实施例中，本发明的TDB的孔(hole，臼)可以在抗CD3臂上。可替代地，本发明的TDB的孔可以在抗HER2臂上。在一些情况下，使用杵臼技术产生的HER2 TDB和/或另外的HER2抗体可包含一个(种)或多个(种)重链恒定结构域，其中所述一个(种)或多个(种)重链恒定结构域选自第一CHl(CH1₁)结构域、第一CH2(CH2₁)结构域、第一CH3(CH3₁)结构域、第二CH1(CH1₂)结构域、第二CH2(CH2₂)结构域和第二CH3(CH3₂)结构域。在一些情况下，一个(种)或多个(种)重链恒定结构域中的至少一个与另一个重链恒定结构域配对。在一些情况下，CH3₁和CH3₂结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH3₁结构域中的突起或空腔分别可定位在CH3₂结构域中的空腔或突起中。在一些情况下，CH3₁和CH3₂结构域在介于突起与空腔之间的界面处相遇。在一些情况下，CH2₁和CH2₂结构域各自包含突起或空腔，并且其中CH2₁结构域中的突起或空腔分别可定位在CH2₂结构域中的空腔或突起中。在一些情况下，CH2₁和CH2₂结构域在介于所述突起与空腔之间的界面处相遇。

双特异性抗体(例如TDB)也可以使用免疫球蛋白交叉(也称为Fab结构域交换或CrossMab形式)技术进行工程化(参见，例如，WO2009/080253；Schaefer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:11187-11192(2011))。双特异性抗体也可以通过以下技术制造：工程化静电操纵效应以制造抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；将两种或更多种抗体或片段交联(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体”技术制造双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994))；以及按照例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)的描述制备三特异性抗体。

HER2 TDB和/或另外的HER2抗体，或其抗体片段，还可以包括“双作用FAb”或“DAF”，其包含与除HER2之外的靶标(例如，在HER2 TDB情况下的CD3)以及HER2结合的抗原结合位点(参见，例如，美国公开号2008/0069820，其通过引用整体并入本文)。

5.变体

在一些情况下，设想了上述HER2 TDB和/或另外的HER2抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改进HER2 TDB和/或另外的HER2抗体之一者或两者的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件为最终构建体具有所需特征，例如，抗原结合。

a.取代、插入和缺失变体

在某些实施例中，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目的位点包括HVR和FR。保守取代在表3中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变提供于表3的“示例性取代”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并且对产物进行所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。

表3.示例性和优选的氨基酸取代

可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。

例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。可在CDR“热点”中作出此类改变，即，由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基，其中对所得变体VH或VL进行结合亲和力测试。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向突变)中的任一者将多样性引入出于成熟目的而挑选的可变基因中。接着创建二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中将若干HVR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴别。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变不基本上降低抗体的抗原结合能力即可。例如，可在CDR中进行不基本上降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个CDR保持不变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。

可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。

b.糖基化变体

在一些情况下，本发明的方法涉及向受试者施用HER2 TDB和/或另外的HER2抗体变体(例如，在剂量分次、剂量递增给药方案的情况下)，其已被修饰以增加或减少双特异性抗体被糖基化的程度。本发明的HER2TDB和/或另外的HER2抗体的添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现。

在HER2 TDB和/或另外的HER2抗体包含Fc区的情况下，可以改变与其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。

在一些情况下，该方法涉及施用HER2 TDB和/或另外的HER2抗体变体，所述HER2抗体变体的碳水化合物结构缺乏(直接或间接)附接于Fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中岩藻糖的含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量为通过计算相对于通过MALDI-TOF质谱测得的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，糖链中在Asn297处的岩藻糖的平均量，确定，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，特别是实例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。

鉴于上述情况，在一些情况下，本发明的方法涉及向受试者施用HER2 TDB和/或另外的HER2抗体变体(例如，在剂量分次、剂量递增给药方案的情况下)，其包含去糖基化位点突变。在一些情况下，去糖基化位点突变降低了HER2 TDB和/或另外的HER2抗体的效应子功能。在一些情况下，去糖基化突变是一种取代突变。在一些情况下，双特异性抗体包含在Fc区的取代突变，其降低了效应子功能。在一些情况下，取代突变在氨基酸残基N297、L234、L235和/或D265(EU编号)处。在一些情况下，取代突变选自由以下项组成的组：N297G、N297A、L234A、L235A、D265A和P329G。在一些情况下，取代突变在氨基酸残基N297处。在一个优选实施例中，取代突变为N297A。

