阅读说明：本技术 预测食管癌对抗erbb3抗体治疗的应答的方法和试剂盒 (Methods and kits for predicting response of esophageal cancer to anti-ERBB 3 antibody therapy ) 是由 薛群 胡怀忠 王静 于 2017-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于预测食管癌对使用ERBB3抑制剂(例如抗ERBB3抗体)的治疗是敏感或抗性的方法。具体地,该方法通过测量至少一种选自SDC、PTGES、NCF2、NOXA1、CARD6、GNAZ的标志物在肿瘤样品中的RNA水平或蛋白质水平的表达进行预测。(The present invention discloses a method for predicting whether esophageal cancer is sensitive or resistant to treatment with an ERBB3 inhibitor (e.g., an anti-ERBB 3 antibody). In particular, the method predicts RNA level or protein level expression in a tumor sample by measuring the expression of at least one marker selected from SDC, PTGES, NCF2, NOXA1, CARD6, GNAZ.)

具体实施方式

通过以下实例进一步说明本发明。提供以下实例仅为了说明，不应该被解释为以任何方式限定了本发明的范围或内容。

实施例1：食管癌异种移植生长对CAN017的应答

按照以下方式评估食管癌对CAN017的应答。

将从食管癌患者手术后取得的新鲜肿瘤组织分成小的肿瘤块，接种于免疫缺陷小鼠(BALB/c裸鼠)皮下，定期观察肿瘤生长状态。待肿瘤达到一定体积后，以人道主义方式处死小鼠，并将肿瘤接种至新的BALB/c裸鼠皮下。根据肿瘤生长状态绘制生长曲线，同时收集肿瘤样品、冻存并观察肿瘤组织、然后在需要用于下一代接种时将其复苏。经过数代优化后，成功建立食管癌异种移植模型。将该模型通过皮下接种至9-11周龄的雌性BALB/c裸鼠的右侧，接种模型的直径为2-3mm。

每周两次使用游标卡尺对肿瘤进行测量。用下式对肿瘤体积进行计算：宽x宽x长/2。当肿瘤达到大约158mm³时，将这些小鼠随机分为3组，每组10只小鼠。一组接受生理盐水，一组接受hIgG对照(20mg/kg体重)，另一组接受CAN017(20mg/kg体重)。每三天给药一次，通过腹膜内注射3周。记录肿瘤体积以及小鼠体重，每周两次。肿瘤生长表示为与生理盐水对照相比的抑制百分比。

总之，使用CAN017处理20个食管癌异种移植模型(每个模型10只小鼠)，其统计结果如图12所示。CAN017对全部20个异种移植模型的平均抑制百分比为43.6％左右，而对照hIgG对全部20个异种移植模型的平均抑制百分比为-5.5％。统计学分析结果表示，与hIgG相比，CAN017对食管癌异种移植模型的抑制百分比达到显著水平(P<0.01)。这些结果表明，CAN017能有效抑制食管癌肿瘤的生长。

进一步分析单个食管癌异种移植模型对CAN017的应答，发现所述应答是变化的，其范围为-40％的肿瘤生长抑制(TGI)至肿瘤消退。“肿瘤消退”是指与在处理前、在评价期开始时肿瘤的尺寸相比，在评价期结束时，肿瘤更小。基于所达到的肿瘤生长抑制，鉴别应答者(定义为TGI>70％的那些)和非应答者(定义为TGI<70％的那些)。在所评价的20个模型中，发现9个为应答者，11个是非应答者(表1)。这些组能够鉴别CAN017应答的分子标志物。

表1.CAN017对20个食管癌异种移植模型的肿瘤生长抑制的结果及其中NRG1的平均mRNA表达水平

实施例2：生物标志物NRG1的表达水平和阈值测定

根据以下方案通过RNAseq来测定NRG1的表达水平：将肿瘤组织速冻后，用RNeasyMini Kit(Qiagen，编号74106)提取并纯化RNA，然后根据TruSeq^TM RNA SamplePreparation Guide(Illumina，编号RS-930-2001)对纯化后的RNA进行预处理，之后根据制造商的说明在HiSeq X System(Illumina)上进行测序，所得数据用FPKM进行标准化(以log2(FPKM+1)值表示)，获得NRG1的表达水平。