在其他情况下，根据本发明的方法使用具有两分型寡糖的变体，例如，其中附接于抗体的Fc区的双角寡糖被GlcNAc两分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于，例如，WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO1999/22764(Raju,S.)中。

c.Fc区变体

在一些情况下，可根据本发明的方法，向患有HER2阳性癌症的受试者施用HER2TDB和/或另外的HER2抗体变体，所述HER2抗体变体具有被引入到双特异性抗体的Fc区的一个或多个氨基酸修饰(即，Fc区变体(参见例如US 2012/0251531))。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。

在一些情况下，Fc区变体具有一些但不是全部效应子功能，这使其成为其中体内抗体的半衰期很重要但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)不需要或有害的应用中的期望的候选物。可实施体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人Blood.101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.GlennieBlood.103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(美国专利号6,737,056和8,219,149)。此类Fc突变体包括在两个或多个第265、269、270、297和327位氨基酸处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581和8,219,149)。

在某些情况下，抗体中野生型人Fc区的位置329处的脯氨酸被甘氨酸或精氨酸或足够大的氨基酸残基取代，从而破坏在Fc的脯氨酸329与FcgRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面内的脯氨酸夹层(Sondermann等人Nature.406，267-273(2000))。在某些实施例中，双特异性抗体包含至少一个另外的氨基酸取代。在另一个实施例中，该另外的氨基酸取代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在又一个实施例中，该至少一个另外的氨基酸取代为人IgG1 Fc区的L234A和L235A或人IgG4 Fc区的S228P和L235E(参见例如US 2012/0251531)，并且在又一个实施例中，该至少一个另外的氨基酸取代为人IgG1 Fc区的L234A和L235A以及P329G。

描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)

在某些情况下，HER2 TDB和/或另外的HER2抗体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基根据EU编号)处的取代。

在一些情况下，改变Fc区以使得C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即，改善或减少)，例如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人(J.Immunol.164:4178-4184,2000)所述。

具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。

有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。

d.经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施例，可期望产生经半胱氨酸工程化改造的HER2 TDB和/或另外的HER2抗体，例如“thioMAb”，其中双特异性抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于双特异性抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或连接基-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗体。

因此，特别考虑了与一种或多种细胞毒性剂缀合的HER2 TDB和/或另外的HER2抗体的免疫缀合物，所述一种或多种细胞毒性剂为诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或它们的片段)，或放射性同位素。

在一些情况下，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中双特异性抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登木素类(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；奥瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类药物，诸如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地碱；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他他赛；单端孢菌素和CC1065。

在一些情况下，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的HER2TDB和/或另外的HER2抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-次黄嘌呤、油桐蛋白、石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陆蛋白(Phytolaca americanaprotein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、明胶、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。

在另一个实施例中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合的HER2 TDB和/或另外的HER2抗体以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制备HER2 TDB和/或另外的HER2抗体以及细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂试剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

e.其他抗体衍生物

在一些情况下，HER2 TDB和/或另外的HER2抗体可经过修饰以包含其他非蛋白质性部分，这些非蛋白质性部分是本领域中已知的并且易于获得，并且根据本文所述的方法施用于受试者。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。

在一些情况下，提供了抗体和可通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实例中，非蛋白质性部分为碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害、但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分近端的细胞被杀死的温度的波长。

给药

HER2 TDB和另外的HER2抗体以符合良好医疗实践的方式给药和施用。本文提供的治疗方案包括将本文所述的任何HER2 TDB与另外的HER2抗体(例如，非TDB的HER2抗体，例如曲妥珠单抗)共同治疗，其中另外的HER2抗体在施用HER2 TDB之前(例如，在第一次施用HER2 TDB之前和/或在施用HER2 TDB的任何后续施用之前)施用。

在一些实施例中，HER2抗体(例如，非TDB的HER2抗体，例如曲妥珠单抗)可以以约5mg/kg至约10mg/kg(例如，5mg/kg至10mg/kg或6mg/kg至8mg/kg，例如，约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)的剂量施用。在一些实施例中，约每三周一次(Q3W)施用HER2抗体(例如，非TDB的HER2抗体，例如曲妥珠单抗)。HER2抗体可在至少约30分钟(例如，30-90分钟)的过程中输注(例如，静脉内)。在一些情况下，例如，在第一次施用HER2抗体时，可在至少约90分钟的过程中输注(例如静脉内)HER2抗体，并且可以观察受试者在4-24小时的过程中HER2抗体的不良反应，例如在施用HER2TDB之前。可替代地，HER2抗体可以与HER2 TDB在同一天施用(例如，在HER2抗体输注后约30-120分钟)。在一些实施例中，对于第一给药周期的HER2抗体的第一剂量与HER2 TDB的第一剂量之间的持续时间比对于随后的给药周期的长。例如，可以在通过施用HER2 TDB的第一剂量来开始第一给药周期之前24小时施用HER2抗体的第一剂量，然而随后的给药周期包括与HER2 TDB剂量同一天的HER2抗体剂量(例如，在HER2 TDB剂量之前30分钟至120分钟)。

在一些情况下，HER2 TDB(例如，BTRC4017A)以固定剂量施用。例如，HER2 TDB可以以0.001mg至500mg(例如，0.003mg至250mg、0.005mg至200mg、0.01mg至150mg、0.05mg至120mg、0.1mg至100mg、0.5mg至80mg、或1.0mg至50mg，例如，0.001mg至0.005mg、0.005mg至0.01mg、0.01mg至0.05mg、0.05mg至0.1mg、0.1mg至0.5mg、0.5mg至1.0mg、1.0mg至5mg、5mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、40mg至50mg、50mg至60mg、60mg至70mg、70mg至80mg、80mg至90mg、90mg至100mg、100mg至120mg、120mg至150mg、150mg至200mg、200mg至250mg、250mg至300mg、300mg至350mg、350mg至400mg、400mg至450mg、或450mg至500mg，例如，约0.003mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1.0mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、约200mg或约250mg，例如，0.003mg、0.009mg、0.027mg、0.081mg、0.24mg、0.72mg、1.08mg、1.51mg、2.2mg、2.3mg、4.0mg、4.6mg、6.6mg、8.0mg、9.2mg、12mg、13.2mg、14.8mg、18.4mg、19.8mg、26.4mg、36.8mg、51.5mg、52.8mg、61.3mg、72.1mg、105.6mg、147.8mg、176mg或207mg)的固定剂量施用。在一些实施例中，HER2TDB(例如，BTRC4017A)约每三周一次(Q3W)施用。

本文提供的方法包括单步剂量分次治疗方案。在特定情况下，单步剂量分次治疗方案包括HER2抗体(例如曲妥珠单抗)的第一剂量和随后的第一给药周期(C1)。C1包括HER2TDB(例如BTRC2017A)的第一剂量(C1D1)和HER2 TDB的第二剂量(C1D2)，其中C1D2大于C1D1(例如，C1D1的至少两倍，例如C1D1的约两倍至五倍，例如C1D1的约两倍或约三倍)。在C1之后施用第二给药周期(C2)，其中C2包括HER2抗体的第二剂量(例如，在C1的第1天)和随后的(例如，在HER2抗体的第二剂量之后约30-120分钟)HER2 TDB的附加剂量(C2D1)。在此类单步剂量分次中，C2D1可等效于C1D2。