在用CAN017处理之前测定20个食管癌异种移植模型(平均每个模型10只小鼠)中的NRG1表达水平值，每个模型的平均NRG1表达水平如表1所示。根据所得的NRG1表达水平值生成受试者工作特征(ROC)曲线，并测定用于预测CAN017肿瘤应答的NRG1的阈值表达水平。ROC分析结果表明，NRG1的阈值表达水平为2.05。即，高于该阈值表达水平则预测CAN017的肿瘤应答。实际上，NRG1的表达水平在测试的大多数异种移植模型中与CAN017的应答结果一致(即，等于或高于阈值表达水平2.05表示对CAN017产生应答；低于阈值表达水平2.05表示对CAN017不产生应答)。但在食管癌异种移植模型ES0026、ES2356和ES0215中，虽然NRG1的表达水平均高于阈值表达水平，但这三个异种移植模型实际上对CAN017不应答。由此可见，尽管NRG1作为生物标志物可以在一定程度上预测食管癌是否对使用ERBB3抗体的处理产生应答，但单独使用NRG1进行预测的有效性是有限的。

实施例3：本发明的生物标志物的表达水平与CAN017应答之间的关系

根据实施例2所述的RNAseq方法，分别测定20个食管癌异种移植模型(平均每个模型10只小鼠)中SDC2、GNAZ、PTGES、NCF2、NOX1和CARD6的表达水平，并通过ROC曲线测定各生物标志物的阈值表达水平。各生物标志物的阈值表达水平结果如下：SDC2的阈值表达水平为4.9，GNAZ的阈值表达水平为1.1，PTGES的阈值表达水平为2.75，NCF2的阈值表达水平为2.6，NOX1的阈值表达水平为2.7，CARD6的阈值表达水平为1.0。

根据各模型中各生物标志物的平均表达水平来绘制在这些模型中的CAN017肿瘤生长抑制，并通过回归分析检测各生物标志物的表达水平与肿瘤生长抑制之间的相关性的显著性。结果如图13-18所示。

具体地，如图13所示，在肿瘤生长抑制和SDC2表达之间观察到负相关。更具体而言，在使用CAN017处理后肿瘤生长抑制的增加与SDC2表达的降低相关。回归分析发现这种相关具有高度的统计学意义(显著性F<0.05)。图14表明，肿瘤生长抑制和GNAZ表达之间呈现负相关，即肿瘤生长抑制随GNAZ表达水平的增高而降低，并且这种相关性在统计学上也是显著的(显著性F<0.05)。

图15-18则分别表明，肿瘤生长抑制和NCF2、NOXA1、PTGES、CARD6表达之间均呈现正相关，即肿瘤生长抑制随这些生物标志物表达水平的增高而增高，并且这种相关性在统计学上也是显著的(显著性F<0.05)。

以上结果表明，本发明的生物标志物SDC2、GNAZ、PTGES、NCF2、NOX1和CARD6中每一个的表达水平与肿瘤生长抑制均显著相关。因此，这些生物标志物均可以用于预测肿瘤对CAN017处理是否应答。

实施例4：食管癌异种移植模型对抗ERBB3的抗体CAN017的应答

根据实施例3中所得的各生物标志物的阈值表达水平，选择预测会对CAN017产生应答的异种移植模型，同时选择预测对CAN017不产生应答的异种移植模型。具体地，对于阈值表达水平为4.9的SDC2，选择高表达的异种移植模型ES0195和ES0204(SDC2表达水平分别为5.8和5.2)，并预测所述模型对CAN017不产生应答；同时选择低表达的异种移植模型ES0042和ES0190(SDC2表达水平分别为0.6和4.3)，并预测所述模型对CAN017产生应答。类似地，对于阈值表达水平为1.1的GNAZ，选择高表达的异种移植模型ES0201和ES2411(GNAZ表达水平分别为1.3和1.9)，并预测所述模型对CAN017不产生应答；同时选择低表达的异种移植模型ES0184和ES0199(GNAZ表达水平分别为0.2和0.5)，并预测所述模型对CAN017产生应答。对于阈值表达水平为2.6的NCF2，选择高表达的异种移植模型ES0191和ES0176(NCF2表达水平分别为5.1和3.2)，并预测所述模型对CAN017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型ES0204和ES0026(NCF2表达水平分别为0.1和0.9)，并预测所述模型对CAN017不产生应答。对于阈值表达水平为2.7的NOXA1，选择高表达的异种移植模型ES2311和ES0214(NOXA1表达水平分别为2.98和3.9)，并预测所述模型对CAN017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型ES11087和ES0148(NOXA1表达水平分别为2.14和1.6)，并预测所述模型对CAN017不产生应答。对于阈值表达水平为2.75的PTGES，选择高表达的异种移植模型ES0159和ES0141(PTGES表达水平分别为5.69和3.9)，并预测所述模型对CAN017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型ES10084和ES0172(PTGES表达水平分别为0.55和1.7)，并预测所述模型对CAN017不产生应答。对于阈值表达水平为1.0的CARD6，选择高表达的异种移植模型ES11069和ES0147(CARD6表达水平分别为4.01和1.1)，并预测所述模型对CAN017产生应答；同时选择低表达的异种移植模型ES0212和ES0136(CARD6表达水平分别为0.09和0.1)，并预测所述模型对CAN017不产生应答。