在一些情况下，C1D1为0.003mg至50mg(例如，0.003mg至50mg、0.005mg至20mg、0.01mg至10mg、0.05mg至8mg或0.1mg至5mg，例如0.001mg至0.005mg、0.005mg至0.01mg、0.01mg至0.05mg、0.05mg至0.1mg、0.1mg至0.5mg、0.5mg至1.0mg、1.0mg至5mg、5mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、或40mg至50mg，例如约0.003mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1.0mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg或约50mg)。在一些实施例中，C1D1为0.003mg、0.009mg、0.027mg、0.081mg、0.12mg、0.24mg、0.48mg、0.72mg、1.0mg、2.0mg、2.2mg、4.0mg、6.6mg、8.0mg、12mg、18mg、27mg或40.5mg。C1D2可为0.009mg至200mg(例如，0.01mg至150mg、0.05mg至100mg、0.1mg至50mg、0.5mg至20mg、或1mg至10mg，例如，0.009mg至0.01mg、0.01mg至0.05mg、0.05mg至0.1mg、0.1mg至0.5mg、0.5mg至1.0mg、1.0mg至5mg、5mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、40mg至50mg、50mg至60mg、60mg至70mg、70mg至80mg、80mg至90mg、90mg至100mg、100mg至120mg、120mg至150mg、或150mg至200mg，例如，约0.009mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1.0mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、或约200mg)。在一些实施例中，C1D2为0.009mg、0.027mg、0.081mg、0.24mg、0.4mg、0.72mg、0.08mg、1.6mg、2.2mg、2.3mg、3.2mg、4.6mg、6.4mg、6.6mg、9.2mg、12.8mg、14.8mg、18.4mg、19.8mg、25.6mg、36.8mg、38.4、51.5mg、57.6mg、72.1mg、86.4mg、61.3mg或129.6mg。

在单步剂量分次治疗方案中，C1D1和C1D2在C1内的不同天数施用。在一些实施例中，例如，其中C1为21天，C1D1在C1第1天施用，而C1D2在C1第8天施用。

本文进一步提供了两步剂量分次治疗方案，其包括在第一给药周期(C1D3)中的第三HER2 TDB剂量。C1D3大于C1D2，C1D2大于C1D1。在一些实施例中，C1D1、C1D2和C1D3累积大于单步剂量分次、剂量递增给药方案的第一给药周期中HER2 TDB的最大清除剂量。例如，在使用单步剂量分次、剂量递增给药方案的研究中，其中最大清除剂量确定为C1中的20mg，两步剂量分次治疗方案中C1D1、C1D2和C1D3的总和可大于20mg(例如，约25mg)。在此类的两步剂量分次治疗方案中，C1D2可为C1D1剂量的两倍至十倍(例如，约两倍、约三倍、约四倍、约五倍、约六倍、约七倍、约八倍、约九倍或约十倍)。另外地或可替代地，C1D3可以是C1D2剂量的两倍至三倍。在一些情况下，C2D1等效于C1D3。

在两步剂量分次治疗方案的特定情况下，C1D1可为0.01mg至20mg(例如，0.05mg至15mg、0.1mg至10mg、或0.5mg至5mg，例如0.01mg至0.05mg、0.05mg至0.1mg、0.1mg至0.5mg、0.5mg至1.0mg、1.0mg至5mg、5mg至10mg、10mg至15mg、或15mg至20mg，例如，约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1.0mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg或约20mg)。另外地或可替代地，C1D2可以为0.1mg至100mg(例如，0.1mg至80mg、0.5mg至50mg、或1mg至10mg，例如，0.1mg至0.5mg、0.5mg至1.0mg、1.0mg至5mg、5mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、40mg至50mg、50mg至60mg、60mg至70mg、70mg至80mg、80mg至90mg、或90mg至100mg，例如，约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1.0mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg)。因此，C1D3可以为1mg至400mg的范围(例如，10mg至300mg、20mg至200mg、或50mg至100mg，例如，1.0mg至5mg、5mg至10mg、10mg至20mg、20mg至30mg、30mg至40mg、40mg至50mg、50mg至60mg、60mg至70mg、70mg至80mg、80mg至90mg、90mg至100mg、100mg至120mg、120mg至150mg、150mg至200mg、200mg至250mg、250mg至300mg、300mg至350mg、或350mg至400mg，例如，约1.0mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg或约400mg)。在一些实施例中，C1D3为1.1mg、2.2mg、4.4mg、6.6mg、8.8mg、13.2mg、17.6mg、26.4mg、35.2mg、52.8mg、70.4mg、105.6mg、147.8mg、158.4mg、176mg、207mg、237.6mg或356.4mg。

在两步剂量分次治疗方案中，C1D1、C1D2和C1D3在C1内的不同天数施用。在一些实施例中，例如，其中C1为21天，C1D1在C1第1天施用，C1D2在C1第8天施用，而C1D3在第15天施用。

在上述任何治疗方案的一些情况下，第二和任何后续给药周期的持续时间与第一给药周期相同(例如，7-42天、14-35天或21-28天，例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42天或更长时间)。在一些实施例中，C1、C2、C3和所有后续周期(例如，C4、C5、C6等)各自为约21天。HER2 TDB和HER2抗体两者均可在C1后每个周期的第1天施用。

疗法的持续时间将持续至医学上指示的一样长的时间或直至实现所需的治疗效果(例如，本文所述的那些)。在某些实施例中，治疗持续1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年或最高达受试者的寿命的数年的时间段。

对于本文所述的所有方法，一种或多种HER2抗体以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在该背景下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。一种或多种HER2抗体不是必须的，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的药剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的HER2抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。一种或多种HER2抗体可以通过一系列治疗适当地施用于患者。

另外的治疗剂

在任何目前描述的治疗患有HER2阳性癌症的受试者的方法的一些情况下，治疗方案可包括施用一种或多种另外的治疗剂。

在一种情况下，另外的治疗剂是皮质类固醇，其可在施用HER2 TDB或另外的HER2抗体之前(例如，之前约1小时)作为预处理进行施用。皮质类固醇术前用药可包括施用地塞米松或甲基强的松龙。另外地或可替代地，本文所述的治疗方案可包括施用对乙酰氨基酚、醋氨酚或苯海拉明(例如，用其预治疗)。

在一些情况下，例如如果需要管理CRS事件，则施用IL-6R拮抗剂，诸如托珠单抗在特定实施例中，根据需要，IL-6R拮抗剂(例如托珠单抗)以例如1mg/kg至25mg/kg(例如，5mg/kg至10mg/kg，例如约8mg/kg)的剂量静脉内施用。

在一些情况下，本文所述的任何治疗方案包括施用PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-L1结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂或PD-L2结合拮抗剂)。

在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂是选自MPDL3280A(阿特珠单抗)、YW243.55.S70、MDX-1105和MEDI4736(德瓦鲁单抗)以及MSB0010718C(avelumab)的抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70为PCT公开号WO 2010/077634中所述的抗PD-L1。MDX-1105也称为BMS-936559，为PCT公开号WO 2007/005874中所述的抗PD-L1抗体。MEDI4736(德瓦鲁单抗)为PCT公开号WO 2011/066389和美国专利公开号2013/034559中所述的抗PD-L1单克隆抗体。可用于本发明的方法中的抗PD-L1抗体及其制备方法描述于PCT公开号WO 2010/077634、WO2007/005874和WO 2011/066389以及美国专利号8,217,149和美国专利公开号2013/034559中，这些专利文献以引用方式并入本文。

在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是另一种抗PD-1抗体，诸如选自由MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810和BGB-108组成的组的抗PD-1抗体。MDX-1106也称为MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或纳武单抗，为PCT公开号WO2006/121168中所述的抗PD-1抗体。MK-3475也称为派姆单抗或lambrolizumab，为PCT公开号WO 2009/114335中所述的抗PD-1抗体。在其他情况下，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在其他情况下，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。AMP-224也称为B7-DCIg，为PCT公开号WO 2010/027827和WO 2011/066342中所述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。

在其他情况下，PD-L2结合拮抗剂是抗PD-L2抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗PD-L2抗体)。在一些情况下，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。

在进一步的实施例中，另外的治疗剂是进一步的化疗剂和/或抗体-药物缀合物(ADC)。在一个实施例中，HER2 TDB和/或HER2抗体与一种或多种选自环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(CHOP)的另外的化疗剂共同施用。在一个实施例中，HER2 TDB和/或HER2抗体与选自抗CD79b抗体药物缀合物(诸如US 8,088,378和/或US 2014/0030280中的任一项所述的抗CD79b-MC-vc-PAB-MMAE或抗CD79b抗体药物缀合物，或polatuzumabvedotin)的ADC共同施用。

在一些情况下，附加疗法包括烷化剂。在一种情况下，烷化剂为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸及其盐。在一种情况下，烷化剂为苯达莫司汀。

在一些情况下，附加疗法包括BCL-2抑制剂。在一个实施例中，BCL-2抑制剂是4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺及其盐。在一种情况下，BCL-2抑制剂是venetoclax(CAS#：1257044-40-8)。