按照实施例1所述的方法，用20mg/kg抗体CAN017处理上述选择的异种移植模型(每个模型5只小鼠)，在3周后统计各模型的肿瘤生长抑制情况，结果如表3所示。

表3.使用抗体CAN017处理的异种移植模型的结果统计。

以上数据表明，可以通过测量SDC2、GNAZ、PTGES、NCF2、NOX1和CARD6的表达水平来有效预测肿瘤对使用CAN017的处理的应答。

实施例5：本发明的生物标志物与NRG1的组合使用

本发明人还发现，将本发明的生物标志物和NRG1组合使用将能够进一步提高预测肿瘤对CAN017处理是否应答的准确性。如上所述，单独的NRG1作为标志物不能准确预测食管癌异种移植模型ES0026、ES2356和ES0215的应答(即，虽然NRG1的表达水平高于阈值，但用CAN017处理后却不应答(TGI<70％))。本发明人测定了这三个模型中本发明的生物标志物的表达水平，结果如下表4所示。

表4.异种移植模型ES0026、ES2356和ES0215中生物标志物的表达水平。

模型编号	SDC2	GNAZ	NCF2	NOXA1	PTGES	CARD6
							ES0026	6.1	1.7	0.9	1.9	2.3	0.8
ES2356	7.7	1.4	2.4	1.8	3.1	3.3
							ES0215	8.1	2.4	2.5	0.4	1.8	2.1

以上数据显示，这三个模型中，SDC2和GNAZ的表达水平均高于其相应的阈值表达水平，NCF2和NOXA1的表达水平均低于其相应的阈值表达水平，表明当用这些生物标志物来预测时，异种移植模型ES0026、ES2356和ES0215将被预测为对CAN017处理不产生应答。换言之，当NRG1高于其阈值表达水平时，测量本发明的生物标志物的表达水平可以进一步提高预测肿瘤对CAN017处理是否应答的准确性(例如，在异种移植模型ES0026、ES2356和ES0215的情况下，考虑本发明的生物标志物可以准确地预测其对CAN017处理不产生应答)。

本发明人还发现，当同时使用至少一个与TGI正相关的生物标志物和一个与TGI负相关的生物标志物时，预测准确率将进一步提高。在20个食管癌异种移植模型中，单独用NRG1作为标志物预测的准确率为85％，单独用GNAZ作为标志物预测的准确率为90％。但同时使用NRG1和GNAZ作为标志物进行预测，准确率达到95％(图19)。

实施例6：食管癌异种移植模型对抗ERBB3的抗体11G01的应答

为了证实对其他抗ERBB3抗体的应答的预测方法，使用作用机制不同于CAN017的抗ERBB3抗体(抗体11G01)处理实施例4中所选择的12个食管癌异种移植模型。具体地，使用20mg/kg抗体11G01按照实施例1所述的方式处理选择的12个食管癌异种移植模型，并在3周后统计各模型的肿瘤生长抑制百分比，结果与实施例4类似(即根据各生物标志物预测的肿瘤对抗体的应答情况与实际观察到的肿瘤对抗体的应答情况一致，数据未显示)。这表明本发明的生物标志物可以有效预测食管癌对使用作用机制不同于CAN017的其他抗ERBB3抗体的处理的应答。

通过引用进行结合

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等效物

可以用其他的具体形式实施本发明而不背离本发明的精神或本质特征。因此，上述的实施方案必须被认为在所有方面是用作说明的而不是对在此所说明的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书而不是通过上述的说明来指明的，并且在该权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化均旨在涵盖于其中。