在一些情况下，附加疗法包含磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。在一种情况下，PI3K抑制剂抑制δ同种型PI3K(即P110δ)。在一些情况下，PI3K抑制剂是5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮及其盐。在一些情况下，PI3K抑制剂是idelalisib(CAS#：870281-82-6)。在一种情况下，PI3K抑制剂抑制PI3K的α和δ同种型。在一些情况下，PI3K抑制剂是2-{3-[2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2-4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂-9-基]-1H-吡唑-1-基}-2-甲基丙酰胺及其盐。

在本发明的进一步方面，附加疗法包含布鲁顿(Bruton)酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一种情况下，BTK抑制剂是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮及其盐。在一种情况下，BTK抑制剂是依鲁替尼(CAS#：936563-96-1)。

在一些情况下，附加疗法包括沙利度胺或其衍生物。在一种情况下，沙利度胺或其衍生物是(RS)-3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮及其盐。在一种情况下，沙利度胺或其衍生物是lendalidomide(CAS#：191732-72-6)。

药物组合物和制剂

上述的HER2 TDB和/或HER2抗体的药物组合物和制剂通过将此类具有所需纯度的药剂与一种或多种任选的药用载体混合(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980))，制成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用的载体还包括间质药物分散剂例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，诸如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，将sHASEGP与一种或多种附加的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)联合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文的制剂还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，可以期望进一步提供另外的治疗剂(例如，化疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂，诸如上文所述的那些)。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。

活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)。

可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

III.制品

本发明进一步提供了包含可用于治疗或预防HER2阳性癌症的材料的制品。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合用于有效地治疗或预防病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有由皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的HER TDB。标记或包装插页表明该组合物用于治疗选择的HER2阳性癌症(例如，HER2阳性乳腺癌或HER2阳性胃癌)，并进一步包括与本文所述的给药方案中的至少一种相关的信息。此外，制品可包括(a)第一容器，所述第一容器中含有组合物，其中所述组合物包含HER2 TDB；以及(b)第二容器，所述第二容器中含有组合物，其中所述组合物包含另外的HER抗体(例如，多价(例如二价)HER2结合抗体，例如曲妥珠单抗)。可替代地或另外地，制品可进一步包括一种或多种附加容器，该附加容器含有：(a)另外的治疗剂；和/或(b)药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和右旋糖溶液。容器可进一步包括从商业和用户角度来看所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

IV.实例

以下是本发明的方法的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。

实例1.BTRC4017A和曲妥珠单抗共同治疗的临床前疗效

结合HER2和CD3两者的全长、IgG1 TDB、BTRC4017A是使用“杵臼”工程化生成的(参见，例如，美国专利号5,731,168)，并且具有包括4D5 HER2结合位点的抗HER2臂和包括40G5c CD3结合位点的抗CD3臂(参见，例如，WO 2015/095392)。BTRC4017A的4D5 HER2结合位点源自曲妥珠单抗并结合HER2的结构域IV中的相同表位，如图1所示。曲妥珠单抗与BTRC4017A竞争结合至HER2，并因此可干扰BTRC4017A活性。

BTRC4017A联合曲妥珠单抗(Herceptin)的体外药理学

曲妥珠单抗对BTRC4017A活性的影响使用HER2扩增的KPL4细胞系(其代表HER2阳性癌症)在体外和体内进行了测试。该联合的影响也使用HT55细胞系建模，该细胞系表达低水平的HER2，类似于正常人组织的HER2水平。HT55肿瘤用于对表达低水平HER2的正常细胞/组织的靶向活性进行建模，然而KPL4肿瘤细胞代表HER2过表达的肿瘤。MCF7是HER2 IHC0乳腺癌细胞系，作为阴性对照而包括。模型细胞系中的HER2表达水平示于图2。

为了评估曲妥珠单抗对BTRC4017A体外活性的影响，在存在230μg/mL和60μg/mL曲妥珠单抗的情况下执行了剂量应答实验。这些曲妥珠单抗浓度代表推荐剂量(每3周[Q3W]8或6mg/kg)的乳腺癌的临床最大血清浓度(C_max)和最小血清浓度(C_min)。纯化的人CD8⁺ T细胞用作效应物，以经由细胞介导的ADCC最大限度地减少曲妥珠单抗对靶细胞的杀伤。曲妥珠单抗在两种细胞系中均抑制BTRC4017A的活性(图3A和3B)，并且需要600倍至2000倍以上的BTRC4017A才能在存在曲妥珠单抗的情况下达到50％有效浓度的KPL4(图3A)杀伤。当靶向HT55细胞时，曲妥珠单抗对BTRC4017A活性的抑制作用处于相似的范围内，但在高浓度下，BTRC4017A能够在两种细胞系中克服曲妥珠单抗的抑制作用。

BTRC4017A联合曲妥珠单抗-LALAPG的体内药理学

Fc受体介导的效应子功能在曲妥珠单抗的体内活性中起主要作用，并且可干扰解决曲妥珠单抗对BTRC4017A活性的抑制作用的体内实验。因此，曲妥珠单抗的Fc区通过引入一组减弱人IgG₁效应子功能的氨基酸取代进行修饰，以产生曲妥珠单抗-LALAPG变体。LALAPG突变是L234A、L235A和P329G。由于曲妥珠单抗中的抗HER2 Fab在曲妥珠单抗-LALAPG变体中未进行修饰，因此该修饰不会改变HER2结合，如流式细胞术HER2结合测定所证实(图4)。

为了测试曲妥珠单抗/LALAPG对BTRC4017A活性的影响，使用了基于高度免疫受损的NOD scidγ(NSG)小鼠的双肿瘤小鼠模型。NSG小鼠通过腹膜内注射人外周单核细胞(PBMC)补充人T细胞。在每只小鼠中，KPL4肿瘤移植到一侧，而HT55肿瘤移植到对侧。KPL4是HER2扩增的细胞系，并且代表HER2过表达的肿瘤，然而HT55肿瘤用于对表达低水平HER2的正常细胞/组织的在靶/脱肿瘤活性建模(图2)。

如图5A所示，单剂量的BTRC4017A以≥0.05mg/kg诱导KPL4肿瘤的消退。需要10倍大剂量的BTRC4017A来诱导HT55肿瘤的消退(图5B)，表明基于HER2阳性肿瘤中HER2的高表达可增加治疗指数。

在共同治疗组中，在施用BTRC4017A前四小时施用5.0mg/kg曲妥珠单抗-LALAPG。在测试的任何BTRC4017A剂量水平下，曲妥珠单抗-LALAPG对靶向KPL4肿瘤的BTRC4017A疗效没有影响。相比之下，曲妥珠单抗-LALAPG预处理消除了HT55肿瘤中所有BTRC4017A剂量水平下的BTRC4017A活性。这些数据表明，曲妥珠单抗-LALAPG预处理对BTRC4017A活性的影响在表达不同水平HER2的肿瘤之间存在显著差异。特别是，活性在KPL4肿瘤(HER2扩增)中保留，但在HT55肿瘤(其表达HER2的水平与正常人组织相似)中消除。

这些数据表明，在BTRC4017A施用之前用曲妥珠单抗治疗可降低BTRC4017A对表达低水平HER2的正常组织的在靶/脱肿瘤毒性的风险，同时在HER2过表达的肿瘤中保持抗肿瘤活性。在体内小鼠疗效研究中，曲妥珠单抗与BTRC4017A共同施用并未削弱BTRC4017A对HER2阳性肿瘤的抗肿瘤活性，但完全消除了代表正常组织上HER2表达水平的低表达HER2肿瘤上的BTRC4017A抗肿瘤活性。不希望受理论束缚，曲妥珠单抗可以使低表达HER2的正常组织中的HER2饱和(从而阻止BTRC4017A结合)，而不能使表达更高密度HER2的肿瘤中的HER2饱和。因此，在每剂量的BTRC4017A之前共同施用曲妥珠单抗可减轻BTRC4017A在表达HER2的正常组织中的脱肿瘤/在靶毒性，同时不会显著影响BTRC4017A在患有HER2阳性肿瘤的患者中的抗肿瘤活性。以此方式，曲妥珠单抗的共同施用可增加BTRC4017A的治疗指数。

实例2.使用BTRC4017A和曲妥珠单抗治疗HER2阳性癌症的剂量分次、剂量递增给药方案

为了减轻潜在的细胞因子驱动的毒性，BTRC4017A在第1周期(C1)中以剂量分次给药方案施用，其中第一剂量小于第二剂量。在两步剂量分次给药方案中，C1中的第二剂量小于第三剂量。第2周期和任何必要的后续周期涉及单次施用BTRC4017A剂量，其等效于C1中的BTRC4017A的最大剂量。

曲妥珠单抗在C1的第-1天施用，以适当地区分可与BTRC4017A相对于曲妥珠单抗相关的任何输注相关反应(IRR)。第2周期(C2)及以后的所有后续曲妥珠单抗剂量均在周期的第1天，在BTRC4017A施用之前施用。下表4中提供了曲妥珠单抗施用程序的总结：

表4：曲妥珠单抗输注时间和观察期

C1 Day-1＝第1周期第-1天；

C1 Day1＝第1周期第1天；

C2 Day1＝第2周期第1天

BTRC4017A在第一个21天周期期间和在最高达17个周期的每个后续周期的第一天经由剂量分次给药来施用。BTRC4017A使用标准医用注射器和注射泵或静脉输液袋(如适用)通过静脉输注，通过扁平(固定)给药来施用，与体重无关。药物产品通过注射泵经由静脉输注器或静脉输液袋来输送，其中最终BTRC4017A体积由剂量确定。对于初始小剂量，BTRC4017A将仅经由外周导管来施用。具体的BTRC4017A剂量确定了适当的给药浓度、体积、输注时间，并且还决定了要使用的具体施用设备(例如，外周导管vs.注射泵vs.静脉输液袋)。

在C1的第1天开始，受试者在第1天和第8天或在第1、8和15天分别接受单步和两步剂量分次方案的BTRC4017A递增剂量。在第2周期及以后，BTRC4017A仅在每个21天周期的第1天作为单剂量给药。出于后勤/调度原因，BTRC4017A可在预定日期后最高达±2天(即，两次剂量之间最少间隔19天)给药。

由地塞米松(静脉注射20mg)或甲基强的松龙(静脉注射80mg)组成的皮质类固醇术前用药在第1周期的每个BTRC4017A剂量施用之前一小时进行施用。此外，在施用BTRC4017A之前，根据标准制度实践施用口服对乙酰氨基酚或醋氨酚(例如，500 1000mg)和/或25 50mg苯海拉明的术前用药，除非有禁忌症。托珠单抗可根据需要以8mg/kg静脉内施用于患者。

在不存在剂量限制性毒性(DLT)、不可接受的毒性或疾病进展的情况下，每21天为获得临床益处的患者提供BTRC4017A作为单一药剂或与曲妥珠单抗联合的持续治疗最高达17个周期，直到出现进展或无法耐受的毒性，以先发生者为准。

使用实体瘤应答评估标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST v1.1)来评估疾病状态。患者在筛选时、直至治疗中断的研究期间和在研究终止时接受肿瘤评估。免疫修饰的RECIST标准也用于表征与癌症免疫疗法相关的应答模式。免疫修饰的RECIST标准可补充规范的RECIST v1.1标准，以允许对患者的益处和风险进行综合评估。通常在BTRC4017A和双特异性抗体的情况下可以观察到假性进展。因此，尽管由规范的RECIST v1.1标准定义的进展性疾病的放射学证据，但仍获得临床益处的患者可以继续研究治疗。

不良事件根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准5.0版(NationalCancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events,Version 5.0)(NCI CTCAE v5.0)进行分级，但细胞因子释放综合征(CRS)除外，根据经修饰的细胞因子释放综合征分级系统(Modified Cytokine Release Syndrome Grading System)对细胞因子释放综合征进行分级(见上面的表1和表2)。

其他实施例

尽管为了清楚理解的目的先前已经通过说明和实例相当详细地描述了发明，但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司

<120> 用 HER2 T 细胞依赖性双特异性抗体治疗

<130> 50474-197WO2

<150> US 62/818,556

<151> 2019-03-14

<160> 17

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

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1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

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1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

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1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

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1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

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50 55 60

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

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1 5

<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

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1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

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1 5 10 15

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<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

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Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg

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130 135 140